總膽汁酸檢測(cè)

1、總膽汁酸測(cè)定 Biobase血清總膽汁酸的檢測(cè)酶比色法測(cè)定總膽汁酸循環(huán)法測(cè)定膽汁酸酶比色法測(cè)定總膽汁酸 【原理】 在3-羥類(lèi)固醇脫氫酶(3-HSD)作用下，各種膽汁酸C3上位的烴基(3-OH)脫氫形成碳基(3=O)。同時(shí)NAD還原成NADH。隨后，NADH上的氫由黃遞酶催化轉(zhuǎn)移給碘化硝基四氮唑(INT)，產(chǎn)生紅色的甲臢。甲臢的產(chǎn)量與總膽汁酸(TBA)成正比，在500nm波長(zhǎng)比色。反應(yīng)式如下：3-羥基膽酸 + NAD+ 3-氧代膽酸 + NADH + H+NADH + H+ + INT NAD+ + 甲臢 (紅色)Biobase酶比色法測(cè)定總膽汁酸【試劑】1試劑 黃遞酶 1 000U，NAD+

2、1 mmol，碘化硝基四氮唑(INT)0.5 mmol, 丙酮酸50 mmol溶于0.1mol pH 7.5 的磷酸緩沖液1 L中，加表面活性劑適量。2試劑 3- 羥類(lèi)固醇脫氫酶(3-HSD) 2 000U溶于0.1mol pH 7.5的磷酸緩沖液中1 L中。3終止液 1 mol/L HCl。4標(biāo)準(zhǔn)液(50mol/L) 24.38 mg甘氨膽酸溶于1 L經(jīng)透析的混合血清中。Biobase酶比色法測(cè)定總膽汁酸【操作步驟】1手工法按表 加入物(ml) 測(cè)定 測(cè)定對(duì)照 標(biāo)準(zhǔn) 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照血清 0.1 0.1 a標(biāo)準(zhǔn)液 0.1 0.1 b試劑 0.3 0.3 0.3 0.3 c試劑 0.1 0.1 d 去

3、離子水 0.1 0.1 e 混勻，37水浴10min，加終止液0.1ml，搖勻，500nm波長(zhǎng)，以水校零，讀取各管A值。2自動(dòng)分析法 一般無(wú)法做對(duì)照管，而是設(shè)置兩點(diǎn)終點(diǎn)法，讀取前后兩個(gè)吸光度A1和A2。具體按說(shuō)明書(shū)要求。 Biobase酶比色法測(cè)定總膽汁酸【計(jì)算】手工法：TBA(mol/L) =A測(cè)定-A測(cè)定對(duì)照/A標(biāo)準(zhǔn)-A標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照C標(biāo)準(zhǔn) 自動(dòng)分析法：TBA(mol/L) =A測(cè)定2-A測(cè)定1/A標(biāo)準(zhǔn)2-A標(biāo)準(zhǔn)1C標(biāo)準(zhǔn)【參考范圍】 60名健康成人的空腹TBA為4.92.38mol/L, 中餐后2h TBA為8.222.91mol/L。Biobase酶比色法測(cè)定總膽汁酸 -臨床意義 膽汁酸的生成

4、和代謝與肝臟生理關(guān)系密切，血清膽汁酸水平是反映肝實(shí)質(zhì)損傷的一個(gè)重要指標(biāo)。血清總膽汁酸(TBA)測(cè)定對(duì)肝病的診斷有十分重要的價(jià)值。1急性肝炎：急性肝炎時(shí)血清TBA顯著增高，可達(dá)正常人水平的10100倍，甚至更高，急性肝炎初愈患者血清TBA由最初的高值幾乎與AST在同一時(shí)間降至正常水平，若持續(xù)不降或反而上升者則有發(fā)展為慢性的可能。2慢性肝炎：慢性肝炎分為輕度、中度和重度三個(gè)類(lèi)型，空腹總膽汁酸(F-TBA)和餐后2h總膽汁酸(P-TBA)測(cè)定對(duì)慢性肝炎的分型、監(jiān)測(cè)、預(yù)后及療效有著重要意義。Biobase酶比色法測(cè)定總膽汁酸 -臨床意義3肝硬化：肝硬化時(shí)，肝臟對(duì)膽汁酸的代謝能力減低，血清TBA在肝硬化

5、的不同階段均增高，增高幅度一般高于慢性活動(dòng)性肝炎。即使在肝硬化晚期亦如此。當(dāng)肝病活動(dòng)降至最低時(shí)，膽紅素、轉(zhuǎn)氨酶及堿性磷酸酶等指標(biāo)轉(zhuǎn)為正常，血清TBA仍維持在較高水平。4乙醇性肝?。阂掖夹愿尾⊙錞BA可增高，當(dāng)乙醇性肝病(包括肝硬化)發(fā)生嚴(yán)重的肝損傷時(shí)，血清TBA明顯增高，而輕、中度損傷增高不明顯。有報(bào)道認(rèn)為，血清TBA測(cè)定對(duì)乙醇性肝病肝細(xì)胞損傷診斷的可信度和靈敏度遠(yuǎn)優(yōu)于各種酶學(xué)檢查和半乳糖耐量試驗(yàn)等指標(biāo)，甚至建議將血清TBA再加上-氨基己糖苷酶作為乙醇性肝病的診斷指標(biāo)。有人認(rèn)為，餐后60min-TBA測(cè)定對(duì)乙醇性肝病診斷更有意義。Biobase酶比色法測(cè)定總膽汁酸 -臨床意義5中毒性肝?。涸?/p>

6、中毒性肝病時(shí)血清TBA也將異常。6膽汁淤積：血清TBA測(cè)定對(duì)膽汁淤積的診斷有較高靈敏度和特異性。肝外膽管阻塞及肝內(nèi)膽汁淤積包括急性肝炎、初期膽管性肝硬化、新生兒膽汁淤積、妊娠性膽汁淤積等均可引起TBA增高。在膽管阻塞的初期，膽汁分泌減少，使血清中的TBA顯著增高，且在阻塞的不同階段幾乎保持不變；而血清膽紅素水平則隨不同階段而變化。膽汁淤積患者肝組織中的膽汁酸含量明顯高于正常人。肝外阻塞經(jīng)引流緩解后，血清TBA水平迅速下降，而其它指標(biāo)則緩慢恢復(fù)。Biobase酶比色法測(cè)定總膽汁酸 -臨床意義 所有肝病中，餐后血清TBA水平及異常率均比空腹時(shí)測(cè)定更靈敏，有人甚至認(rèn)為餐后測(cè)定TBA對(duì)各種肝病的診斷靈

7、敏度和特異性高達(dá)100%，而同時(shí)測(cè)定空腹血清膽汁酸有40%的患者在正常范圍。急性肝炎是否轉(zhuǎn)為慢性，連續(xù)監(jiān)測(cè)餐后血清TBA可以觀察慢性過(guò)程，慢性活動(dòng)性肝炎是否發(fā)生纖維化改變，連續(xù)監(jiān)測(cè)餐后血清TBA可以了解纖維化過(guò)程，不做肝活檢即可獲得肝損傷的程度。Biobase酶比色法測(cè)定總膽汁酸 -注意事項(xiàng)由于血清中TBA含量低，樣品中存在干擾物質(zhì)的影響相對(duì)就大，乳酸脫氫酶(LD)是主要的干擾物質(zhì)，由LD反應(yīng)中生成的NADH往往比TBA反應(yīng)中生成的量要大得多，因此測(cè)定前去除血清中LD的影響至關(guān)重要，方法有：血清67加溫30min；加草氨酸作為L(zhǎng)D的封閉劑；堿或酸處理；用丙酮酸鈉抑制LD活性。上述5種方法中丙酮

8、酸鈉法最好，可免去前處理步驟，直接加入反應(yīng)體系，不影響體系的pH，且對(duì)反應(yīng)無(wú)干擾。血清中還存在其它脫氫酶(有相應(yīng)底物存在時(shí))和還原性物質(zhì)，如不除去，測(cè)定結(jié)果會(huì)偏高。據(jù)無(wú)選擇的40例肝功能標(biāo)本的測(cè)定結(jié)果來(lái)看，平均干擾相當(dāng)于TBA 18mol/L，范圍在5.545mol/L之間。因此自動(dòng)分析設(shè)計(jì)成雙試劑二步法，樣品先和不加3-HSD的體系孵育，使樣品中的干擾物質(zhì)先反應(yīng)，然后再加入3-HSD，啟動(dòng)TBA反應(yīng)。Biobase酶比色法測(cè)定總膽汁酸 -注意事項(xiàng)脂肪酶、膽固醇(包括HDL-C、LDL-C)和甘油三酯測(cè)定試劑中均加有膽酸鹽，自動(dòng)分析時(shí)會(huì)引起攜帶污染，必須引起注意。某些先進(jìn)的儀器可以設(shè)定試劑針、

9、樣品針和反應(yīng)杯的補(bǔ)充清洗程序，亦可將TBA編排在上述有污染的項(xiàng)目前測(cè)定。對(duì)某些不具備上述功能的儀器，最好將TBA單批測(cè)定。試劑中加適量表面活性劑可防止甲臢 沉淀。Biobase酶比色法測(cè)定總膽汁酸（H)【方法學(xué)評(píng)價(jià)】1手工法測(cè)定TBA需做標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)的對(duì)照管，樣品和試劑用量大，試劑價(jià)格高，費(fèi)用昂貴。分析儀測(cè)定能避免以上缺點(diǎn)，但去干擾能力不如手工法分析。血清TBA、尤其是正常血清TBA濃度低，因而檢測(cè)靈敏度至為關(guān)鍵，本法測(cè)定TBA50mol/L(標(biāo)本/試劑比為1：10)的標(biāo)準(zhǔn)液，A500nm(1cm)為0.1左右。所以低濃度時(shí)重復(fù)性較差，對(duì)31mol/L和157mol/L的樣品各1份，用手工法每天

10、上下午雙份測(cè)定，測(cè)10天，結(jié)果總CV分別為5.46%和2.79%。本法線(xiàn)性上限為300mol/L。 Biobase循環(huán)法測(cè)定膽汁酸 【原理】 膽汁酸被3-羥基類(lèi)固醇脫氫酶及Thio-NAD+（二核苷酸氧化型）特異性地氧化，生成3-酮類(lèi)固醇及Thio-NADH（二核苷酸還原型），此外，生成的3-酮類(lèi)固醇在3-羥基類(lèi)固醇脫氫酶及還原性輔酶（NADH）存在下，生成膽汁酸和NAD+。如此循環(huán)往復(fù)從而放大微量的膽汁酸量，在405nm處測(cè)定生成的Thio-NADH的吸光度變化，求得膽汁酸量。 Biobase循環(huán)法測(cè)定膽汁酸【試劑】1試劑 硫代-NAD 2mmol/L，Goods緩沖液 200mmol/L，

11、pH7.0。2試劑 3-HSD 15kU/L，NADH 3mmol/L,Goods緩沖液200mmol/L,pH8.0。3標(biāo)準(zhǔn)液 同比色法?！静僮鞑襟E】自動(dòng)化分析法。反應(yīng)類(lèi)型：速率法；反應(yīng)溫度：37；波長(zhǎng)：405nm(主)/660nm(次)樣品3l；R200l；35min后加R50l,延遲時(shí)間1min讀數(shù)時(shí)間4min。Biobase循環(huán)法測(cè)定膽汁酸【計(jì)算】 TBA(mol/L) =A測(cè)定2-A測(cè)定1/A標(biāo)準(zhǔn)2-A標(biāo)準(zhǔn)1C標(biāo)準(zhǔn)【參考范圍】 40名健康成人的空腹TBA為3.712.98mol/L?！咀⒁馐马?xiàng)】 血清TBA測(cè)定的酶循環(huán)法是一種通過(guò)脫氫酶-輔酶體系來(lái)循環(huán)底物的方法，因此要求這種酶對(duì)硫代

12、-NAD和NADH都應(yīng)有高親和力；反應(yīng)體系的pH和緩沖液應(yīng)允許正反應(yīng)(底物氧化)和逆反應(yīng)(底物還原)都能進(jìn)行；還要求硫代-NAD和NADH濃度比例合適。這些條件使反應(yīng)的循環(huán)速率相當(dāng)快(約100次/min),在一定的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)通過(guò)膽汁酸的重復(fù)反應(yīng)來(lái)增加硫代-NADH的量,提高反應(yīng)靈敏度。 Biobase循環(huán)法測(cè)定膽汁酸【評(píng)價(jià)】1干擾試驗(yàn)結(jié)果表明 膽紅素850mol/L，血紅蛋白5g/L，抗壞血酸2.84mmol/L，乳酸24mmol/L，乳酸脫氫酶10 000U/L時(shí)，偏差均5%，說(shuō)明幾乎不存在內(nèi)源性干擾,但外源性干擾如儀器的攜帶污染同樣存在,可用比色法中闡述的方法排除。 2本法靈敏度 TBA5

13、0mol/L(標(biāo)本/試劑體積比為1：83)的樣品，A410nm(1cm)為0.22左右。Beckman DU-640分光光度計(jì)手工操作的批內(nèi)CV2.0%，總CV4.0%，日立7170自動(dòng)分析儀的批內(nèi)CV1.5%。本法(y)與比色法(x)比較y=0.921x1.426，r=0.9982，n=64。本法線(xiàn)性上限180mol/L。Biobase膽汁酸在肝內(nèi)合成、分泌、加工、轉(zhuǎn)化。當(dāng)肝細(xì)胞損傷或膽道阻塞時(shí)，會(huì)引起膽汁酸代謝障礙，出現(xiàn)血清膽汁酸增高 。所以測(cè)定血清中總膽汁酸可以作為判斷肝膽系統(tǒng)正常與否的重要信息。血清中TBA的診斷價(jià)值已得到廣泛重視，它不僅用于臨床診斷，而且還能反映病情和估計(jì)疾病預(yù)后。

14、TBA 臨床意義回顧臨床意義簡(jiǎn)述 急性肝炎時(shí)，血清TBA濃度和ALT活力同時(shí)升高，分別在正常高限的3、4倍和30倍，兩者呈高度正相關(guān);慢性肝病時(shí)升高幅度雖不大，但均在正常值上限或2倍左右;肝硬化時(shí)ALT和肝功能指標(biāo)未發(fā)生明顯改變時(shí)，血清TBA濃度明顯升高。TBA是反映肝細(xì)胞損害非常靈敏的指標(biāo)。 肝硬化時(shí)，血清TBA比慢肝升高幅度大，而ALT和常規(guī)肝功能指標(biāo)未明顯變化，說(shuō)明TBA濃度和ALT活力無(wú)相關(guān)關(guān)系，在肝硬化后期，TBA濃度改變更為明顯，表明TBA比ALT能更敏感地反映肝硬化患者病情。 孕婦測(cè)定TBA的重要性妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥（ICP）是發(fā)生在妊娠中晚期以皮膚瘙癢和黃疸為特征的疾病，膽汁

15、淤積可導(dǎo)致膽小管內(nèi)形成膽栓，血清中TBA的濃度升高，如不能早期診斷及時(shí)對(duì)癥處理，可引起早產(chǎn)、胎兒窘迫、死胎、新生兒死亡及產(chǎn)后出血等母嬰不良后果，列入高危妊娠范疇。臨床對(duì)典型ICP診斷以出現(xiàn)皮膚瘙癢或不伴黃疸，血清TBA、ALT和ALP升高為依據(jù)，其中TBA測(cè)定作為ICP的敏感指標(biāo)，對(duì)ICP有重要和早期診斷價(jià)值。膽汁酸測(cè)定常見(jiàn)問(wèn)題 結(jié)果出負(fù)值 試劑正常時(shí)，此現(xiàn)象出現(xiàn)幾率應(yīng)該很低；但也不能100%排除（尤其是標(biāo)本中TBA含量很低時(shí)）定期做試劑空白校準(zhǔn)是必要的。 交叉污染多項(xiàng)目同時(shí)測(cè)定時(shí)，TBA結(jié)果經(jīng)常會(huì)偏高；單獨(dú)復(fù)查時(shí)，結(jié)果又正常：是目前較常見(jiàn)的現(xiàn)象。這是因?yàn)椋河行┰噭┙M分中添加了較高濃度的膽酸鹽,膽酸鹽具有膽汁酸