哺乳動物細(xì)胞表達(dá)重組蛋白

1、關(guān)于哺乳動物細(xì)胞表達(dá)重組蛋白第一張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月按照宿主細(xì)胞的類型，可將基因表達(dá)系統(tǒng)分為:原核表達(dá)系統(tǒng)酵母表達(dá)系統(tǒng)植物表達(dá)系統(tǒng)昆蟲表達(dá)系統(tǒng) 哺乳動物細(xì)胞制備的蛋白質(zhì)藥物質(zhì)量高， 與天然蛋白質(zhì)具有相似的理化性質(zhì)和生物 學(xué)功能第二張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月發(fā)展歷史和現(xiàn)狀1987年FDA批準(zhǔn)了基因泰克公司生產(chǎn)的組織型纖溶酶原激活劑（tPA） ， 世界上第一個哺乳動物細(xì)胞制備的重組蛋白質(zhì)藥物 標(biāo)志著哺乳動物細(xì)胞制備重組蛋門時代的到來。 我國從2000年開始逐漸發(fā)展了該項(xiàng)技術(shù)，雖然起步較 晚，基礎(chǔ)較差，但經(jīng)過努力實(shí)現(xiàn)了該項(xiàng)技術(shù)的突破。第三張，PPT共二十四頁，創(chuàng)

2、作于2022年6月 經(jīng)過20多年的發(fā)展，哺乳動物細(xì)胞制備重組蛋白技術(shù)發(fā)生了巨大的變化。主要表現(xiàn)在 (1) 細(xì)胞培養(yǎng)時間延長，由過去的7天延長至21天； (2) 細(xì)胞密度增加， 過去：1-2X106細(xì)胞毫升， 現(xiàn)在：1-1.5X107細(xì)胞毫升； (3) 產(chǎn)量增加， 過去：1020pg重組蛋白細(xì)胞天， 50一100mg重組蛋白升， 現(xiàn)在：50-90pg重組蛋白細(xì)胞天， 1-5g重組蛋白升。第四張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月哺乳動物細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白的關(guān)鍵之處表達(dá)載體 改進(jìn)表達(dá)載體，提高表達(dá)水平和產(chǎn)量 分泌表達(dá) 下游純化宿主細(xì)胞 新型細(xì)胞株的建立 培養(yǎng)工藝 第五張，PPT共二十四頁，

3、創(chuàng)作于2022年6月一、 真核表達(dá)載體 人工構(gòu)建的哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體為穿梭載體，含： 原核DNA序列：大腸桿菌復(fù)制子及抗生素抗性基因，便于 載體在原核細(xì)胞中擴(kuò)增和大量制備。 轉(zhuǎn)錄相關(guān)元件：哺乳動物細(xì)胞中有效轉(zhuǎn)錄的啟動子和增強(qiáng)子 元件，以及終止子和加polyA信號序列。 翻譯相關(guān)元件：有效的mRNA翻譯信號 其它：視實(shí)驗(yàn)需要加入標(biāo)志基因、內(nèi)含子、內(nèi)部核糖體進(jìn)入 位點(diǎn)等。 第六張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月第七張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月真核表達(dá)載體-啟動子 外源基因在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)與多種因素有關(guān)，主要是啟動子和增強(qiáng)子的強(qiáng)弱以及它們之間的搭配。 人巨細(xì)胞病毒的早期

4、基因啟動子和增加子( promoterenhancer)是最常用的啟動子。 高效啟動子的發(fā)現(xiàn)和改構(gòu)第八張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 內(nèi)含子 某些內(nèi)含子有重要的基因功能調(diào)控序列,目的基因以基因組形式克隆入載體能得到高表達(dá)。 為增加轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的穩(wěn)定性,表達(dá)載體中一般含有天然的或人工合成的內(nèi)含子序列。轉(zhuǎn)錄終止序列 真核基因的hnRNA的加工過程需要PolyA信號,在目的基因3端加上PolyA,表達(dá)水平提高10倍以上。SV40的早期和晚期PolyA.第九張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月第十張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月第十一張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月第

5、十二張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月分泌表達(dá)載體第十三張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 第十四張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月第十五張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月第十六張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月二、宿主細(xì)胞 以高效表達(dá)外源基因?yàn)槟繕?biāo)的高等哺乳動物受體細(xì)胞應(yīng)具備以下條件： 細(xì)胞系特征：喪失細(xì)胞接觸抑制和錨地依賴特征， 便于大規(guī)模培養(yǎng)。 遺傳穩(wěn)定性：外源基因多次傳代后不至于丟失， 易于長期保存。 合適的標(biāo)記：便于轉(zhuǎn)化株的篩選和維持。 生長快且齊：分裂周期短，生長均一，便于控制。 安全性能好：不合成分泌致病物質(zhì)，不致癌。 第十七張，PPT共二

6、十四頁，創(chuàng)作于2022年6月哺乳動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)重組蛋白中，常用的細(xì)胞系有 中國倉鼠卵巢細(xì)胞（CHO） 人胚腎細(xì)胞HEK293第十八張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月 中國倉鼠卵巢細(xì)胞（CHO的優(yōu)勢遺傳背景清楚，生理代謝穩(wěn)定與人的親緣關(guān)系接近，外源蛋白修飾準(zhǔn)確基因轉(zhuǎn)移和載體表達(dá)系統(tǒng)完善耐受剪切力，便于大規(guī)模培養(yǎng)被美國FDA確認(rèn)為安全的基因工程受體細(xì)胞第十九張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月人胚腎細(xì)胞（ HEK293 ）的優(yōu)勢貼壁培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)、無血清懸浮培養(yǎng)三種方式均可用于293細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)。在無Ca2+或含Ca2+培養(yǎng)基中可同樣生長，也可生長在血清濃度較低的培養(yǎng)基

7、中。具有很高的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率和對保持外源基因的高穩(wěn)定性第二十張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月三、培養(yǎng)工藝 為了減少成本和節(jié)約時問，近年來發(fā)展了大規(guī)模懸浮培養(yǎng)細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù) 常用的商業(yè)化的離了脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑，轉(zhuǎn)染效率很高，但價格不菲 目前有兩種試劑(磷酸鈣和聚乙烯亞胺)可用以滿足大規(guī)模培養(yǎng)瞬時表達(dá)第二十一張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月利用代謝工程，改進(jìn)培養(yǎng)工藝，降低生產(chǎn)成本 采用無血清無蛋白培養(yǎng)基(SFMPFM)來降低細(xì)胞培養(yǎng)和產(chǎn)品純化的成本。雙無培養(yǎng)基 但SFMPFM缺乏生長刺激因子、黏附因子、擴(kuò)展因子以及其他細(xì)胞生長存活所必需的成分，在培養(yǎng)過程中細(xì)胞常表現(xiàn)出活力降低、貼壁性差等現(xiàn)象，進(jìn)而導(dǎo)致分泌目的蛋白的能力下降。 通過將生長刺激因子、黏附因子基因?qū)隒HO細(xì)胞中，讓CHO細(xì)胞本身提供其自身生長所需要的成分，使其能在SFMPFM中生長良好。第二十二張，PPT共二十四頁，創(chuàng)作于2022年6月抑制細(xì)胞凋亡，延長培養(yǎng)周期 細(xì)胞在大規(guī)模培養(yǎng)初期， 目的蛋白的表達(dá)和細(xì)胞的增殖速率呈正相關(guān)。 但當(dāng)反應(yīng)器中細(xì)胞的密度達(dá)到飽和后，細(xì)胞繼續(xù)增殖會導(dǎo)致養(yǎng)分和氧的大量消耗以及乳酸、氨等有毒代謝產(chǎn)物的大量積累，細(xì)胞逐漸凋亡，重組蛋白表達(dá)量逐漸降低。 減少代謝產(chǎn)物的積累、在細(xì)胞密度達(dá)到理想值時使細(xì)胞處于增殖遏制期以及提高細(xì)胞的抗凋亡能