去垢劑對(duì)單向免疫擴(kuò)散法測(cè)定流感病毒疫苗血凝素含量的影響

1、去垢劑對(duì)單向免疫擴(kuò)散法測(cè)定流感病毒疫苗血凝素含量的影響去垢劑對(duì)單向免疫擴(kuò)散法測(cè)定流感病毒疫苗血凝素含量的影響流感病毒的囊膜外層分布著兩種主要的抗原物質(zhì)：血凝素haeagglutinin，HA和神經(jīng)氨酸酶neurainidase，NA1-2。研究說明，血凝素在流感病毒感染宿主細(xì)胞的過程中起著至關(guān)重要的作用3，是流感病毒亞單位疫苗中有效的免疫物質(zhì)4-6。因此，血凝素含量的準(zhǔn)確測(cè)定是流感病毒疫苗制品質(zhì)量控制的關(guān)鍵。目前，國(guó)際上通用的流感論文聯(lián)盟.Ll.病毒血凝素含量測(cè)定方法是單向免疫擴(kuò)散法singleradialiundiffusin，SRID7-12，該方法不僅應(yīng)用于流感病毒亞單位疫苗成品的血凝素

2、含量測(cè)定，在疫苗制品消費(fèi)的中間過程控制中也起著至關(guān)重要的指導(dǎo)作用。在流感病毒亞單位疫苗的消費(fèi)過程中，首先制備出大量的完好病毒，然后經(jīng)裂解、純化等假設(shè)干處理后獲得亞單位疫苗13。為了在疫苗制品的消費(fèi)過程中對(duì)不同階段的中間產(chǎn)品進(jìn)展必要的質(zhì)量控制，就需要對(duì)不同組成成分的中間產(chǎn)品進(jìn)展血凝素含量的檢測(cè)。這些中間產(chǎn)品既包括未裂解的完好病毒也包括經(jīng)過裂解、純化的亞單位產(chǎn)品。因此，確定一種可以同時(shí)對(duì)完好病毒和亞單位疫苗進(jìn)展血凝素含量測(cè)定的單向免疫擴(kuò)散法對(duì)于疫苗消費(fèi)過程的質(zhì)量控制具有重要的意義。1材料與方法1.1疫苗中間產(chǎn)品和標(biāo)準(zhǔn)抗原/抗血清流感病毒疫苗中間產(chǎn)品：完好病毒液及亞單位疫苗原液由天士力金納生物技術(shù)天

3、津消費(fèi)；標(biāo)準(zhǔn)抗原/抗血清均購(gòu)自NIBS。1.2主要試劑瓊脂糖BIEST；去垢劑：Zittergent3-14Detergenterk；染色液0.4%考馬斯亮藍(lán)R250；脫色液無水乙醇冰醋酸水=291259。1.3抗原樣本的處理1.3.1去垢劑濃度的比擬將A/Vitria/210/09H3N2NYX-187標(biāo)準(zhǔn)抗原、完好病毒液1、亞單位疫苗原液1三個(gè)抗原樣本以抗原：去垢劑=91的體積比分別參加濃度為0.375%、0.625%、1.25%、2.5%、5.0%、10.0%、20.0%/v的去垢劑，以PBS代替去垢劑等體積參加，作為去垢劑濃度為0的對(duì)照。3組抗原樣本各經(jīng)八個(gè)濃度終濃度分別為0、0.03

4、75%、0.0625%、0.1250%、0.2500%、0.5000%、1.0000%、2.0000%的去垢劑在室溫下裂解30in后同時(shí)加至抗體凝膠板中進(jìn)展SRID。1.3.2裂解時(shí)間的比擬取A/Vitria/210/09H3N2NYX-187標(biāo)準(zhǔn)抗原和亞單位疫苗原液2，分別參加1/9體積的10%/v去垢劑，在室溫條件下分別放置不同時(shí)間進(jìn)展裂解。其中，各裂解時(shí)間組的標(biāo)準(zhǔn)抗原均稀釋為1、0.75、0.50、0.25倍濃度，完好病毒液2和亞單位疫苗原液2分別稀釋12倍和15倍后進(jìn)展裂解。所有抗原樣本經(jīng)處理后同時(shí)加至抗體凝膠板中進(jìn)展SRID。論文聯(lián)盟.Ll.1.4SRID實(shí)驗(yàn)用PBS配制1%瓊脂糖溶

5、液，加熱融化后降溫至45，按說明書中的建議量參加標(biāo)準(zhǔn)抗血清，混勻后傾注在擴(kuò)散板上凝膠厚度為2，待瓊脂糖溶液凝固后用4直徑的打孔器打孔并除去孔內(nèi)凝膠，即為抗體凝膠板。向抗體凝膠板的各加樣孔中分別參加18L處理后的抗原樣本，將凝膠板置于濕盒內(nèi)室溫?cái)U(kuò)散至少18h。凝膠經(jīng)漂洗、壓雹枯燥后進(jìn)展染色、脫色，測(cè)量沉淀圈直徑8。2結(jié)果2.1去垢劑濃度的比擬將標(biāo)準(zhǔn)抗原、完好病毒液1、亞單位疫苗原液1三個(gè)抗原樣本分別以終濃度為0、0.0375%、0.0625%、0.1250%、0.2500%、0.5000%、1.0000%、2.0000%的去垢劑于室溫下同時(shí)裂解30in后進(jìn)展SRID，測(cè)量沉淀圈直徑，然后根據(jù)三組

6、樣本的沉淀圈直徑繪圖，見圖1。從3條曲線的形態(tài)可以看出，去垢劑終濃度由0增加至0.125%時(shí)，3種抗原的沉淀圈均逐漸增大；當(dāng)去垢劑濃度由0.125%增至2.00%時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)抗原和亞單位疫苗的沉淀圈直徑無明顯變化，而完好病毒的沉淀圈仍隨去垢劑濃度的增大而變大，直到去垢劑終濃度到達(dá)1%時(shí)，才不再增大。這說明不管是標(biāo)準(zhǔn)抗原、亞單位疫苗還是完好病毒，在進(jìn)展SRID實(shí)驗(yàn)前都需要進(jìn)展裂解；標(biāo)準(zhǔn)抗原和亞單位疫苗因?yàn)槭孪榷冀?jīng)過了一定的裂解過程，故需要的去垢劑濃度較低0.125%，而完好病毒那么需要使用較高濃度1%的去垢劑才可以充分裂解。圖1中亞單位疫苗與標(biāo)準(zhǔn)抗原兩條曲線幾乎是平行的，這說明去垢劑濃度的變化對(duì)該亞

7、單位疫苗與標(biāo)準(zhǔn)抗原的影響是一致的。經(jīng)過終濃度不小于0.125%的去垢劑裂解后，利用SIRD的方法以標(biāo)準(zhǔn)抗原作為參考品來測(cè)定該工藝條件下消費(fèi)的亞單位疫苗的血凝素含量可以得到穩(wěn)定而準(zhǔn)確的結(jié)果。去垢劑終濃度由0增加到2%時(shí)完好病毒SRID沉淀圈直徑增加了5.2，而亞單位疫苗與標(biāo)準(zhǔn)抗原的沉淀圈僅增加了2.9和2.8?？梢?，去垢劑濃度的變化對(duì)完好病毒的作用最為顯著。當(dāng)利用SRID的方法以標(biāo)準(zhǔn)抗原作為參考品來測(cè)定完好病毒中的血凝素含量時(shí)，樣本處理所需要的去垢劑終濃度不應(yīng)小于1%。2.2裂解時(shí)間的比擬標(biāo)準(zhǔn)抗原稀釋為四個(gè)濃度與稀釋的亞單位疫苗原液共同進(jìn)展三組裂解時(shí)間的比擬，SRID測(cè)得的沉淀圈直徑見表1。利用

8、SRID的沉淀圈直徑與抗原濃度呈線性的關(guān)系分別對(duì)3組裂解時(shí)間所得到的結(jié)果做標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后將3組中分別測(cè)得的完好病毒液2和亞單位疫苗原液2的沉淀圈直徑代入公式中，計(jì)算其血凝素含量，見表2。由表1和表2可見，標(biāo)準(zhǔn)抗原和亞單位疫苗SRID沉淀圈直徑均不隨裂解時(shí)間的變化而發(fā)生顯著變化。因此，在3組裂解時(shí)間下分別測(cè)得的完好病毒液血凝素含量V=0.2%和亞單位疫苗原液血凝素含量V=1.3%的結(jié)果都是一致的。3討論單向免疫擴(kuò)散SRID實(shí)驗(yàn)應(yīng)用于流感病毒血凝素含量的檢測(cè)是一種非常成熟、有效的方法，該方法具有靈敏度高、準(zhǔn)確性好、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，是?中國(guó)藥典?2022年版三部中用于流感病毒疫苗血凝素含量檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)

9、方法。而該方法中，樣本裂解的充分與否是影響測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確性的重要因素。本文以流感病毒疫苗消費(fèi)過程中不同消費(fèi)階論文聯(lián)盟.Ll.段的中間產(chǎn)品作為樣本，研究了利用單向免疫擴(kuò)散法測(cè)定樣本血凝素含量時(shí)去垢劑的影響。本研究的結(jié)果說明，完好病毒或亞單位疫苗以終濃度1%的去垢劑對(duì)抗原樣本進(jìn)展30in的裂解處理后，均能在單向免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)中得到穩(wěn)定準(zhǔn)確的結(jié)果。去垢劑濃度低于1%時(shí)，完好病毒裂解不充分，進(jìn)展單向免疫擴(kuò)散所得的沉淀圈偏??；而去垢劑濃度高于1%時(shí)，完好病毒和亞單位疫苗的SRID沉淀圈直徑均不隨去垢劑濃度的增加而發(fā)生變化。此外，裂解時(shí)間的延長(zhǎng)不會(huì)對(duì)血凝素含量的測(cè)試結(jié)果產(chǎn)生影響。完好病毒未經(jīng)過裂解，抗原顆粒較

10、大，在SRID中不易擴(kuò)散；亞單位疫苗經(jīng)過了一定的裂解處理，抗原顆粒較小，相對(duì)于完好病毒顆粒更易于擴(kuò)散；而亞單位疫苗經(jīng)去垢劑處理后可進(jìn)一步裂解為顆粒更小的抗原物質(zhì)，在SRID中最易擴(kuò)散，裂解劑濃度比擬的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也充分證明了這一點(diǎn)。標(biāo)準(zhǔn)抗原與亞單位疫苗相似，也需要經(jīng)去垢劑裂解后進(jìn)展SRID。在大規(guī)模流感病毒疫苗消費(fèi)的質(zhì)量控制工作中，經(jīng)常需要對(duì)大量的不同階段中間產(chǎn)品樣本進(jìn)展檢測(cè)。利用本研究所確定的樣本處理?xiàng)l件，可同時(shí)對(duì)多種待測(cè)抗原樣本進(jìn)展血凝素含量的測(cè)定，對(duì)于進(jìn)步工作效率、縮小實(shí)驗(yàn)間誤差、節(jié)約實(shí)驗(yàn)本錢等方面都具有非常重要的意義。參考文獻(xiàn)1ValentineR，IsaasA.Thestruturefi

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