基因工程學原理內蒙古大學

1、第七章 克隆基因的表達邢萬金內蒙古大學生命科學學院二、克隆基因的表達外源基因mRNARNAPol載體外源基因大腸桿菌一、基因克隆第一節(jié) 外源基因在原核細胞中的表達1. 真核生物的基因用cDNA2. 不能直接用真核基因組DNA（帶有內含子）3. 必須利用原核細胞的調控原件（啟動子等）5. 防止外源基因產物對宿主細胞的毒害4. 有Shine-Dalgarno（S-D）序列一、原核表達真核基因的注意事項是DNA上的能與RNA聚合酶結合并能起始mRNA合成的序列。大腸桿菌的所有啟動子中都有兩段一致順序（consensus sequence）。二、原核生物基因表達的調控元件1. 啟動子-35 Box 和

2、 -10 Box（1） 啟動子序列 原核或噬菌體啟動子MCSSD序列終止子大腸桿菌啟動子的一致序列ACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTCCATCGAATGGCGCAAAACCTTTCGCGGTATGGCATGATAGCGCCCGGAATTTATTCCATGTCACACTTTTCGCATCTTTGTTATGCTATGGTTATTTGGATCCTACCTGACGCTTTTTATCGCAACTCTCTACTGTTTCTCCATACGCCGTGATTATAGACACTTTTGTTACGCGTTTTTGTCATGGCTTTGGTCAAATGA

3、GCTGTTGACAATTAATCATCGAACTAGTTAACTAGTACGCAAGTTCCAAAACGTGTTTTTTGTTGTTAATTCGGTGTAGACTTGTAAACCTACATAATCGACTTGTAAACCAAATTGAAAAGATTTAGGTTTACAAGTCTACAACGTAACACTTTACAGCGGCGCGTCATTTGATATGATGCGCCCCGCTCAAAAAAATACTTGTGCAAAAAATTGGGATCCCTATAATGCGCCTCCGTCAATTTTTCTATTGCGGCCTGCGGAGAACTCCCTATAATGCGCCTCCATAAAATAAATGCT

4、TGACTCTGTAGCGGGAAGGCGTATTATGCACACCCCG-35 region -10 regionlaclacIgalP2araBADaraCtrpbioAbioBtRNAtyrrrnD1rrnE1rrnA1一致序列T C T T G A C A T.11-15bp.T A T A A T.5-8bp.A5142 38 82 84 79 64 53 45 41 79 95 44 59 51 96 C55 T48 G42轉錄起始位點5-TTGACA-35-TATAAT-32）-10 box（Pribnow Box）TTGACATATAAT轉錄起始位點17 bp5核糖體結合位點R

5、NA聚合酶 s亞基的識別位點 。1）-35 box （Sextama box）原核啟動子共有序列的功能Sextama-35Pribnow-10XXXX TTGACA XXXXXXXXXXXXXXXXX TATXXXX AACTGT XXXXXXXXXXXXXXXXX ATAAAT XXXXXXX XXTTA XXXXXXX XXXXXXXXXXXXXXAGTC16 -19bp5-9bpInitiation2. 翻譯的起始位點（1）核糖體結合位點（ RBS）1）Shine-Dalgarno（SD） 序列：mRNA上與核糖體16sRNA結合的序列。S-D序列距離AUG的距離也影響翻譯核糖體小亞基1

6、6S rRNA 35UCCUCCASD 序列mRNA 5AGGAGGUAUG位于SD序列后，目的基因前。2）轉錄終止子3）起始密碼在表達載體克隆位點的下游所設計一段轉錄終止序列。啟動子操縱子S-D序列目的基因終止子AUG（91%）GUG（8%）UUG（1%）大腸桿菌偏愛UAAU。一般安置上全部的三個終止密碼防止核糖體跳躍。4）終止密碼5）翻譯增強子Translation enhancer能夠顯著增強外源基因在大腸桿菌細胞中的表達效率的特殊序列。T7噬菌體基因10前導序列（簡稱g10-L序列）;大腸桿菌atpE基因mRNA5-UTR中富含U的區(qū)段。（1）強啟動子能使外源基因的蛋白產量達到細胞總蛋

7、白的10%-30%以上。（2）低水平的基礎轉錄不誘導時很少表達。（3）應是可誘導型的用溫度或化學試劑誘導。1. 最佳啟動子必須具備的條件三、基因工程常用的原核啟動子2. 基因工程常用的原核生物啟動子（1） 乳糖啟動子lac1）來源可用乳糖或其類似物IPTG誘導。lacPlacO目的基因lac Zlac Ylac Alac Plac Olac I結構基因來自于大腸桿菌的乳糖操縱子：2）結構CAP結合區(qū)RNA聚合酶結合區(qū)阻遏物結合區(qū)核糖體結合區(qū)（包含lacZ的前8個密碼）HaeIII片斷（ “可移動的lac啟動子小片斷”）。HaeIIIHaeIIICAP結合區(qū)RNA聚合酶結合區(qū)阻遏物結合區(qū)核糖體結

8、合區(qū)203 bp（2）色氨酸啟動子 trptrpRP1OtrpEtrpDP2trpCtrpBtrpAtrpR阻遏蛋白基因；P1P2啟動子；O操縱基因；衰減子來自大腸桿菌色氨酸操縱子:P1O目的基因（3）PL和PR啟動子1）來源cIIINPL/OLcIPMOR/PRCroPEcIIN:抗終止蛋白；Cro: 抗阻遏蛋白(裂解必需的）；cI, cII, cIII: 阻遏蛋白；P:啟動子；O:操縱子。R:右；L:左PL/OLOR/PR目的基因目的基因噬菌體的啟動子(比lac啟動子的活性高8-10倍，比trp啟動子活性高):阻遏物轉錄轉錄當cI合成后，與OL和OR結合阻止RNA聚合酶，則左右基因都受到抑

9、制。但促進PM使cI進一步轉錄。進入溶原期。cIIINPL/OLcIPMOR/PRCroPEcII早期左邊轉錄早期右邊轉錄3）調節(jié)基因用cI85742oC時阻遏蛋白失活，外源基因大量轉錄cI857PL外源基因28oC時阻遏PL，外源基因不轉錄。是一個溫度敏感性的突變基因：2）表達載體常用噬菌體啟動子PL（4）大腸桿菌表達常用的啟動子啟動子（來源）調節(jié)作用誘導作用Lac (E. coli)lacI, lacIQ; lacIts, IPTG；溫度Trp (E. coli)色氨酸饑餓，吲哚丙烯酸Lpp (E. coli)IPTG，乳糖phoA (E. coli)phoB(正)；phoR(負)磷酸饑餓

10、recA (E. coli)lexA萘啶酮酸araBAD (E. coli)AraCL阿拉伯糖proU (E. coli)滲透性Cst-1 (E. coli)葡萄糖饑餓tetA(E. coli)四環(huán)素cadA(E. coli)cadRpHnar(E. coli)fnr厭氧環(huán)境，硝酸鹽離子Tac(雜）(E. coli)lacI, lacIQIPTGTrc(雜)(E. coli)lacI, lacIQ; lacIts, IPTG；溫度啟動子（來源）調節(jié)作用誘導作用Lpp-lac (E. coli)lacI, lacIQ; lacIts, IPTG；溫度Psyn (E. coli)lacI, lac

11、IQIPTGPLtet0-1(E. coli)無水四環(huán)素Plac-ara-1 (E. coli)IPTG，阿拉伯糖PL (噬菌體)lacIts857溫度PL-9G-50 (噬菌體)溫度cspA (E. coli)溫度PR-PL (噬菌體)lacIts857溫度T7(T7噬菌體)級聯(lián)系統(tǒng)IPTGT7-lac(T7,E. coli)lacIQIPTGPL-T7(,T7)lacIts857; lacIQ溫度;IPTGT3-lac(T3)lacIQIPTGT5-lac(T5)lacI, lacIQ; IPTGT4基因32(T4)T4感染nprM-laclacIQIPTGVHb(vitreoscilla

12、)氧氣，cAMP-CAP四、外源蛋白在大腸桿菌中的表達部位1. 細胞質中表達（1）包涵體（inclusion body）細胞質中的一種不溶性蛋白質聚集折疊而成的晶體結構物。50%以上的重組蛋白，其余為核糖體元件、RNA聚合酶、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，環(huán)狀或缺口的質粒DNA，以及脂體、脂多糖等，大小為，難溶與水，只溶于變性劑如尿素、鹽酸胍等。1）組成成分2）形成原因重組蛋白的表達過程中缺乏某些蛋白質折疊的輔助因子，或環(huán)境不適，無法形成正確的次級鍵等。 表達量過高。 含硫氨基酸多。 溫度高或胞內pH接近蛋白的等電點。 重組蛋白是大腸桿菌的異源蛋白。3）包涵體表達的優(yōu)點重組蛋白易于分

13、離、免受細菌蛋白酶降解、不損害寄主細胞回收的蛋白生物活性差。4）缺點5）減少包涵體形成的策略 降低重組菌的生長溫度。 添加可促進重組蛋白質可溶性表達的生長添加劑。 供給豐富的培養(yǎng)基，最佳培養(yǎng)條件，如氧、pH等。 2. 周質中表達（1）周質（periplasm）格蘭氏陰性大腸桿菌位于內膜和外膜之間的細胞結構部分。容易被濃縮和純化、有利于正確折疊、被降解的少。（2）周質表達的優(yōu)點一般位于N端，為15-30 aa 。真核與原核的結構相似, 功能相似，可以互換。 堿性氨基酸N疏水氨基酸核心區(qū)Arg、LysLeu、IleAlaGlySer信號肽酶切割位點外源蛋白（3）信號肽（signal peptide

14、）phoA、OmpA、OmpT、OmpF、LamB、-內酰胺酶（lactamase）、腸毒素（enterotoxin）ST-II、LT-B等 大腸桿菌的信號肽：1）常用的原核信號肽 胡蘿卜歐氏桿菌PelB蛋白。 金黃色葡萄球菌的蛋白A。 枯草芽孢桿菌內切葡聚糖酶（endoglucanase）。由于需要穿過兩層膜，大腸桿菌只能分泌極少的蛋白質到培養(yǎng)基中，效果都不太理想。溶血素（hemolysin）、使在大腸桿菌細胞中表達的外源蛋白分泌到細胞外的培養(yǎng)基中。3. 胞外表達細菌素釋放蛋白（bacteriocin release protein)。（1）策略與大腸桿菌細胞的分泌蛋白融合表達。（2）優(yōu)點1

15、）蛋白質受酶解作用最少2）蛋白質容易純化（胞外蛋白種類很少）（3）缺點1）外源真核蛋白一般不會被分泌到胞外2）分泌的量很稀。載體表達出的外源基因蛋白質不與細菌的任何蛋白質融合在一起。S-D序列ATG -外源基因- TAA（1）優(yōu)點五、幾種類型的原核表達載體1. 非融合型表達載體產物結構接近于真核細胞體內的蛋白質結構。（2）缺點容易被宿主蛋白酶破壞、或形成包涵體。哈佛大學的Gilbert實驗室建立的。表達能力強。（1）pKK223-3 載體1）組成結構： 強啟動子: tac（trp-lac）:trp的-35區(qū)lacUV5的-10區(qū)lacO操縱基因操縱基因：終止子：調節(jié)基因：宿主菌染色體上的乳糖操

16、縱子調節(jié)基因Lac I。rrnB的強終止子S-D插入位點區(qū)S-D序列和插入位點區(qū)：載體的其余部分：來自pBR322質粒。2）表達誘導tac PLac OS-D插入位點區(qū)rrnB T宿主lac IIPTG阻遏物IPTGRNA聚合酶EcoRISmaIBamHISalIPstIHindIIIPKK223-34586 bpamprrrnBSDlacOtacPtetroriEcoRISmaIBamHISalIPstIHindIII與細菌的分泌信號肽連在一起，可被宿主菌分泌到細胞周質中。如：pIN III系列 2. 分泌型表達載體pIN III-comA1, pIN III-comA2, pIN III-

17、comA3,（1）組成結構Ipplac Plac OS-D/ATGompa插入位點Ipp（脂蛋白基因啟動子）和lacUV5啟動子。調節(jié)基因：lac IS-D序列和ATG。大腸桿菌外膜蛋白基因ompa。插入位點區(qū)（多克隆位點）。 強啟動子：分泌信號肽：EcoRI , HindIII, BamHIpIN III-comA17.4 kpamprIPPlacPlacOSDompaorilacIEcoRI HindIIIBamHI外源基因產物蛋白與載體上的菌體蛋白連接在一起。1）啟動子：tac2）操縱基因：lacP3）調節(jié)基因：lacI4）S-D序列5）ori：pBR322 ori6）GST(谷胱甘肽S

18、轉移酶）3. 融合蛋白表達載體系統(tǒng)-pGEX系列（1）優(yōu)點（2）組成結構便于分離和純化。便于溶解pGEXlacItaclacPlacOSDGSToriamprMCS（3）產物分離用Glutathione Sepharose親和層析柱分離純化，凝血酶或Xa因子把外源蛋白從GST上切下來。columnGST凝血酶可再利用目的蛋白洗脫再利用收集（4）幾種pGEX的多克隆位點1）pGEX-1TEcoRIBamHI凝血酶Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro Glu Phe Ile Val Thr Asp *CTG GTT CCG CGT GGA TCC CCG GAA TTC ATC

19、GTG ACT GAC TGA CGAGST2）pGEX-2XSmaIEcoRIBamHI凝血酶Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro Gly Ile His Arg Asp *CTG GTT CCG CGT GGA TCC CCG GGA ATT CAT CGT GAC TGA CTGA CGAGST3）pGEX-3X Ile Glu Gly Arg Gly Ile Pro Gly Asn Ser Ser *ATC GAA GGT CGT GGG ATC CCC GGG AAT TCA TCG TGA CTG ACTEcoRIBamHISmaIXa因子（5）其他融合蛋白系統(tǒng)1）His-tag（組氨酸標簽）：在外源多肽的N端或C端接上6個組氨酸（His）。His-tag能與Ni2+柱結合，但很容易被EDTA（或咪唑溶液）洗脫下來，可以純化蛋白質。如pET-his等。pET-his2.9 kb