e6-5細菌轉(zhuǎn)化實驗和噬菌體實驗

1、e6-5細菌轉(zhuǎn)化實驗和噬菌體實驗1928年FrederickGriffith的肺炎雙球菌(Streptococcuspneumoni轉(zhuǎn)化(transformation)實驗是DNA作為遺傳物質(zhì)的第一個有利證據(jù)。他所使用的肺炎雙球菌有兩種，一種為光滑型(smooth，S),其細胞壁的外面有一個多糖莢膜(capsule)，另一種為沒有莢膜的粗糙型(rough，R)。S型雙球菌感染小鼠會導致小鼠患敗血癥而死亡，但將S型雙球菌加熱殺死后再感染小鼠則不會致病。R型肺炎雙球菌感染小鼠不會引起小鼠的死亡，但如果將R型細菌和加熱殺“死”的S型細菌混合后感染小鼠能導致小鼠死亡，并在其體內(nèi)檢出活的S型細菌圖e6-

2、5(1)。Griffith認為，實驗的結(jié)果是由于加熱殺死的S細菌含有某種“轉(zhuǎn)化因子”，可導致活的R細菌發(fā)生轉(zhuǎn)化作用，從而使R型細菌恢復了生成莢膜的能力。三年后發(fā)現(xiàn)，只需有加熱殺死的S細菌的存在，就可導致R型雙球菌在體外發(fā)生轉(zhuǎn)化。又過了兩年，進一步證明只要將S細菌的提取液加到生長著R型細菌的培養(yǎng)基中，同樣也能發(fā)生轉(zhuǎn)化。那么提取物中究竟是哪一種物質(zhì)充當“轉(zhuǎn)化因子”促使S細菌發(fā)生轉(zhuǎn)化的呢？Griffith最初認為，接種物中的死細菌可能提供了某些特異性的蛋白質(zhì)為食料，使R型細菌能制造出莢注射(3)注41爼駅分析礙到g壓如貳士總細吧鈕瞬加贏嚴命圖e6-5(1)FrederickGriffith的肺炎雙球

3、菌轉(zhuǎn)化實驗隨后，O.T.Avery、C.M.Macleod和M.Mccarty在前人工作的基礎上，經(jīng)過近十年的努力，終于成功在體外完成了轉(zhuǎn)化實驗圖e6-5(2)，并確定了這種轉(zhuǎn)化因子的化學本質(zhì)是DNA，而不是蛋白質(zhì)或其他的大分子。他們將S型細菌加熱殺死后，分離出多糖、脂類、RNA、蛋白質(zhì)和DNA，然后分別加到R型細菌中培養(yǎng)，僅在加入S型DNA的R型細菌中發(fā)生轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生了R型細菌和S型細菌。同時他們還用不同的水解酶來處理各提取物，觀察對實驗的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在DNA中加入一種使DNA降解的DNA酶后就不能發(fā)生轉(zhuǎn)化了。但當時人們?nèi)詰岩蛇@一結(jié)論，原因有三點:（1）雖然R.Feulgen已證明了DNA是

4、染色體的主要組分之一，但人們?nèi)匀徽J為遺傳和染色體上的蛋白質(zhì)有關。因為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)復雜，由20種氨基酸組成，這些氨基酸不同的排列組合將是個天文數(shù)字，從而提供更加豐富的遺傳信息，且在不同生物體中的同源蛋白之間在結(jié)構(gòu)的特異性上存在著極大的差異。而DNA只含有4種不同的堿基，人們一度認為不同種的生物的核酸只有微小的差異，因而形成一種根深蒂固的觀念，即始終相信基因和染色體的活性成分是蛋白質(zhì)；（2）認為轉(zhuǎn)化實驗中DNA并未能提得很純，還有其他雜質(zhì)，可能正是這些少量的特殊蛋白質(zhì)在起轉(zhuǎn)化作用。當時人們難以忘記，20年前Willstatter由于不能將酶提純而錯誤宣稱酶不是蛋白質(zhì)的沉痛教訓，這種擔心重蹈覆轍的心理

5、也加重了人們對Avery實驗結(jié)果的懷疑；（3）也有人認為即使轉(zhuǎn)化因子確實是DNA,但DNA可能只是對莢膜形成起著直接的化學效應，而不是充當遺傳信息的載體。基于上述原因，Avery的重大發(fā)現(xiàn)并未能引起人們的重視，即使到了1949年，Hotchkiss證實了和莢膜無關的細菌性狀也能轉(zhuǎn)化，并用實驗證明了DNA已提得很純，其中蛋白質(zhì)的污染已降至0.02%，這么純的DNA仍可轉(zhuǎn)化，且純度越高轉(zhuǎn)化效率也愈高，但這仍未能改變?nèi)藗兊挠^點，直到1952年，Hershey-Chase的實驗才終于讓人們徹底信服。法藥R剖屆甜天活時一$塑曲葩被就耳R軸瞧（誌化j枝輕壞-R軸胞f薪化）嚇廻一尋入_盡餐対杞就破壞Ria祀

6、（走特化）翅禹I脂肪_爭人埜細胞理F”心主圖e6-5（2）肺炎雙球菌的體外轉(zhuǎn)化實驗Avery及其同事的體外轉(zhuǎn)化實驗盡管設計得十分精確和嚴密，但很多科學家仍不相信DNA是遺傳物質(zhì)，所幸的是在1955年Avery去世前，即在1952年，A.Hershey和M.Chase所做的實驗為其提供了最直接的證據(jù)。這一突破性的實驗受到了T.F.Anderson兩項發(fā)現(xiàn)的啟發(fā)：（1）1949年Anderson發(fā)現(xiàn)，將T-偶數(shù)噬菌體懸液驟然用蒸餾水稀釋，使其受到滲震作用，噬菌體便釋放出DNA，留下其中空的頭部外殼；（2）噬菌體利用尾部吸附到細菌表面上進行感染，如果用組織攪碎器劇烈攪拌，就可以阻礙感染作用。1951

7、年，Herriott發(fā)現(xiàn)這種釋放了DNA的噬菌體空殼仍可吸附到細菌上。這些發(fā)現(xiàn)為噬菌感染實驗奠定了基礎。當時已知T2噬菌體是由蛋白質(zhì)外殼和內(nèi)部的DNA組成。由于一般蛋白質(zhì)只含有S而不含P，DNA中含P而不含S,因而Hershey等想到用同位素35S和32p來分別標記T2的蛋白外殼和DNA。他們首先讓T2噬菌體，分別去感染在含有32P或35S的培養(yǎng)基中生長的大腸桿菌，在菌體裂解后分別收集裂解菌液，經(jīng)標記后再分別感染大腸桿菌，感染后培養(yǎng)10分鐘，用攪拌器劇烈攪拌，使得吸附在細胞表面上的噬菌體脫落下來，再離心分離，細菌發(fā)生沉淀，而游離的噬菌體懸浮在上清液中圖e6-5（3）。譽白質(zhì)外證DNA乩如舸就解，#1噬曲體用堪曲站DNA的噬首體蹙自就奮直4.噬苗體穎技邑裝宿主細更中礙菇，并件埠子我噬曲體年妁増推基中増莽3晦的培泰鼻申培養(yǎng)體空圭中得到圖e6-5(3)Hershey-Chase的噬菌體實驗經(jīng)同位素測定，上清液和沉淀中35S的含量分別為80%和20%,這表明蛋白質(zhì)的外殼脫落下來，并未進入細胞中，沉淀中的20%可能由于少量的噬菌體經(jīng)攪拌后，仍吸附在細胞上所致。32P則在沉淀中含有70%，而在上清液中僅有30%。這表明噬菌體感染細