交替氧化酶與丙酮酸的相互作用

1、從產(chǎn)熱斑葉阿若母中純化的交替氧化酶與丙酮酸的相互作用關(guān)鍵詞：交替氧化酶，作用機(jī)制，丙酮酸調(diào)節(jié)，酶的穩(wěn)定性，二鐵羧酸鹽蛋白，產(chǎn)熱作用 摘要：植物離體線粒體的交替氧化酶活性被羧酸調(diào)控，但是反應(yīng)和調(diào)控機(jī)制還不清楚。我們 的研究表明，從產(chǎn)熱斑葉阿若母肉穗花序中純化的AOX蛋白對丙酮酸和乙醛酸敏感，對琥 珀酸不敏感。缺乏丙酮酸時，AOX迅速的不可逆的失活，不管杜氫酸是否開始氧化，AOX 對杜氫酸不敏感。數(shù)據(jù)表明，丙酮酸能穩(wěn)定AOX的活性構(gòu)象，以單獨地減少底物和產(chǎn)物的 方式增加活性蛋白的數(shù)量，這丙酮酸對酶的表觀最大速率的獨特作用是一致的。1、介紹AOX是非電子激發(fā)的醍氧化酶，它位于高等植物、真菌和某些寄生

2、蟲(包括布氏錐蟲 和隱抱子蟲)線粒體中。雖說兩個獨立的電磁共振研究證明AOX的活性中心由雙核的鐵中 心組成，AOX的結(jié)構(gòu)和機(jī)制已經(jīng)被全部建立。近期具有說服力的傅里葉變換紅外光譜學(xué)的 證據(jù)堅定地把AOX歸入了膜結(jié)合二鐵羧酸蛋白這類蛋白中。一項重要的發(fā)現(xiàn)表明，從植物中分離得到的線粒體表明某些羧酸強(qiáng)烈激發(fā)AOX的活性。 在非產(chǎn)熱物種的線粒體中，例如從大豆子葉和煙草葉中提取的線粒體AOX的活性完全依賴 丙酮酸的參與。乙醛酸和其他的a-酮酸能代替丙酮酸，同時，琥珀酸可以代替丙酮酸激活 土豆和產(chǎn)熱的蓮中的AOX。從產(chǎn)熱的斑葉阿若母肉穗花序中分離的不僅表現(xiàn)出丙酮酸可促 進(jìn)得活性，還在產(chǎn)熱增加過程中表現(xiàn)出丙酮

3、酸不敏感的基本AOX的活性。據(jù)推測，AOX和丙酮酸分子間的相互作用出現(xiàn)在鄰近的兩個關(guān)鍵的Cys形成含硫半縮 醛時，這兩個關(guān)鍵的Cys在許多丙酮酸敏感的AOX酶中都是保守的。人們推測，這個含硫 半縮醛引起點位誘導(dǎo)的構(gòu)象變化，這種構(gòu)象變化對于激活A(yù)OX是必要的。如果用Ser替代 了 Cys，那么這種同功酶將不會被丙酮酸激活而被琥珀酸激活。最重要的是，我們目前對于 斑龍芋AOX的研究暗示，一系列保守序列元件很可能參與丙酮酸的結(jié)合作用。盡管，AOX和丙酮酸分子間的相互作用的結(jié)構(gòu)研究有一定的進(jìn)展，但是，具體丙酮酸 激活A(yù)OX的機(jī)制還不清楚。人們觀察到，只有線粒體泛醍庫高度誘導(dǎo)的情況下丙酮酸才激 活A(yù)OX

4、，因此斷言，丙酮酸增強(qiáng)了 AOX與其還原底物的相對親和力。自從張等發(fā)現(xiàn)用丙 酮酸純化AOX，人們一直爭論丙酮酸對于AOX的最大活性具有專一性。為了把這兩種觀 察結(jié)果解釋清楚Hoefnagel和Wiskich假想了一個模型，模型中丙酮酸通過自身的氧化泛醍 產(chǎn)物保護(hù)酶免受失活。我們認(rèn)為用實驗驗證這條假說非常重要。在這篇論文中我們闡明了 AOX調(diào)控，我們用的是從斑葉阿若母肉穗花序中提取的活性 高、穩(wěn)定性好的AOX。我們研究表明，純化的產(chǎn)熱的AOX的杜氫醍(DQH2)的氧化活性對 于丙酮酸和乙醛酸敏感，而對琥珀酸不敏感。這種敏感性是由于缺乏丙酮酸引起的不可逆的 酶失活。這種失活不需要DQH2氧化，而且

5、對DQ的形成不敏感。因此，我們的研究結(jié)果 表明，丙酮酸通過單向的減少底物和產(chǎn)物來穩(wěn)定AOX的活性，同時，也支持了a-酮酸對于 AOX的表觀Vmax具有獨特的影響的觀點。2、材料和方法2.1化學(xué)藥品N,N-Bis deoxycholamide 是從 ICN Pharmaceuticals 購買的，其他的藥品都由 Sigma 供應(yīng)。 2.2AOX純化如上所述，AOX是從產(chǎn)熱的阿若母線粒體中提取純化的。簡單來講，AOX是從產(chǎn)熱的 阿若母肉穗花序中提取的，加入2 mM的丙酮酸，-20 C冷凍，-70 C保存。純化時，經(jīng)證 實，線粒體的活性在保存過程中全部保留。通過凍融滲透震動線粒體得到亞線粒體粒子 (

6、SMPs)，然后根據(jù)上述方法提純AOX。AOX從deoxyBIGCHAP中溶解，然后用DEAE sepharose-based色譜分離提純。AOX用0.5% w/v deoxyBIGCHAP洗脫。值得注意的是，純 化介質(zhì)中都含有丙酮酸和DTT。將AOX樣品分裝儲存于-80 C備用。樣品至少可以保存活 性一年，表現(xiàn)為對沒食子酸辛酯非常敏感而對粘噻唑不敏感。2.3實驗AOX的活性用色譜級的氧吸收測定，或者用分光光度計同時測定氧化、還原DQ的濃 度，2-甲基氨基乙磺酸-氫氧化鈉PH6.8。所有實驗都在D介質(zhì)中有機(jī)酸中或缺乏有機(jī)酸的 條件下完成的。用連二亞硫酸鈉還原DQ制備DQH2。DQH2固體要室溫

7、避光保存，使用時 用酸化乙醇重懸。儲存濃度要用分光光度計測定以下消光系數(shù)：DQ酒精溶液在259 nm為 17.8 /(mM*cm)，DQH2 水溶液在 283 nm 為 2.15/(mM*cm)0 在 DQH2 氧化實驗中，沒有用 DTT作為標(biāo)準(zhǔn)物，防止DQ被DTT還原。所有實驗中AOX的共價二聚體的狀態(tài)沒有改變。 氧消耗是用Clark型氧電極在室溫下測得的。數(shù)據(jù)用裝有Chart 3.6s版軟件的PowerLab/4SP 系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)字化記錄。AOX被加入到1 ml的D介質(zhì)中，隨后有機(jī)酸從100倍的儲存中加入 25 mM Tes-NaOH溶解 PH6.8，加入 250gM DQH2 后反應(yīng)開始。

8、對于光譜測量實驗，時間決定的吸光度值用Cary 400 Scan UV Visible吸光光度計在250 和290 nm處測得，像先前描述的一樣，實驗進(jìn)展曲線是準(zhǔn)初始速率的數(shù)倍。250nm DQ的 消滅系數(shù) 7.10 和 0.534 /(mM*cm)，290nm DQH2 的消滅系數(shù)是 0.334 和 1.62 /(mM*cm)。所 有實驗都是在能用于磁力攪拌的半微量比色皿中，在20 C恒溫箱中進(jìn)行的。如圖例所示， AOX的活性是在丙酮酸參與或者缺乏的情況下在700 pl的介質(zhì)D中測量的。在添加AOX 或250 pM DQH2后反應(yīng)開始。3、結(jié)果與討論3.1純化AOX的活性依賴各種有機(jī)酸首先，

9、我們根據(jù)各種孵育條件下AOX依賴的耗氧量來研究純化的AOX對于丙酮酸和 其他有機(jī)酸的依賴性。我們或其他的科學(xué)家之前的研究表明，純化的AOX需要結(jié)合去污劑 (EDT-20)和丙酮酸才能保持完整的活性，二者缺一就會降低AOX的活性。Fig. 1A呈現(xiàn)出的 結(jié)果證實了這一見解，在EDT-20的參與下，丙酮酸或乙醛酸是AOX介導(dǎo)的耗氧速率約提 高8倍。然而，琥珀酸對其沒有明顯的作用。乙醛酸促進(jìn)AOX的活性，不管丙酮酸和琥珀 酸參與與否，往往會比丙酮酸單獨介導(dǎo)的活性要高一點。這表明，AOX對乙醛酸的敏感性 比丙酮酸更高。琥珀酸不會顯著影響丙酮酸介導(dǎo)的AOX的活性。特別有趣的是，用琥珀酸 預(yù)孵化30s會阻

10、止丙酮酸和乙醛酸介導(dǎo)的AOX的活性。這個發(fā)現(xiàn)表明，AOX在丙酮酸或乙 醛酸參與下是不穩(wěn)定的；抑或表明，琥珀酸阻止了蛋白與丙酮酸和乙醛酸的相互作用。3.2缺乏丙酮酸情況下，AOX不可逆失活，不考慮酶變化為了觀察丙酮酸對純化AOX的醍氧化活性的影響，我們下一步利用先前開發(fā)的分光光 度計實驗法同時測量DQH2的氧化和DQ的生成Fig. 2A顯示在丙酮酸參與或缺乏情況下， 時間決定的AOX對于DQH2的氧化。當(dāng)加入底物反應(yīng)開始時，分光光度計測定的初始AOX 活性都非常相似，再加上或減去丙酮酸的作用。缺乏丙酮酸是，隨著底物的變化，AOX的 活性會顯著的喪失DTT不影響丙酮酸的作用表明了，AOX失活不是因

11、為蛋白氧化造成的。 總之，這些觀察結(jié)果表明，丙酮酸仍舊結(jié)合在AOX上，不管是純化時，還是在丙酮酸被洗 脫失活時。接下來，我們在沒有還原底物的情況下，孵育AOX土丙酮酸一段時間，來探索酶失活 的可能的原因。Fig. 2B的數(shù)據(jù)表明，孵育后AOX的活性下降明顯，不管丙酮酸參與與否。 然而，在沒有丙酮酸的情況下孵育90s后，AOX的活性下降到對照的10%，而在丙酮酸參 與下從來沒有降到60%以下。Western分析結(jié)果表明，孵育過程中AOX的還原狀態(tài)并沒有 改變。Fig. 2B中顯示的發(fā)現(xiàn)表明，丙酮酸對于未變性酶起穩(wěn)定性作用。這個觀察結(jié)果似乎 與先前的預(yù)期有分歧，之前，我們企圖通過脫鹽作用出去部分提

12、純AOX中的丙酮酸，之后 在厭氧性環(huán)境中用乳酸脫氫酶孵育，結(jié)果AOX的活性僅僅降低了大約40%。但是，由于準(zhǔn) 備和孵化階段NADH-Q氧化還原酶對于NADH的活性，或者準(zhǔn)備工作時的不同的液態(tài)環(huán)境， 這種發(fā)現(xiàn)可能被維持酶結(jié)合醍的還原態(tài)混淆。由于在提純AOX時需要丙酮酸而推斷存在非 結(jié)構(gòu)依賴性AOX失活現(xiàn)象。不考慮酶自身結(jié)構(gòu)的變化，酶活的半衰期大約為30秒。盡管 在同濃度的乙醛酸和丙酮酸中，AOX對于DQH2的氧化率，前者比后者高30-40%，潛在的 反應(yīng)了不同的親和力和包括a-酮酸在內(nèi)的氨基酸殘基的微妙的變化，但是，用乙醛酸代替丙 酮酸會出現(xiàn)同樣的現(xiàn)象。因此，似乎乙醛酸和丙酮酸與AOX的作用相似

13、，目前，我們的數(shù) 據(jù)不能排除這些a-酮酸再作用機(jī)制上有微小的差別。另一方面，加入底物之前，用10mM 的琥珀酸孵育與用不加任何羧酸的緩沖液孵育相比，AOX的失活程度相同。這表明，琥珀 酸在保護(hù)酶免受失活方面沒有任何作用?？梢源_定的是，在丙酮酸敏感物種中分離得到的線粒體中，丙酮酸對AOX的激活作用 是可逆的。但是，在丙酮酸加入AOX中預(yù)孵化30s穩(wěn)定其活性之后，除去純化AOX中的 丙酮酸，AOX就會發(fā)生不可逆的失活，而且不能恢復(fù)。因此，AOX的活性完全依賴于丙酮 酸（或其他a-酮酸）。一個非常有趣的重大發(fā)現(xiàn)是，產(chǎn)熱阿若母線粒體和SMPs中既有丙酮 酸依賴的AOX也有非丙酮酸依賴的AOX。這些差異

14、可能是由于純化樣品中缺乏磷脂造成 的，這暗示AOX在其自身的膜環(huán)境中是穩(wěn)定的。3.3AOX對于丙酮酸濃度的依賴性AOX初始速率對丙酮酸濃度依賴性的檢測是不確定的，因為人們推斷丙酮酸結(jié)合酶之 后然后進(jìn)行純化，并且當(dāng)移除丙酮酸之后，酶發(fā)生不可逆的失活A(yù)OX對于丙酮酸的相對 親和力通過以下方法估測：用不同濃度丙酮酸孵育酶2min，加入DQH2,測定AOX的活性。 通過這種方法得出，使 AOX活性下降到最大活性一半（K1/2）的丙酮酸的濃度至少為 0.5-1mM，不受琥珀酸的影響。這個K1/2比從大豆和卷心菜亞線粒體顆粒中分離的AOX的 K1/2高，可能又一次反應(yīng)了純化蛋白的環(huán)境不同。但是，值得注意的

15、是，我們的實驗結(jié)果 對DQH2的濃度沒有依賴性，這表明，丙酮酸不影響AOX與還原底物和產(chǎn)物的相互作用。 3.4丙酮酸穩(wěn)定純化AOX的活性構(gòu)象，不依賴醍產(chǎn)物丙酮酸缺乏而導(dǎo)致AOX失活，這個現(xiàn)象有兩種解釋：（1）丙酮酸釋放引起不穩(wěn)定的構(gòu) 象變化，二次失活（2）產(chǎn)物抑制低濃度的DQ。Fig. 3的分光光度計測定數(shù)據(jù)區(qū)別了這兩種 解釋。改變實驗中AOX蛋白量不影響時間依賴的酶失活。這個觀察指出，產(chǎn)物抑制是AOX 失活的一個不大可行的解釋，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)數(shù)量增多時，人們希望加快DQ積累，因此加快了 AOX失活速率。實際上，酶活的半衰期與酶量無關(guān)。Fig. 3C是Selwyn用原始的方法繪制 的酶的數(shù)量和反應(yīng)時

16、間關(guān)于DQ積累曲線，呈現(xiàn)了同樣的蛋白依賴數(shù)據(jù)。在丙酮酸的參與下， 這個Selwyn曲線關(guān)于不同AOX數(shù)量的測定表明，酶的活力與數(shù)量成正比，在實驗過程中， 沒有檢測到酶失活。這個曲線是線性的，直到大概100gM的DQ才出現(xiàn)產(chǎn)物抑制AOX活 性。另一方面，沒有丙酮酸參與的情況下，曲線不重疊，在不同的0。濃度下，曲線偏離線 性關(guān)系，表明實驗過程中酶失活。總之，F(xiàn)ig. 3中的數(shù)據(jù)說明丙酮酸維持AOX的活性構(gòu)象， 不依賴DQ。4、結(jié)論人們提出了多種丙酮酸與AOX的作用機(jī)制，包括：丙酮酸因還原底物或產(chǎn)物與AOX 結(jié)合，最大AOX活性和氧氣進(jìn)入活性位點。有趣的是，在這個方面，AOX的末端Cys突 變成Ala會提高aox對氧氣的親和力。我們和其他研究人員之前爭論，丙酮酸結(jié)合到Cys 會促進(jìn)AOX構(gòu)象變化，主要影響其對氧氣的親和力。這種構(gòu)象變化可能是純化AOX保持 活性所必須的。之前，我們發(fā)現(xiàn)了新的初始序列元件，它們可能是Cys之外影響AOX活性的因素。最 近發(fā)現(xiàn)，從產(chǎn)熱蓮線粒體中分離的AOX對丙酮酸和乙醛酸不敏感，相反，可以被琥珀酸激 活。對蓮的兩個序列分析發(fā)現(xiàn)，它和其它對琥珀酸敏感的AOX相似，Cys1被Ser取代。但是，值得注意的是，這種蓮亞型在3區(qū)含有Q/ENV調(diào)控基元。3區(qū)是我們之前假定的對于 丙酮酸敏感的幾段序列之一。人們需要進(jìn)一步研究來建