天花粉蛋白的構(gòu)效關(guān)系及進(jìn)入細(xì)胞的途徑

1、天花粉蛋白的構(gòu)效關(guān)系及進(jìn)入細(xì)胞的途徑【摘要】天花粉蛋白(Trihsanthin,TS)因具有妊娠引產(chǎn)、抗腫瘤、抗病毒及免疫調(diào)節(jié)等多種藥理學(xué)作用而倍受關(guān)注。研究天花粉蛋白的構(gòu)造特征，明確其活性中心及過敏原性區(qū)域?qū)τ谏罨斫馓旎ǚ鄣鞍椎纳飳W(xué)功能非常重要。該文對近年來關(guān)于天花粉蛋白構(gòu)效關(guān)系的研究進(jìn)展作了綜述，并著重介紹了天花粉蛋白進(jìn)入細(xì)胞的詳細(xì)途徑，為研究其他的核糖體失活蛋白提供新的思路。【關(guān)鍵詞】天花粉蛋白核糖體失活蛋白構(gòu)效關(guān)系A(chǔ)bstrat：Trihsanthin(TS),aribseinativatingprtEinextratedfrtherttuberfhineseediinalherb

2、Trihsantheskiriliiaxiiz,hasultiplepharalgialprpertiesinludingabrtifaient,anti-tur,anti-HIVandiuneregulatin.Theantigeniityandshrtplasahalf-lifeliiteditsidelinialadinistratin.Inthisrevie,studiesabutlatingantigenisitesandprlngingplasahalf-lifeeredisussed.Studiesnstruturefuntinrelatinshipandehanisfellen

3、tryerealsvered.Reently,TShasbeenfundtindueapptsis,enhanetheatinfhekinesandinhibitHIV-1intergrase.ThesefindingsgiveneinsightsnthepharalgialprpertiesfTSandtherebersfribse-inativatingprtEIns.Keyrds：Trihsanthin；Ribse-inativatingprtein；Struture-funtinrelatinship天花粉蛋白Trihsanthin,TS是從葫蘆科植物栝蔞的塊根中提取出來的分子量為27

4、KD的單鏈核糖體失活蛋白(RibseInativatingPrteins,RIPs)，其基因序列及三級構(gòu)造均已被說明1。TS在臨床上被用于治療宮外孕、絨毛膜上皮癌，惡性葡萄胎等。體外研究說明,TS能抑制HIV病毒、單純皰疹病毒、麻疹病毒等多種病毒的復(fù)制2，3，對宮頸癌、白血病等腫瘤也有不同程度的抑制作用4，5，說明TS具有多種藥理學(xué)活性。但TS是一種植物蛋白，可引起一系列過敏或類過敏反響，明確TS的活性中心及過敏原性區(qū)域非常重要。本文就TS構(gòu)造與功能的關(guān)系以及TS如何進(jìn)入細(xì)胞的相關(guān)研究進(jìn)展作一綜述。1天花粉蛋白的基因序列和分子構(gòu)造llins等6于1990年報道了TS的一級構(gòu)造，序列分析說明該基

5、因是一個連續(xù)表達(dá)的核苷酸序列，中間沒有內(nèi)含子及其它任何插入序列，它編碼289個氨基酸，其中N端23個氨基酸的信號肽和端19個氨基酸在天然的TS中是不存在的。天然TS的成熟肽有247個氨基酸，在起始密碼子上游有數(shù)個TATA盒。潘克禎等7通過重建TS分子模型并在2.6A分辨率進(jìn)展晶體學(xué)修正，發(fā)現(xiàn)TS分子的二級構(gòu)造由8段螺旋和13條鏈組成。螺旋長短不一，其中4、5及6為三段連續(xù)的a螺旋，且5與活性中心有關(guān)。13條鏈共組成4個折疊層，最大的折疊層由6條鏈組成。從整個分子來看，螺旋相對集中在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部，而鏈構(gòu)成的折疊層那么分布在分子外表，這是TS分子三維構(gòu)造的顯著特點(diǎn)。2天花粉蛋白的構(gòu)效關(guān)系2.1活

6、性位點(diǎn)分析基于天花粉蛋白的三級構(gòu)造和限制性蛋白酶解分析發(fā)現(xiàn)，研究發(fā)現(xiàn)TS潛在的活性位點(diǎn)位于110174氨基酸區(qū)域，刪除TS的前100位氨基酸對其RNA-N-糖苷酶活性的影響并不大8，而120到123位氨基酸對天花粉蛋白的生物學(xué)活性至關(guān)重要，刪除或疏水化取代這一位置的氨基酸會導(dǎo)致其核糖體失活活性降低4000倍9。除此之外，160和189位的谷氨酸也是TS的關(guān)鍵位點(diǎn)，它們分別突變成丙氨酸后其核糖體失活活性降低了1800倍10，去除這兩個位點(diǎn)的谷氨酸殘基后分子外表由負(fù)電荷變成正電荷，這導(dǎo)致其構(gòu)像穩(wěn)定性降低。還有研究說明11，12，14位酪氨酸和22位精氨酸參與蛋白質(zhì)折疊過程，192位色氨酸那么對決定

7、活性位點(diǎn)和維持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性非常重要。2.2過敏原性位點(diǎn)分析因存在一定的過敏原性限制了TS廣泛的臨床應(yīng)用，近來一些研究致力于通過基因突變減少TS的過敏原性而不影響其效能。han等13刪除TS-末端氨基酸序列發(fā)現(xiàn)TS的過敏原性減少了2.7倍而其核糖體失活活性降低了10倍，An等14通過計算機(jī)建模推測其過敏原性位點(diǎn)主要位于TS81-83氨基酸位點(diǎn)和173位的賴氨酸和174位的精氨酸，通過定點(diǎn)突變后其核糖體失活活性與天然TS無顯著差異而過敏原性大大降低。2.3TS具有RNA-N-糖苷酶活性的構(gòu)造根底天花粉蛋白具有RNA-N-糖苷酶活性,能水解真核細(xì)胞核糖體的28SrRNA的4324位上的腺苷酸的N-糖

8、苷鍵,釋放出一個腺嘌呤堿基，使核糖體不可逆失活,從而抑制蛋白質(zhì)的合成。TS的構(gòu)造分析說明其RNA-N-糖苷酶催化活性分兩步進(jìn)展：識別和水解。TS的活性口袋中有兩個亞單位，一個是初始的底物識別位點(diǎn)如第85位的谷氨酸AP識別位點(diǎn)，另一個是催化位點(diǎn)如TS與底物類似物NAPDH的結(jié)合位點(diǎn)。最新研究發(fā)現(xiàn)15，TS的底物與TS結(jié)合后，穩(wěn)定的水分子作為質(zhì)子供體，TS163位精氨酸平衡水分子中的局部負(fù)電荷，形成氫鍵從而參與水解N-糖苷鍵。3天花粉蛋白進(jìn)入細(xì)胞的途徑作為一種核糖體失活蛋白，TS需要進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)作用于胞質(zhì)中的核糖體而發(fā)揮其作用。TS進(jìn)入細(xì)胞的途徑如圖1所示引自文獻(xiàn)16并經(jīng)筆者修改。3.1與磷脂膜互相

9、作用Xia等17研究發(fā)現(xiàn)磷脂可以通過固定水氣界面的TS來增加TS的濃度，說明TS和磷脂膜之間存在互相作用。他們還研究發(fā)現(xiàn)靜電作用是TS與含負(fù)電荷磷脂膜之間互相作用的主要因素，增加Na+濃度至1.5并不會別離所有與磷脂膜結(jié)合的TS，而且TS與磷脂膜結(jié)合后并不會被完全脫離出來直到單層細(xì)胞膜崩解。當(dāng)TS被置于低PH值環(huán)境時其三級構(gòu)造會發(fā)生改變，暴露更多的疏水位點(diǎn)。因此，TS可以在酸性環(huán)境下與帶負(fù)電荷的磷脂膜通過疏水作用相結(jié)合。Lu等18發(fā)現(xiàn)低PH值環(huán)境可以改變某些殘基的電荷，導(dǎo)致鹽橋的斷裂和電荷電荷排擠，使TS局部變性成為“融球態(tài)并最終插入磷脂膜。Zhang等19研究發(fā)現(xiàn)去掉TS端的7個氨基酸殘基會

10、降低TS的膜插入才能，說明TS的末端對其膜內(nèi)轉(zhuǎn)位是必須的。3.2受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用TS對于絨癌JAR細(xì)胞性具有高度毒性而對肝癌H35細(xì)胞系是相對低毒的，說明TS進(jìn)入JAR細(xì)胞和H35細(xì)胞速度不同，并且胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的效能也不同。han等20研究發(fā)如今同一時間進(jìn)入JAR細(xì)胞的TS的量是進(jìn)入H35細(xì)胞的3倍。其前期的研究21發(fā)現(xiàn)TS可以與低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白LDL-reeptrrelatedprtein，LRP)和egalin糖蛋白互相作用，且這種互相作用可被受體相關(guān)蛋白reeptrassiatedprtein,RAP)所抑制。JAR細(xì)胞膜富含低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白LRP)，RAP可抑制JAR細(xì)胞

11、對TS的攝取，說明TS進(jìn)入JAR細(xì)胞的內(nèi)化作用是由LDL受體家族介導(dǎo)的。hristensen等22的研究說明egalin亦參與介導(dǎo)了TS的內(nèi)吞作用，egalin是腎小管近端起主要重吸收作用的糖蛋白，因此高濃度的TS對腎臟有一定毒性，可以損傷腎臟的近曲小管。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.4小結(jié)和展望作為一種從植物根部提純出來的中藥單品，天花粉蛋白因其具有妊娠引產(chǎn)、抗腫瘤、抗病毒及免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)活性而倍受關(guān)注，前期的大量工作致力于研究天花粉蛋白的基因序列及空間構(gòu)造，說明天花粉蛋白如何進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)，已獲得一系列重要成果。目前尚有一些問題有待解決，如天花粉蛋白的RNA-N-糖苷酶活性與引產(chǎn)活

12、性和抗HIV活性有何關(guān)系？其抗HIV的詳細(xì)機(jī)制是什么?如何優(yōu)化或修飾天花粉蛋白的分子構(gòu)造，進(jìn)步其生物學(xué)活性而降低其過敏原性，并延長天花粉蛋白在體內(nèi)的半衰期？神州三號飛船進(jìn)展太空試驗時攜帶了兩個能產(chǎn)生天花粉蛋白抗體的細(xì)胞株，深化研究上述問題將為天花粉蛋白提供更廣闊的應(yīng)用前景?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1angYu,QianRQ,GUZ,etal.SirntifievaluatinfTianHuaFen(THF)-histry,heistryandapliatinJ.PureansApplhe,1986,581:789.2ZhuH,JiaZ,PanJ,etal.IunesuppressinviaIL-4/IL-

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