大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)原理及步驟

1、實(shí)驗(yàn)五 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化一、實(shí)驗(yàn)原理 體外連接的重組DNA分子導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞中才能大量的進(jìn)行復(fù)制、增殖和表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，用含Ca2+ 的溶液處理大腸桿菌細(xì)胞會(huì)易于吸收外源DNA。大腸桿菌吸收外源DNA的過程被稱為轉(zhuǎn)化。細(xì)菌處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)稱為感受態(tài)。用理化方法可以誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入感受態(tài)，如電轉(zhuǎn)化法、CaCL2法。CaCL2法是目前實(shí)驗(yàn)室常用的制備感受態(tài)細(xì)胞的方法，其原理是使細(xì)菌處于0C 、CaCl2低滲溶液中，細(xì)胞膨脹成球形，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生改變，外源DNA附著于細(xì)胞膜表面，經(jīng)42C短時(shí)間熱沖擊處理，促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物。宿主細(xì)胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，

2、即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變株，而質(zhì)粒載體攜帶有某一抗生素抗性基因，如抗氨卞青霉素的基因（AP）。若將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞涂布與于含氨卞青霉素的平板上，則只有那些含有被轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的細(xì)胞才能生存并生長增殖。從而可以篩選出哪個(gè)克隆含有質(zhì)粒。本實(shí)驗(yàn)以E.coli JM109菌株為受體細(xì)胞，用CaCl2處理受體菌使其處于感受態(tài)，然后與pUC18質(zhì)粒共保溫實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化。將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的全部受體細(xì)胞進(jìn)行適當(dāng)稀釋，在含有氨卞青霉素的平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，只有轉(zhuǎn)化體才能存活，而未有轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞則因無抵抗氨卞青霉素的能力而死亡。轉(zhuǎn)化子經(jīng)過擴(kuò)增后，可將轉(zhuǎn)入的質(zhì)粒DNA分離提取出來，用于電泳分析、限制性內(nèi)切酶圖譜的制作以及DNA

3、測序等實(shí)驗(yàn)。二、儀器及試劑1. 儀器：恒溫?fù)u床、電熱恒溫培養(yǎng)箱、電熱恒溫水浴鍋、超凈工作臺(tái)、分光光度計(jì)、高速冷凍離心機(jī)、臺(tái)式離心機(jī)。2. 材料E.coli JM109受體菌、質(zhì)粒pUC18。3. 試劑：LB培養(yǎng)液（1L）：胰蛋白胨 10g酵母粉 5gNaCl 10g（高鹽）或5g（低鹽）氨芐青霉素（Ampicillin） 100mg/ml在三角瓶中將胰蛋白胨 10g，酵母粉 5g以及 NaCl 5g溶于1L的重蒸水中并高壓滅菌。待冷卻至55，向溶液中加入1.5ml 100mg/ml 的氨芐青霉素。然后貯存于4備用。LB平板培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10g酵母粉 5gNaCl 10g或5g ，瓊脂 13

4、g 在三角瓶中依次將上述配方加入1L的重蒸水中并高壓滅菌。待培養(yǎng)基降溫至50，取出培養(yǎng)基并輕輕旋轉(zhuǎn)以使溶解的瓊脂均勻分布于整個(gè)培養(yǎng)基溶液中，根據(jù)需要加入氨芐青霉素，然后可直接從三角瓶中倒出培養(yǎng)基鋪制平板。90mm直徑的培養(yǎng)皿約需3050ml培養(yǎng)基。培養(yǎng)基完全凝結(jié)后，倒置平皿并貯存于4備用。 其它試劑： 0.1M CaCl2溶液、滅菌蒸餾水 三、操作步驟 1. 感受態(tài)細(xì)菌的制備： （1）用接種環(huán)從E.coli JM109菌平板上挑取一單克隆菌落，接種于裝有5ml LB液體培養(yǎng)基的試管中中，37 220 rpm振蕩培養(yǎng)過夜（1216h）。 （2）取0.5 ml過夜菌液接種到裝有50ml LB液體培

5、養(yǎng)基三角瓶中中，37，220 rpm振蕩培養(yǎng)23h，隔2030min測量OD600值，至OD600值為0.3-0.4。無菌條件下將細(xì)菌轉(zhuǎn)至1.5ml 離心管中，每管1ml菌液，按需要決定管數(shù)。 （3） 4，12000 rpm，離心2 min，以回收細(xì)菌。 （4）倒凈上清液，倒置離心管于濾紙上1min，使殘留的痕量培養(yǎng)液流盡。每管加1ml冰預(yù)冷的0.1mol/L CaCl2懸浮細(xì)胞，冰浴30 min 。 （5）4，12000 rpm，2 min。 （6）倒凈上清液，倒置離心管1min，使殘留液流盡。每管加100 ul冰預(yù)冷的0.1 mol/L CaCl2重新懸浮細(xì)胞（重懸時(shí)操作要輕），即成感受態(tài)

6、細(xì)胞懸浮液。 2.細(xì)菌轉(zhuǎn)化： （1）取3只滅菌的Ep管，分別編號1、2、3、分別加入以下各組分：加入1020ng質(zhì)粒DNA（體積小于10ul），同時(shí)做兩個(gè)對照組： 1號：受體菌對照組： 100ul感受態(tài)細(xì)胞懸浮液+2ul無菌ddH2O 2號：質(zhì)粒DNA對照組：100ul 0.1mol/L CaCl2+2ul pUC19 3號：正常轉(zhuǎn)化組：100ul感受態(tài)細(xì)胞懸浮液+2ul pUC19 （2）輕輕旋轉(zhuǎn)離心管以混勻內(nèi)容物，冰浴30min，促進(jìn)DNA分子在感受態(tài)細(xì)胞表面的吸附。（3）轉(zhuǎn)入42水浴2min，通過熱刺激增強(qiáng)CaCL2的作用，使細(xì)胞膜產(chǎn)生通道，便于DNA分子的吸附進(jìn)入，提高轉(zhuǎn)化率。（4）迅

7、速轉(zhuǎn)入冰上冷卻2min，修復(fù)細(xì)胞膜。（5）加600u無抗生素lLB液體培養(yǎng)基，搖勻后于37，220 rpm，振蕩60min。使受體菌恢復(fù)正常生長狀態(tài)，并且表達(dá)Ampicillin抗性基因。（6）取200ul菌液涂在含Ampicillin的LB平板，將平板置于無菌臺(tái)直至液體被吸收，37恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)1216h后觀察結(jié)果，其余保存于4。如果平板上沒有長出菌落，可將之置于37恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，同時(shí)將剩下的500ul菌液離心，倒掉大部分上清，留100ul左右，用移液器吹打重懸，再全部涂于含Ampicillin的LB平板上，置37培養(yǎng)。（7）觀察并記錄轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)的數(shù)目，計(jì)算轉(zhuǎn)化率。 四、注意事項(xiàng)： 1. 實(shí)驗(yàn)中所用的器皿均要滅菌，以防止雜菌和外源DNA