藥監(jiān)系統(tǒng)官方培訓(xùn)課件4 余斐 基因擴(kuò)增檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的規(guī)范化建設(shè)20210412

1、臨床基因擴(kuò)增檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的規(guī)范化建設(shè)的實(shí)踐浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院余 斐2021-4-17提綱1. 實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)、需求清單、示例2. 規(guī)范化管理要點(diǎn)、示例一 實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)、需求清單、示例設(shè)計(jì)原則醫(yī)療機(jī)構(gòu)新型冠狀病毒核酸檢測(cè)工作手冊(cè)（試行第二版）醫(yī)學(xué)生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室建筑技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)2020病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全通用準(zhǔn)則WS233-2017實(shí)驗(yàn)室分區(qū)（物理隔離）測(cè) 序擴(kuò)增文庫(kù)分析文庫(kù)制備mNGS標(biāo)本處理新冠標(biāo)本處理試劑準(zhǔn)備乙肝標(biāo)本處理報(bào)告分析清潔區(qū)醫(yī)務(wù)人員通道 更衣/淋浴污物處理和污物出口污物通道工作區(qū)P2工作區(qū)（改成PCR室）標(biāo)本入口新風(fēng)系統(tǒng)獨(dú)立的新風(fēng)系統(tǒng)和空調(diào)系統(tǒng)總控室（減少人員反復(fù)進(jìn)出）監(jiān)控系統(tǒng)

2、空調(diào)總控照明總控紫外燈控制新風(fēng)總控、氣壓、溫濕度監(jiān)控墻上電話交聯(lián)門和傳遞窗傳遞窗（4個(gè)）自動(dòng)關(guān)閉的移門子母門/可視窗交聯(lián)門專用UPS380V輸入，8KW，30min配電箱、自控柜、交換機(jī)照明、插座配電箱總輸入配電箱電話交換機(jī)、網(wǎng)絡(luò)交換機(jī)交聯(lián)門、各類傳感器自控柜空調(diào)、新風(fēng)排風(fēng)配電箱物品獨(dú)立（減少污染）各區(qū)專用工作服室內(nèi)提示和警示標(biāo)示室內(nèi)提示和警示標(biāo)示室內(nèi)提示和警示標(biāo)示實(shí)驗(yàn)室外立面實(shí)驗(yàn)室外立面專用走廊緩沖區(qū)試劑準(zhǔn)備室緩沖區(qū)標(biāo)本處理室標(biāo)本處理室標(biāo)本處理室緩沖區(qū)文庫(kù)制備室緩沖區(qū)基因擴(kuò)增室總控室之江院區(qū)之江院區(qū)余杭院區(qū)PCR實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)需求清單11. 弱電（網(wǎng)孔數(shù)量和分布、門禁）12. 電話（墻上電話、同

3、時(shí)呼叫、內(nèi)線、交換機(jī)、1. 場(chǎng)地和環(huán)境評(píng)估（層高、承重、污水污物、周邊）2. 實(shí)驗(yàn)室分區(qū)（依據(jù)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目和安全需求，各區(qū)面積、緩沖區(qū)）3. 新風(fēng)系統(tǒng)（機(jī)組場(chǎng)地、恒濕、高效過(guò)濾，上送下排，排風(fēng)口/送風(fēng)口位置、壓力表安裝方式、溫濕度和壓力參數(shù)、空調(diào)位置、空調(diào)總控、中央控制系統(tǒng)、顯示方式、自動(dòng)/手調(diào)、排風(fēng)送風(fēng)連鎖、防外溢、噪聲）13. 對(duì)講系統(tǒng)（雙向呼叫、可視、各區(qū)呼叫、交換機(jī)）14. 紫外燈（高度、盞數(shù)、瓦數(shù)、定時(shí)控制器）15. 溫、濕度相關(guān)設(shè)備（溫濕度計(jì)、傳感器、安裝位置、顯示方式）4. 生物安全柜（雙人A2/B2，聯(lián)動(dòng)新風(fēng) 、 安裝位置） 16. 監(jiān)控系統(tǒng)（位置和顯示方式）17. 噴淋、煙感、

4、排煙口、洗眼5. 玻璃隔斷和窗戶（高度寬度和位置，安裝方式、設(shè)器、應(yīng)急燈等 （位置、安裝方式、密封、防倒流）18. 實(shí)驗(yàn)臺(tái)柜（材質(zhì)、位置、安裝方式、無(wú)衛(wèi)生死角、工位、無(wú)臺(tái)柜處放置設(shè)備如冰箱、超低溫冰箱、垃圾桶寬度、不擋風(fēng)口、吊柜）19. 提示和警示標(biāo)示（安全需求、標(biāo)準(zhǔn)化、可視化）20. 竣工驗(yàn)收（調(diào)試參數(shù)、先生物安備不阻擋可視窗、窗戶可開or封閉）6. 墻面、天花板、地面（材質(zhì)、顏色、安裝方式）7. 門（可視窗、開門方向、 子母門、互鎖or閉門器）8. 水槽（位置、感應(yīng)龍頭、溫水、純水、排污防倒流）9. 傳遞窗（大小、位置和方式、污物傳遞、電子or機(jī)械）10. 強(qiáng)電（總?cè)萘?、UPS、插座參數(shù)、

5、數(shù)量和分布、設(shè)備帶、配電箱位置和安裝方式、照明總控/雙開、照度）全柜再實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)、氣流無(wú)逆轉(zhuǎn)）醫(yī)學(xué)生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室建筑技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)2020病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全通用準(zhǔn)則WS233-2017二 規(guī)范化管理要點(diǎn)、示例要點(diǎn)1. 可操作的SOP（質(zhì)量手冊(cè)、程序文件、安全操作、項(xiàng)目和儀器SOP、工作日志和其他記錄）2. 人員培訓(xùn)和能力評(píng)估（內(nèi)部/外部培訓(xùn)、上崗證、授權(quán)書、實(shí)習(xí)生培訓(xùn)各類記錄）3. 設(shè)備檔案和日常維護(hù)（設(shè)備清單/檔案，校準(zhǔn)和檢定報(bào)告、標(biāo)簽、儀器比對(duì)）4. 檢測(cè)系統(tǒng)的性能驗(yàn)證（指標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)品、核酸提取、標(biāo)本類型）5. 試劑和耗材的管理（批次、運(yùn)次、留樣再測(cè)，耗材質(zhì)檢）6. 質(zhì)量控制（樣本采集、

6、提取質(zhì)控、質(zhì)控規(guī)則、PT和院間比對(duì)）7. 臨床溝通（DMT、線上溝通，更新知識(shí)）8. 安全管理（設(shè)備、標(biāo)識(shí)、流程、演練、標(biāo)本庫(kù)）1.可操作的SOP文件構(gòu)成質(zhì)量手冊(cè)和程序文件項(xiàng)目/設(shè)備SOP目錄SOP參考資料 臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理辦法 醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作導(dǎo)則 醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)醫(yī)療廢物管理辦法 醫(yī)療機(jī)構(gòu)新型冠狀病毒核酸檢測(cè)工作手冊(cè) CNAS-CL02：2012醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則 CNAS-CL36：2012醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在分子診斷領(lǐng)域的應(yīng)用說(shuō) CAP_CHG_COM：All Common Checklist CAP_CHG_GEN：Laboratory G

7、eneral Checklist CAP_CHG_MIC ：Microbiology Checklist /MOLECULAR MICROBIOLOGY CAP_CHG_MOL ：Molecular Pathology Checklist 李金明_個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測(cè)質(zhì)量保證指南 測(cè)序技術(shù)的個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測(cè)應(yīng)用技術(shù)指南(試行) 李金明. 實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù), 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2007 湯一葦. 微生物分子診斷學(xué),北京: 科學(xué)出版社, 2013工作日志工作日志圖文并茂的操作流程圖樣本采集過(guò)程、實(shí)驗(yàn)室進(jìn)入流程、清潔維護(hù)流程、移液器使用、各類安全設(shè)備使用規(guī)范、核酸提取標(biāo)準(zhǔn)流程、體系配制流程2.人員

8、培訓(xùn)和能力評(píng)估內(nèi)部培訓(xùn)員工檔案（學(xué)歷、職稱證書、 科室每周四的培訓(xùn)學(xué)分證、上崗證、內(nèi)部培訓(xùn)、初始考核、授權(quán)書、崗位職責(zé)、年度考核記錄、論文獎(jiǎng)勵(lì)等業(yè)績(jī)）組內(nèi)每月/每周培訓(xùn)新員工培訓(xùn)新員工培訓(xùn)清單新員工操作考核（半年兩次）崗位授權(quán)外部培訓(xùn)員工上崗證生物安全培訓(xùn)臨檢中心核酸擴(kuò)增相關(guān)學(xué)習(xí)班、內(nèi)審員培訓(xùn)、CAP培訓(xùn)、GCP培訓(xùn)等能力評(píng)估七 能力評(píng)估項(xiàng)目包含的6個(gè)要素：a) 直接觀察進(jìn)行臨床標(biāo)本檢測(cè)的表現(xiàn)b) 監(jiān)測(cè)檢測(cè)結(jié)果的記錄和報(bào)告c) 審查中間測(cè)試結(jié)果或工作記錄、室內(nèi)質(zhì)量控制記錄、室間質(zhì)評(píng)結(jié)果、維護(hù)保養(yǎng)記錄d) 直接觀察儀器維護(hù)和功能檢查的執(zhí)行e) 通過(guò)測(cè)試已分析過(guò)的樣本、內(nèi)部盲樣或外部質(zhì)評(píng)樣本來(lái)評(píng)定

9、測(cè)試表現(xiàn)f)解決問(wèn)題技能的評(píng)估能力評(píng)估年度考核匯總操作考核/理論考核留樣再測(cè)/人員比對(duì)實(shí)習(xí)生、進(jìn)修生的培訓(xùn)和考核實(shí)習(xí)生培訓(xùn)、考核條目及成績(jī)每周五小講課、課后作業(yè)討論參考圖書、電子圖書、課件實(shí)踐中的體會(huì)1. 人員是決定因素，發(fā)動(dòng)所有人員參與質(zhì)量改進(jìn)活動(dòng)至關(guān)重要2. 人員素養(yǎng)的提高需要培訓(xùn)、鍛煉和監(jiān)督3.設(shè)備檔案和日常維護(hù)設(shè)備清單、設(shè)備檔案設(shè)備檔案（參數(shù)、環(huán)境條件、日常維護(hù)要求；附說(shuō)明書、安裝報(bào)告、校準(zhǔn)報(bào)告、檢定報(bào)告，維修報(bào)告、大的維修后的驗(yàn)證報(bào)告等）設(shè)備清單、設(shè)備檔案設(shè)備校準(zhǔn)SOP大的維修后的留樣再測(cè)設(shè)備校準(zhǔn)和檢定設(shè)備檢定和校準(zhǔn)需要相應(yīng)的規(guī)范，即要求和標(biāo)準(zhǔn)生物安全柜和超凈臺(tái)定期第三方檢定設(shè)備校準(zhǔn)

10、和檢定儀器比對(duì)核酸提取手工法和儀器法的比較PCR儀器的比對(duì)（每年至少一次或大的維修后）實(shí)踐中的問(wèn)題 校準(zhǔn)和檢定的區(qū)別？設(shè)備SOP 頻率確定方式？ 校準(zhǔn)和檢定的指標(biāo)？ PCR儀比對(duì)和留樣再測(cè)選擇哪些項(xiàng)目？4.檢測(cè)系統(tǒng)的性能驗(yàn)證性能驗(yàn)證SOP FZ-SOP-009分子診斷室檢測(cè)系統(tǒng)的性能驗(yàn)證和確認(rèn)性能驗(yàn)證SOP. FZ-SOP-009分子診斷室檢測(cè)系統(tǒng)的性能驗(yàn)證和確認(rèn)實(shí)踐中的問(wèn)題 檢測(cè)系統(tǒng) 性能驗(yàn)證的樣本來(lái)源、樣本處理方式 在項(xiàng)目SOP中聲明性能特征 在項(xiàng)目執(zhí)行過(guò)程中不斷總結(jié)，如臨床有效性、局限性，進(jìn)一步完善性能驗(yàn)證報(bào)告5.試劑和耗材的管理試劑運(yùn)次驗(yàn)證耗材質(zhì)檢試劑質(zhì)檢和保存不同試劑隔開，不能批次或

11、有效期的隔開試劑接收和留樣再測(cè)拆開的試劑單獨(dú)保存，陽(yáng)性質(zhì)控品移至標(biāo)本處理室驗(yàn)證（收貨單、驗(yàn)收外觀質(zhì)檢記錄，留樣再測(cè)記錄、原始檢測(cè)記錄）六.質(zhì)量控制分析前質(zhì)量控制（采樣手冊(cè)或SOP）1. 評(píng)估標(biāo)本類型、采樣耗材、采樣方式對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響2. 臨床溝通非常重要，可制作可視化的操作卡或采樣手冊(cè)，讓臨床醫(yī)生隨時(shí)隨地可獲取采集方法口咽拭子：兩側(cè)咽扁桃體稍微用力來(lái)回擦拭至少3次，然后再在咽后壁上下擦拭至少3次鼻咽拭子：沿下鼻道的底部向后緩緩深入，由于鼻道呈弧形，待拭子頂端到達(dá)鼻咽腔后壁時(shí)，輕輕旋轉(zhuǎn)一周可將鼻咽、口咽拭子收集于同一采樣管中，提高檢出率深咳痰液：收集患者深咳后痰液，如果患者無(wú)痰，可以深咳3-5

12、次立即采集唾液多次采樣鼻咽拭子和口咽拭子的應(yīng)用場(chǎng)景拭子和采樣管（采集系統(tǒng)） 采樣拭子：使用頭部為聚酯纖維的病毒采樣拭子（鼻及口咽型）纏繞拭子或植絨拭子，塑料柄，不推薦棉拭子、藻酸鈣拭子或木棒拭子 采樣管：推薦含病毒保存液13ml的標(biāo)準(zhǔn)采樣管 分為滅活非滅活的產(chǎn)品 非滅活的產(chǎn)品主要為hanks緩沖液，也有些產(chǎn)品是細(xì)胞保存液，含有蛋白穩(wěn)定劑 、常溫穩(wěn)定型抗生素等； 滅活的基本是 胍鹽滅活，滅活物質(zhì)濃度不適合會(huì)影響到核酸提取效率，也會(huì)影響一些檢測(cè)試劑導(dǎo)致假陰性，使用前需要評(píng)估拭子吸附更多生物樣本、較高的釋放率植絨拭子纏繞拭子痰液標(biāo)本液化 217份痰液標(biāo)本分別用生理鹽水、二硫蘇糖醇（DTT）和蛋白酶K

13、進(jìn)行前處理，液化后痰液均能由黏稠狀轉(zhuǎn)變?yōu)檩^稀薄的均質(zhì)液體，陽(yáng)性率比生理鹽水法的提高5.5%-6.9%。 49份均陽(yáng)性的標(biāo)本中CT值均值分別為28.70、25.76和24.95。室內(nèi)質(zhì)控每批上樣檢測(cè)應(yīng)當(dāng)設(shè)置弱陽(yáng)性質(zhì)控樣本（不建議用質(zhì)粒，尤其是高濃度質(zhì)粒）和陰性質(zhì)控樣本。質(zhì)控樣本隨機(jī)放在臨床樣本中間，參與提取可在陽(yáng)性標(biāo)本中加入5倍體積Trizol滅活，然后用多個(gè)陰性標(biāo)本稀釋至32-35，混勻分裝凍存待用實(shí)驗(yàn)室污染 FZ-SOP-004分子診斷室實(shí)驗(yàn)室設(shè)置和日?；静僮鲗?shí)驗(yàn)室污染防止污染重在預(yù)防 FZ-SOP-004分子診斷室實(shí)驗(yàn)室設(shè)置和日?；静僮鱌CR擴(kuò)增產(chǎn)物污染PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染：最主要最常見(jiàn)

14、的污染，因?yàn)镻CR產(chǎn)物拷貝量大，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR檢測(cè)數(shù)個(gè)拷貝的極限，所以極微量的PCR產(chǎn)物污染，就可造成假陽(yáng)就可形成假陽(yáng)性。PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染；在空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠，在操作時(shí)比較劇烈地?fù)u動(dòng)反應(yīng)管，開蓋時(shí)、吸樣時(shí)及污染進(jìn)樣槍的反復(fù)吸樣、PCR反應(yīng)管爆管等都可形成氣溶膠而污染據(jù)計(jì)算一個(gè)氣溶膠顆?？珊?8000拷貝，因而由其造成的污染是一個(gè)值得特別重視的問(wèn)題污染的預(yù)防對(duì)工作區(qū)的嚴(yán)格劃分（物理隔離）、氣流隔離、設(shè)備和物品獨(dú)立，嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室設(shè)置和管理，注意操作細(xì)節(jié)人員和樣本須按照試劑準(zhǔn)備標(biāo)本處理擴(kuò)增 單一流向合格的一次性耗材、分區(qū)使用試劑在超凈臺(tái)或生物安全柜里配制和分裝如在擴(kuò)增

15、反應(yīng)中用dUTP取代部分dTTP，使得產(chǎn)生的特異擴(kuò)增片段含有尿嘧啶，反應(yīng)混合液中加入尿嘧啶糖苷酶（UNG），可破壞來(lái)自以前測(cè)定的擴(kuò)增產(chǎn)物，從而避免其對(duì)以后要進(jìn)行的擴(kuò)增測(cè)定的污染污染的預(yù)防發(fā)現(xiàn)污染手套，加樣槍，吸頭等，及時(shí)更換手套，耗材等陽(yáng)性質(zhì)控品開啟時(shí)要?jiǎng)幼鬏p柔，瞬離后開啟；蓋緊反應(yīng)管；預(yù)防爆管可重復(fù)使用樣品架、傳送盒和運(yùn)輸架等物品，如果需要逆向時(shí)，應(yīng)先用0.2%的次氯酸溶液浸泡至少30min，再清水洗凈后晾干傳遞通風(fēng)、日常地面臺(tái)面清潔、含氯消毒液清潔、DNA酶溶液，持續(xù)的長(zhǎng)波紫外燈照射污染的監(jiān)測(cè)規(guī)范的質(zhì)控措施，三陰一弱陽(yáng)隨機(jī)放置，其中兩份是生理鹽水，用于監(jiān)控內(nèi)參的污染可將一個(gè)或多個(gè)打開的含生

16、理鹽水的EP管靜置于疑似污染區(qū)3060min，然后進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)擦試試驗(yàn)：用DEPC水浸泡過(guò)的拭子分別擦拭可疑污染源，擦拭的部位包括生物安全柜、PCR儀加熱板、試管架、移液器、離心機(jī)、地面、冰箱門把手或?qū)嶒?yàn)臺(tái)面等等，然后將拭子浸泡、震蕩后取水進(jìn)行PCR檢測(cè)，檢測(cè)項(xiàng)目一般為實(shí)驗(yàn)室陽(yáng)性率相對(duì)較高的項(xiàng)目，或者所有項(xiàng)目。實(shí)驗(yàn)室有疑似污染時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室污染/假陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)室被污染，同一批核酸樣本兩種試劑檢測(cè) B試劑A試劑能力驗(yàn)證和院際比對(duì)院際比對(duì)各項(xiàng)目室間比對(duì)方式室間比對(duì)總結(jié)留樣再測(cè)不合格PT總結(jié)和培訓(xùn)年度總結(jié)實(shí)踐中的問(wèn)題1. 參與提取的內(nèi)對(duì)照能否作為提取質(zhì)控？2. 定性項(xiàng)目（CT值）可否采用定量項(xiàng)目的質(zhì)控規(guī)則

17、？3. 部分項(xiàng)目缺乏真正的提取質(zhì)控？也沒(méi)有商品化的質(zhì)控品？七.臨床溝通重視臨床溝通 建立多種可及的臨床溝通渠道，全員參與，科學(xué)溝通，主動(dòng)走向臨床和患者，注重和臨床的結(jié)合，更新知識(shí)，重視總結(jié) 感染科標(biāo)本采集和結(jié)果解讀培訓(xùn) 泌尿外科泌尿感染項(xiàng)目標(biāo)本采集和結(jié)果解讀培訓(xùn) 神經(jīng)內(nèi)科1例腦部感染患者的多學(xué)科會(huì)診 兒科標(biāo)本采集規(guī)范培訓(xùn) 婦科泌尿感染項(xiàng)目標(biāo)本采集培訓(xùn)采樣操作卡DMT活動(dòng)臨床溝通病原檢測(cè)臨床溝通群1. 發(fā)布發(fā)熱呼吸道癥候群相關(guān)病原的檢出情況，以便臨床醫(yī)生開單2. 重癥感染患者病原體檢測(cè)溝通3. 禽流感病毒、新布尼亞病毒等少見(jiàn)病毒的檢測(cè)溝通4. 標(biāo)本采集、送檢等其他問(wèn)題溝通臨床溝通臨床溝通臨床溝通實(shí)踐中的體會(huì)1. 重視分析前質(zhì)量控制的培訓(xùn)和落實(shí)2. 建立多種可及的臨床溝通渠道，全員參與，科學(xué)溝通，主動(dòng)走向臨床和患者，注重實(shí)驗(yàn)室和臨床的結(jié)合，更新知識(shí)，重視總結(jié)八.安全管理安全設(shè)備生物安全柜操作高壓滅菌鍋安全設(shè)備各區(qū)專用洗手池噴淋洗眼器（3）紫外車溢出包、藥品箱紫外燈安全設(shè)備口罩/防護(hù)服/鞋套等危險(xiǎn)品柜專用標(biāo)本運(yùn)送箱清潔設(shè)備消毒劑安全標(biāo)志制度和流程培訓(xùn)和演練安全承諾書H7N9禽流感患者首次檢出處理流程發(fā)熱門診標(biāo)本采集流程并演練樣本庫(kù)管理盒蓋標(biāo)簽樣本信息和位置登記標(biāo)簽