免疫共沉淀技術(shù)路線

1、免疫共沉淀技術(shù)路線（CoIP）2007-05-07 09:14準(zhǔn)備工作：預(yù)冷PBS, RIPA Buffer,細(xì)胞刮子（用保鮮膜包好后，埋冰下），離心機(jī)用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，最后一次吸干PBS；加入預(yù)冷的RIPA Buffer（1ml/107個細(xì)胞、10cm培養(yǎng)皿或150cm2培養(yǎng)瓶， 0.5ml/5X106個細(xì)胞、6cm培養(yǎng)皿、75cm2培養(yǎng)瓶）用預(yù)冷的細(xì)胞刮子將細(xì)胞從培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶上刮下，把懸液轉(zhuǎn)到1.5EP管中， 4C，緩慢晃動15min （EP管插冰上，置水平搖床上）4C，14000g離心15min，立即將上清轉(zhuǎn)移到一個新的離心管中準(zhǔn)備Protein A agarose，用PBS

2、洗兩遍珠子，然后用PBS配制成50%濃度， 建議減掉槍尖部分，避免在涉及瓊脂糖珠的操作中破壞瓊脂糖珠每1ml總蛋白中加入100p l Protein A瓊脂糖珠（50%），4C搖晃10min （EP 管插冰上，置水平搖床上），以去除非特異性雜蛋白，降低背景4C，14000g離心15min，將上清轉(zhuǎn)移到一個新的離心管中，去除Protein A 珠子（Bradford法）做蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定蛋白濃度，測前將總蛋白至少稀釋1： 10倍以上，以減少細(xì)胞裂解液中去垢劑的影響（定量，分裝后，可以在-20C保 存一個月）用PBS將總蛋白稀釋到約1 p g/p l，以降低裂解液中去垢劑的濃度，如果 興趣蛋白在

3、細(xì)胞中含量較低，則總蛋白濃度應(yīng)該稍高（如10 p g/p l）加入一定體積的兔抗到500p l總蛋白中，抗體的稀釋比例因興趣蛋白在不 同細(xì)胞系中的多少而異4C緩慢搖動抗原抗體混合物過夜或室溫2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建議 用2 h室溫孵育加入100p l Protein A瓊脂糖珠來捕捉抗原抗體復(fù)合物，4C緩慢搖動抗原 抗體混合物過夜或室溫1h，如果所用抗體為鼠抗或雞抗，建議加2 p l“過渡抗 體”（兔抗鼠IgG，兔抗雞IgG）14000rpm瞬時離心5s，收集瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物，去上清，用預(yù)冷的 RIPA buffer洗3遍，800p l/遍，RIPA buffer有時候會破壞瓊脂

4、糖珠-抗原抗 體復(fù)合物內(nèi)部的結(jié)合，可以使用PBS用60p l 2X上樣緩沖液將瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物懸起，輕輕混勻，緩 沖液的量依據(jù)上樣多少的需要而定（60 p l足夠上三道）將上樣樣品煮5min，以游離抗原，抗體，珠子，離心，將上清電泳，收集 剩余瓊脂糖珠，上清也可以暫時凍-20C，留待以后電泳，電泳前應(yīng)再次煮5min 變性。RIPA Buffer 配制：基礎(chǔ)成分：Tris-HCl （緩沖液成分，防止蛋白變性）NaCl （鹽份，防止非特異蛋白聚集）NP-40 （非離子去污劑，提取蛋白；用H2O配制成10%儲存液）去氧膽酸鈉（離子去污劑，提取蛋白；用H2O配制成10%儲存液；避光保存） 注意

5、：準(zhǔn)備激酶（致活酶）實驗時，不要加去氧膽酸鈉，因為離子型去污劑能夠 使酶變性，導(dǎo)致活性喪失。RIPA蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟（PMSF）（用異丙醇配制成200mM的儲存液，室溫保存）EDTA （鈣螯合劑；用H2O配制成100mM的儲存液，PH 7.4）亮抑酶肽（Leupeptin）（用H2O配制成1mg/ml的儲存液，分裝，-20C保存）抑蛋白酶肽（Aprotinin）（用H2O配制成1mg/ml的儲存液，分裝，-20C保存）胃蛋白酶抑制劑（Pepstatin）（用甲醇配制成1mg/ml的儲存液，分裝，-20C 保存）RIPA磷酸（酯）酶抑制劑激活的Na3VO4 （用H2O配制成200mM的儲

6、存液，見Sodium OrthovanadateActivation Protoco）NaF （200mM的儲存液，室溫保存）注意：在準(zhǔn)備做磷酸（酯）酶實驗的時候，不加磷酸酯酶抑制劑工作液配制：配制 100ml 的 modified RIPA buffe：稱取790mg的Tris-Base，加到75ml去離子水中，加入900mg的NaCl，攪拌，直到全部溶解，用HCl調(diào)節(jié)PH值到7.4加 10 ml 10%的 NP-40加2.5 ml 10%的去氧膽酸鈉，攪拌，直到溶液澄清加1 ml 100mM的EDTA，用量筒定容到100ml，2-8C保存理論上，蛋白酶和磷酸酯酶抑制劑應(yīng)該在使用當(dāng)天同時加入

7、（抑蛋白酶肽， 亮抑酶肽，胃蛋白酶抑制劑各100閆;PMSF, Na3VO4, NaF各500閆），但是PMSF 在水溶液中很不穩(wěn)定，30分鐘就會降解一半，所以PMSF應(yīng)該在使用前現(xiàn)加，其 他抑制劑成分可以在水溶液中穩(wěn)定5天。各種成分在工作液中的終濃度：Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4NP-40: 1%去氧膽酸鈉：0.25%NaCl: 150 mMEDTA: 1 mMPMSF: 1 mM抑蛋白酶肽，亮抑酶肽，胃蛋白酶抑制劑：各1四g/mlNa3VO4: 1 mMNaF: 1 mM通過免疫共沉淀確定結(jié)合蛋白用磷酸鹽緩沖液洗30塊10 cm培養(yǎng)板上的適宜細(xì)胞。刮去每塊板上的細(xì)胞到1 ml冰冷的EBC裂解緩沖液中。將每毫升細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到微量離心管中，在微量離心機(jī)上4C以最大速度離 心 15 min。收集上清（約30 ml）并加入30p g的適當(dāng)抗體，4C搖動免疫沉淀物1 h。加入0.9 ml的蛋白質(zhì)A-Sepharose懸液，4C搖動免疫沉淀物30 min。用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物，再重復(fù)洗5次。 最后，用NETN洗一次。吸出混合物的液體部分。加入800. l的1XSDS膠加樣緩沖液到球珠中，煮 沸 4 min。將樣品加入到大孔的不連續(xù)SDS梯度膠中，在10 mA的恒定電流下電泳 過夜。通過考馬斯