乳鐵蛋白及其生物學(xué)功能

1、乳鐵蛋白及其生物學(xué)功能浙江大學(xué)飼料科學(xué)研究所 齊莉莉 許梓榮1乳鐵蛋白的來源與分布 乳鐵蛋白（lactoferrin，簡稱LF）是一種鐵結(jié)合性糖蛋白，1960年首先由Groves從牛乳中分離獲得。各種哺乳動物都能產(chǎn)生LF，但其濃度因物種而異。人乳中含量特別豐富，初乳中高達(dá)7 gL，常乳中為l g/L。在缺鐵母體中 LF濃度正常，而在蛋白質(zhì)營養(yǎng)不良的母體中，LF濃度降低。牛乳中 LF含量要比人少得多，初乳中為 1 gL，隨著泌乳的進(jìn)行，濃度迅速下降。山羊、馬、豬、小鼠和天竺鼠乳中LF的濃度也很低，如豬的變化范圍是12 gL（初乳）03 gL（常乳）。 LF是一種分泌性蛋白質(zhì)，它不僅合成于乳腺，在

2、浸潤粘膜表面的多數(shù)主要分泌液中都可檢測到這種蛋白，如唾液、淚液、精液、氣管和鼻腔分泌物以及胰液等。LF在豬腸道中的表達(dá)部位主要在上段，從十二指腸、空腸到回腸其分泌逐漸降低。血液中的LF來自成熟的中性粒細(xì)胞的次級顆粒，一般濃度較低（約20 nmolL），這是因為肝臟能快速清除循環(huán)系統(tǒng)中的LF，例如人體每天要清除掉 1525 mg LF。2 乳鐵蛋白的分子結(jié)構(gòu) 人和牛LF的一級結(jié)構(gòu)已經(jīng)確定，是一條多肽鏈，分子量為 7080 kDa，二者氨基酸順序同源性高達(dá)69。它們的Th級結(jié)構(gòu)以螺旋和結(jié)構(gòu)為主（7 以上），二者沿蛋白質(zhì)的氨基酸順序交替排列，而且螺旋大大多于結(jié)構(gòu)。LF上結(jié)合有兩條糖鏈，含量為7左右，

3、其組成包括有半乳糖、甘露糖、N一乙酰半乳糖胺、巖藻糖以及唾液酸等。 LF的立體結(jié)構(gòu)是在二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上折疊成兩個基本相等的葉（N一葉和C一葉），每個葉再進(jìn)一步形成兩個結(jié)構(gòu)域和一條裂隙。裂隙是鐵結(jié)合部位，所以每個LF分子可結(jié)合兩分子 Fe3+和兩分子CO32-（也有文獻(xiàn)報道為HCO3-）。在每個鐵結(jié)合部位中，由4個氨基酸殘基（兩個酪氨酸、一個天冬氨酸和一個組氨酸）組成配位體螫合一分子Fe3+，這樣的裂隙結(jié)構(gòu)使LF可以非常牢固地結(jié)合鐵，其結(jié)合常數(shù)高達(dá) 1020M。 CO32-連接精氨酸和Fe3+，估計有穩(wěn)定鐵結(jié)合的作用。此外，X射線分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e3+結(jié)合到 LF后引起后者的構(gòu)象發(fā)生變化，即鐵進(jìn)入敞

4、開的裂隙內(nèi)部后，兩結(jié)構(gòu)域相應(yīng)閉合，使LF的分子結(jié)構(gòu)更加緊密。LF的這種構(gòu)象變化，解釋了鐵飽和的LF（FeLF）比脫鐵LF（ApoLF）更不易于變性和水解的原因。3 乳鐵蛋白的主要生物學(xué)功能 近十幾年來，人們對LF的生物學(xué)功能進(jìn)行了廣泛的研究，LF可以與許多物質(zhì)以弱鍵和可逆的方式結(jié)合，包括金屬離子、蛋白質(zhì)、細(xì)胞以及DNA。LF的這種廣泛的結(jié)合能力可能是其多樣化生物學(xué)功能的基礎(chǔ)。3l 促進(jìn)鐵吸收 LF可提高腸細(xì)胞對鐵的生物可利用性，其依據(jù)之一就是人乳中鐵的生物利用率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于牛乳或是嬰兒配方食品中鐵的生物利用率。給貧血的小鼠飼喂FeLF或FeSO4，要達(dá)到同樣的治療效果，后者的攝入量需是前者的4倍

5、（分別為 50g和200 g鐵）（Kawakami，1988）。姜冬梅等（1999）的試驗也得出類似結(jié)果，進(jìn)一步證明FeLF中的鐵比FeSO4更易吸收。 轉(zhuǎn)鐵蛋白和LF是體內(nèi)運送鐵的主要蛋白質(zhì)。前者主要在血液中將鐵運送到合成各種含鐵蛋白質(zhì)的地方，而LF主要在腸道中運送鐵，因此對于哺乳動物從腸道中吸收鐵起重要作用。LF與鐵的親和力是轉(zhuǎn)鐵蛋白的250300倍，而且能在較廣的范圍內(nèi)、pH僅22的情況下，不受損地載鐵通過胃。當(dāng)LF到達(dá)腸道后，即和細(xì)胞表面的LF受體（LFR）起反應(yīng)，然后LFR進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，釋放出Fe3+。細(xì)胞對鐵的吸收有負(fù)反饋調(diào)節(jié)機制，當(dāng)胞內(nèi)缺鐵時細(xì)胞表面的LFR增多，增加LF與其受體

6、的結(jié)合（Mikogami，1995）。如果在攝入鐵時結(jié)合使用LF不僅可以降低有效鐵的使用量，而且LF螫合鐵以后避免了游離鐵對腸道的直接刺激作用。32 抗菌作用 在LF的諸多生物學(xué)功能當(dāng)中，其抗菌活性最引人注目，該活性有兩種機制：321 抑菌作用 除乳酸桿菌外幾乎所有的細(xì)菌都需要鐵來維持生長，ApoLF通過與需鐵細(xì)菌爭奪可利用鐵而起到抑菌作用。母乳喂養(yǎng)的嬰兒和哺乳仔畜腸道中需鐵細(xì)菌減少，使乳酸桿菌能在其中集群，進(jìn)而引起腸道pH下降，由此阻止了大腸桿菌的生長，減少傳染性胃腸炎的發(fā)生率。LF的抑菌效果受多種因素影響。LF的鐵含量對抑菌作用起決定作用，當(dāng)LF被鐵飽和后，其抑菌特性就會消失；碳酸鹽可明顯

7、增強LF的抑菌能力，而檸檬酸鹽會減弱其抑菌效果；LF的抑菌效果與pH密切相關(guān)，pH74時效果明顯優(yōu)于pH 68，pH 6時基本無抑菌作用； LF對溶菌酶的活性有協(xié)同作用，溶菌酶首先對細(xì)菌胞壁進(jìn)行溶解，LF使胞壁溶解完全或不完全的細(xì)菌粘連在一起而產(chǎn)生協(xié)同抑菌作用；與LF結(jié)合的抗體（如SIgA）亦可促進(jìn)LF的抑菌作用。322 滅菌作用 LF還可直接與細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)合造成胞壁損傷，該作用可能和其與鈣、鎂的結(jié)合有關(guān)，或者是LF導(dǎo)致釋放G-菌外層膜中的脂多糖而改變了滲透性的結(jié)果（Ellison等，1990）。LF滅菌作用的基礎(chǔ)可能是該蛋白與微生物細(xì)胞的結(jié)合功能。研究發(fā)現(xiàn)，某些細(xì)菌可以表達(dá)具有LFR作用的外

8、膜蛋白質(zhì)，使LF結(jié)合在細(xì)菌的胞膜上。LF的滅菌區(qū)不同于鐵結(jié)合區(qū)，現(xiàn)已被確定和純化，并把含有該滅菌區(qū)的肽片斷命名為乳鐵多肽素（Lactoferricin，簡稱Lfcin）。體外用豬胃蛋白酶分別水解人、牛、豬的LF，可獲得相應(yīng)的Lfcin。Lfcin都有1個由二硫鍵形成的環(huán)狀物，該環(huán)狀物由18個氨基酸組成，即人Lfcin由LF殘基20到37構(gòu)成，牛Lfcin由殘基19 到 36構(gòu)成。Lfcin具有比LF更強烈和更廣譜的滅菌活性。例如牛Lfcin對大腸桿菌O111或金黃色葡萄球菌的最低抑制濃度是LF的十分之一。已報道的牛Lfcin抗菌范圍包括許多G+和G-病原菌，例如大腸桿菌、腸炎沙門氏菌、綠膿桿菌

9、、金黃色葡萄球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌等。然而Lfcin不作用于雙歧桿菌等對人體有益的細(xì)菌。此外，還發(fā)現(xiàn)牛Lfcin具有滅真菌作用，可以直接與其細(xì)胞結(jié)合，以致命的方式殺死白色假絲酵母和絲狀真菌。為了驗證LF對腸道菌叢的影響，用含有052LF的牛乳飼養(yǎng)小白鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小白鼠消化道中的大腸桿菌繁殖受到抑制，這種腸道內(nèi)的抑菌作用，抑制了腸道細(xì)菌向臟器的侵入。用添加LF調(diào)制奶粉哺育嬰兒，其糞便中雙歧桿菌明顯增多，糞便的pH降低，溶菌酶活性和有機酸含量呈上升趨勢。33 免疫調(diào)節(jié)活性 LF通過抑制巨噬細(xì)胞產(chǎn)生集落刺激因子（CSF）而抑制粒-單系祖細(xì)胞，這種抑制作用與分子中的鐵飽和程度有關(guān)，鐵完全飽和的LF抑制作用

10、最強。實驗觀察到，LF濃度為10-16mol/L就有抑制粒-單系祖細(xì)胞生長的活性。Apo-LF的抑制活力大為減低。細(xì)菌脂多糖、鋰鹽、類固醇性激素都可拮抗LF對粒-單系祖細(xì)胞的抑制作用，當(dāng)這些物質(zhì)存在時，LF抑制巨噬細(xì)胞釋放CSF的能力明顯降低。LF對抗體生成、T細(xì)胞成熟、NK細(xì)胞活性、某些細(xì)胞因子生成及前列腺素生成等都有調(diào)節(jié)作用。如可促進(jìn)中性粒細(xì)胞或巨噬細(xì)胞的吞噬作用和滅菌作用，對NK細(xì)胞的活化和淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的增殖具有調(diào)節(jié)作用，但其確切機制有待研究。34 抗感染活性 LF在炎癥中的作用在許多試驗中都已得到證實。在機體受到感染時，吞噬細(xì)胞受到刺激合成并釋放大量IL-l，在IL-1的作用下

11、，中性粒細(xì)胞釋放 LF并與 Fe3+結(jié)合，結(jié)合鐵的LF再被巨噬細(xì)胞所獲取，造成血鐵過低，血鐵降低使致病菌生長繁殖受到抑制。Lima（1986）發(fā)現(xiàn)，LF可增強單核細(xì)胞對微生物的吞噬和對胞內(nèi)寄生菌的殺傷作用。LF雖木能增強中性粒細(xì)胞對微生物的吞噬作用，但可通過兩條不同的作用機制增強其胞內(nèi)滅菌活性：l）ApoLF可通過對鐵離子的結(jié)合，抑制被吞噬細(xì)菌在腦內(nèi)生長，從而促進(jìn)中性粒細(xì)胞對細(xì)菌的殺傷；2）在胞內(nèi)吞噬溶酶體中的酸性環(huán)境條件下，螫合鐵離子的LF可通過提供游離鐵離子催化自由基生成的方式，對吞噬溶酶體內(nèi)的微生物產(chǎn)生殺傷作用。此外，LF還具有促進(jìn)多形核白細(xì)胞粘附的作用，它能使多形核白細(xì)胞粘附于血管內(nèi)皮

12、細(xì)胞，從而有利于白細(xì)胞對血管外炎癥部位的滲出。所以，有人把LF視為抗炎癥因子。35 抗氧化功能 較早以前就有人報道，在pH值為74的NaCl溶液中，飽和度為20的LF抑制了牛腦磷脂脂質(zhì)體的抗壞血酸鐵鹽催化的磷脂過氧化反應(yīng)。LF還降低吞噬細(xì)胞OH產(chǎn)生的可能，從而抑制了單核細(xì)胞膜的鐵催化自動氧化反應(yīng)。因此，可認(rèn)為LF的抗氧化機制主要是螫合了易引起氧化的鐵離子。 游離的Fe3+常常參與自由基反應(yīng)，將O2-氧化為O2和 Fe2+，F(xiàn)e2+又將 H2O2還原為OH、OH-和 Fe3+，最終完成了由 O2-和 H2O2生成 OH、O2和OH-的反應(yīng)。中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等是通過O2-將侵入機體的

13、病原菌殺死的，而聚集在炎癥或受感染部位的 Fe3+和 Fe2+會催化上述自由基反應(yīng)，導(dǎo)致機體出現(xiàn)過多的氧自由基。但當(dāng)游離鐵結(jié)合在LF上，就不容易參與自由基反應(yīng)了。4 乳鐵蛋白的制備 人們自1960年以來就嘗試采用各種方法制備LF，例如采用色譜法、超濾法、鹽析法以及酸沉淀法等從人或牛乳中分離純化LF。其中，超濾法是日本學(xué)者島崎敬一提出的分離LF的新方法，操作簡便，費用低廉，易形成工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)，是生產(chǎn)食品用LF最具實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的方法之一。目前，隨著分離精制技術(shù)不斷完善，已在工業(yè)規(guī)模上開發(fā)成功從干酪乳清和脫脂乳中制備純度高達(dá)95以上的LF，其生產(chǎn)技術(shù)要點是組合使用膜技術(shù)和色譜分離技術(shù)。 由于LF

14、的天然來源有限，所以大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)將依賴于基因工程。Liang等（1993）報道了人LF在啤酒酵母中的表達(dá)，通過將克隆的cDNA置于酵母螫合素啟動子的調(diào)控下，人LF成功地在酵母細(xì)胞中合成，然后通過酵母轉(zhuǎn)化酶分泌信號序列將重組人LF分泌至細(xì)胞外，產(chǎn)率為1520 mg/L。米曲霉是公認(rèn)安全類細(xì)菌，飼料工業(yè)中使用的很多酶就是用這種菌生產(chǎn)的。按細(xì)胞外蛋白質(zhì)的產(chǎn)量來說，米曲霉是最高產(chǎn)的。Conneely（1992）介紹了采用生物技術(shù)用曲霉菌生產(chǎn)LF的基本原理。Ward等（1992）把合成LF的遺傳信息轉(zhuǎn)移到曲霉菌中，然后在適宜條件下進(jìn)行培養(yǎng)，從而實現(xiàn)了LF的優(yōu)化生產(chǎn)，這是通過發(fā)酵大量生產(chǎn)LF的重大突破。美國Genpharm公司通過轉(zhuǎn)基因動物來生產(chǎn)LF。1990年他們采用新的試管法，在荷蘭生產(chǎn)了世界上第1頭雄性轉(zhuǎn)基因乳牛，并希望通過人工繁殖生產(chǎn)大量攜帶產(chǎn)生人LF基因的乳牛，以實現(xiàn)LF的大量生產(chǎn)。5 乳鐵蛋白的應(yīng)用前景 基于LF廣泛的生物學(xué)功能，其應(yīng)用前景非常廣闊。LF及其多肽衍生物可用作高效補鐵劑、防腐劑、抗氧化劑、抗真菌劑、免疫促進(jìn)劑、抗腫瘤劑等。早在1988年，