鏈特異性測(cè)序介紹

1、Y-adaptor ElationFirst-strand synthesis with normal dNTP sSeco nd-strand synihesi$ with dTTP dUTPFigure 1. Flowchart of the ssRNA-Seq procedure. RNA is shown in red, DNA in green. Arrows are in the 5 to 3 direction.鏈特異性測(cè)序(ssRNA-Seq)鏈特異性建庫(kù)，mRNA-Seq library(Strand-Specific) construction。與之相應(yīng)的測(cè)序稱(chēng)為鏈 特異性

2、測(cè)序(ssRNA-Seq)，是轉(zhuǎn)錄組測(cè)序新增的一項(xiàng)個(gè)性化服務(wù)內(nèi)容。使用ssRNA-Seq可以確定轉(zhuǎn)錄本來(lái)自正鏈還是負(fù)鏈。以便更加準(zhǔn)確的獲得基因的結(jié)構(gòu)以 及基因表達(dá)信息。并且，可以更好的發(fā)現(xiàn)新的基因。(研究表明：很多基因組區(qū)域具有正負(fù)鏈的轉(zhuǎn)錄本，反義轉(zhuǎn)錄是真核基因的一個(gè)特征， 是一種重要的調(diào)控方式。對(duì)于原核以及低等真核生物的compact基因組，常常具有重疊基因。)1.建庫(kù)技術(shù)路線(xiàn)對(duì)常規(guī)的RNA-Seq建庫(kù)方法進(jìn)行一個(gè)簡(jiǎn)單處理。重點(diǎn)是在合成第二條cDNA鏈時(shí)，替換 dTTP為dUTP，加上接頭后降解第二條鏈。Praamplification and sequencing from #Ad12.信

3、息分析結(jié)果(華大)總結(jié)鏈特異性結(jié)果與非鏈特異性結(jié)果相比，在與基因組和參考基因的比對(duì)結(jié)果中鏈特異的結(jié) 果均相近或稍高于非鏈特異結(jié)果，顯示非鏈特異測(cè)序的結(jié)果也是比較準(zhǔn)確的。HBRR鏈特異數(shù)據(jù)比對(duì)到基因組上的比例為72.3%,非鏈特異的為71.3%.UHRR鏈特異數(shù)據(jù)比 對(duì)到基因組上的比例為70.2%,非鏈特異的為68.1%。HBRR鏈特異比對(duì)到參考基因的比例 42.5%,非鏈特異為40.4%。UHRR鏈特異比對(duì)到參考基因的比例61.8%,非鏈特異為51.4%。2）從目前的結(jié)果看鏈特異建庫(kù)所得的read的隨機(jī)分布情況稍差于正常建庫(kù)，但仍處于可 接受的水平。3）檢測(cè)到的基因數(shù)方面來(lái)說(shuō)鏈特異的結(jié)果檢測(cè)得

4、到的基因稍少，但是從理論上說(shuō)更準(zhǔn)確。4）定量分析方面，鏈特異結(jié)果與qPCR和非鏈特異結(jié)果相比相關(guān)性都很高，說(shuō)明鏈特異的 結(jié)果是準(zhǔn)確可信的。5）在基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化方面鏈特異的結(jié)果描述更加吻合已知的基因注釋結(jié)果。6）在可變剪切位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)上，鏈特異發(fā)現(xiàn)的位點(diǎn)數(shù)目稍少，但是發(fā)現(xiàn)已知位點(diǎn)所占比例的更 大。HBRR樣品鏈特異方法發(fā)現(xiàn)135840個(gè)junction，已知占73.5%，非鏈特異發(fā)現(xiàn)146257 個(gè)junction，已知占72.3%UHRR樣品鏈特異方法發(fā)現(xiàn)152183個(gè)junction，已知占69.3%。 非鏈特異發(fā)現(xiàn)168462個(gè)junction，已知占68.1%。7）綜上所述，從本次測(cè)序數(shù)據(jù)來(lái)看

5、，鏈特異建庫(kù)雖然在read的隨機(jī)性分布上略差，但是 其所得結(jié)果其他指標(biāo)都是比較優(yōu)秀的，其結(jié)果是準(zhǔn)確可信的。信息分析結(jié)果詳見(jiàn)附頁(yè)鏈特異轉(zhuǎn)錄組分析小結(jié)原始數(shù)據(jù)概括:表一原始數(shù)據(jù)基本信息SampleTotal ReadsTotal Nucleotides(nt)Q20 percentageN percentageGC percentageHBRR(Raw)30447827548060886089.05%0.01%48.5%HBRR(Clean)29740560535330080089.01%0.01%48.54%UHRR(Raw)34917301628511418088.57%0.01%49.92%

6、UHRR(Clean)34298181617367258088.56%0.01%49.95%測(cè)序隨機(jī)性評(píng)價(jià):JoOJqLunNRelative Position in Gene(5!- 3)胃含w c廠(chǎng)圖一 A HBRR樣品鏈特異結(jié)果的read分布情況0.00.20.40.60.81.0splsalK fen-EDZRelative Position iri Gene(5 3!)圖一 B HBRR樣品非鏈特異結(jié)果的read分布情況gvg 90主E 弓孕再 8+L uopracu* Jo0)qEnNRelative Position in Gene(5h- 3d)圖二A UHRR樣品鏈特異結(jié)果的

7、read分布情況0.00.20.40.6fl.S1.0gpEQJa.。OJqEnNRelative Position in Gene(5 3)圖二B UHRR樣品非鏈特異結(jié)果的read分布情況從上圖可以看出，鏈特異5端reads數(shù)較少，隨機(jī)性不夠好(采用 的是參考序列hg18中的轉(zhuǎn)錄本序列)，結(jié)合兩樣品正常轉(zhuǎn)錄組隨機(jī)性 分布圖，隨機(jī)性分布可能與樣品有關(guān)。比對(duì)基本情況：在hg18的轉(zhuǎn)錄本序列中位于正鏈的轉(zhuǎn)錄本有15998個(gè)占51%，位于 負(fù)鏈的轉(zhuǎn)錄本有15401個(gè)占49%?？傮wgene 20690個(gè)，其中正鏈 10636個(gè)，負(fù)鏈10261個(gè)，在正鏈負(fù)鏈中均存在的基因有207個(gè)。樣品的read具體

8、匹配狀況如下：表二HBRR鏈特異分析及非鏈特異分析比對(duì)基本情況Method Clean reads numberMapped Reads(Gene)Mapped Reads(Genome)Strand59481120Total25011380 (42%)31344994 (52.7%)specific(+)Perfect match17375378 (29.2%)20739782 (34.9%)=2bp mismatch7636002 (12.8%)10605212 (17.9%)Strand specific(-)Total324973 (0.5%)17010510 (28.6%)59481

9、120Perfect match173664 (0.3%)11629931 (19.6%)=2bp mismatch151309 (0.2%)5380579 (9%)Non-Stra nd specificTotal17336776(40.4%)30534775(71.3%)42814906Perfect match10821850(25.3%)18478262(43.2%)=2bp mismatch6514926(15.2%)12056513(28.1%)表三UHRR鏈特異分析及非鏈特異分析比對(duì)基本情況MethodClean reads numberMapped Reads(Gene)Map

10、ped Reads(Genome)StrandTotal38565224 (56.2%)31113869(45.4%)specific(+)68596362Perfect match25878921 (37.8%)19564636(28.5%)=2bp mismatch12686303 (18.4%)11549233(16.8%)StrandTotal383860 (0.56%)22874533(33.3%)specific(-)68596362Perfect match191463 (0.28%)14484450(21.3%)=2bp mismatch192397 (0.28%)839008

11、3(12%)Non-StraTotal29094455(51.4%)38516447(68.1%)nd56597170Perfect match18183069(32.8%)23027611(40.7%)specific=2bp mismatch10911386(19.3%)15488836(27.4%)鏈特異分析的情況下能區(qū)分出在非鏈特異的情況中出現(xiàn)的 readl比對(duì)到gene的正鏈，read2比對(duì)到負(fù)鏈的數(shù)據(jù)（紅色部分）， 僅保留真實(shí)來(lái)自該基因的數(shù)據(jù)（藍(lán)色部分）。在后續(xù)分析reads與基 因組比對(duì)的數(shù)據(jù)時(shí)，我們將比對(duì)到基因組正負(fù)鏈上的情況分開(kāi)，對(duì)每 條鏈單獨(dú)進(jìn)行識(shí)別。4.檢測(cè)到的基因數(shù)：H

12、BRR :Strand specific: 17298No strand specific: 17604UHRR :Strand specific:17768No strand specific: 18098在檢測(cè)基因的數(shù)量上鏈特異能檢測(cè)到的基因數(shù)量略少于非鏈特 異數(shù)據(jù)，原因是非鏈特異建庫(kù)得到的read能夠明確定位到gene的正 負(fù)鏈上，避免了在非鏈特異的情況中出現(xiàn)的readl比對(duì)到gene的正 鏈，read2比對(duì)到負(fù)鏈的錯(cuò)誤數(shù)據(jù)，從而相比非鏈特異減少了比對(duì)后 的數(shù)據(jù)量，使得發(fā)現(xiàn)基因的數(shù)量略少。5.基因的RPKM相關(guān)性：5.1鏈特異數(shù)據(jù)與qPCR的相關(guān)性spearman r = 0. &580

13、73748544957/*genenum = 908 - /0102D3040qPGR圖三A鏈特異HBRR表達(dá)量與qPCR的相關(guān)性sp&arman r = O.S 698091434 J5945 qenenuE =能7qPCR圖四A鏈特異UHRR表達(dá)量與qPCR的相關(guān)性圖五A鏈特異HBRR表達(dá)量/UHRR表達(dá)量與qPCR的相對(duì)定量相關(guān)性通過(guò)以上三圖可以發(fā)現(xiàn)鏈特異建庫(kù)與qPCR定量分析之間的Spearman相關(guān)系數(shù)0.85，說(shuō)明鏈特異的結(jié)果定量分析準(zhǔn)確。5.2非鏈特異與qPCR的相關(guān)性分析speanman r = 0-0706484292 &6147 genmuirrp 91410402030q

14、PCR圖三B非鏈特異HBRR表達(dá)量與qPCR的相關(guān)性spearman r = 0.88582141094887genenuE 二 938010203040qPCR圖四B非鏈特異UHRR表達(dá)量與qPCR的相關(guān)性IIIII-15-10-5D5qPCR圖五B非鏈特異HBRR表達(dá)量/UHRR表達(dá)量與qPCR的相對(duì)定量相關(guān)性 通過(guò)以上三圖可以發(fā)現(xiàn)非鏈特異建庫(kù)與qPCR定量分析之間的OL g 0 TSpearman相關(guān)系數(shù)0.85，且均稍大于鏈特異的結(jié)果，說(shuō)明非鏈特異 的結(jié)果定量分析也是準(zhǔn)確的。5.3鏈特異與非鏈特異的相關(guān)性分析圖六 鏈特異HBRR表達(dá)量與非鏈特異HBRR表達(dá)量相關(guān)性S HBRR.;UHR

15、R1e-021e+0D1e+021e+04IDINS_UHRR圖七 鏈特異UHRR表達(dá)量與非鏈特異UHRR表達(dá)量相關(guān)性圖八 鏈特異UHRR, HBRR表達(dá)量與非鏈特異數(shù)據(jù)的相對(duì)定量相關(guān)性根據(jù)5.3鏈特異與非鏈特異數(shù)據(jù)之間的絕對(duì)定量和相對(duì)定量的數(shù) 據(jù)相關(guān)性分析可知樣品鏈特異與非鏈特異的相關(guān)性很高，說(shuō)明鏈特異 的分析的結(jié)果同非鏈特異結(jié)果相比同樣是可信的。表四定量分析相關(guān)系數(shù)（spearman）比較表絕對(duì)定量相對(duì)定量HBRRUHRRHBRR/UHRR鏈特異0.8580.8690.935與 qPCR非鏈特異0.870.8860.933SS-NS0.9880.9840.94建庫(kù)方法比較6.基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化圖

16、九HBRR某基因鏈特異與非鏈特建庫(kù)所得數(shù)據(jù)基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化比較圖圖九顯示的是chr20染色體負(fù)鏈上的一條基因分別用不同分析方 法得到的TAR區(qū)分布圖，可以發(fā)現(xiàn)鏈特異的分析方法得到的TAR區(qū) 更合理，顯示的的chr20染色體負(fù)鏈上的某基因，其負(fù)鏈上的TAR 結(jié)果能夠充分的吻合和延伸已有的注釋結(jié)果，即鏈特異結(jié)果可以較準(zhǔn) 確的區(qū)分read和注釋基因?？傮w來(lái)說(shuō)較之非鏈特異性分析的結(jié)果， 鏈特異性分析的結(jié)果更合理。但是仍然有一些基因結(jié)構(gòu)無(wú)法識(shí)別，有可能是由于測(cè)序是在該組 織中一些基因不表達(dá)或表達(dá)量太低檢測(cè)不到造成。另外存在很多比對(duì) 到內(nèi)含子上的TAR，顯示這些可能是未成熟的mRNA中含有的內(nèi)含 子未進(jìn)行剪切

17、的原因。7. Junction位點(diǎn)檢測(cè):鏈特異的數(shù)據(jù)使用tophat方法檢測(cè)到的junction位點(diǎn)HBRR 共 135840 個(gè)：正鏈：69037 （50.8%）負(fù)鏈：66803（49.2%）其中，已知位點(diǎn)有99868個(gè)（73.5%），未知的有35972個(gè)（26.5%）, 與非鏈特異交集 104039 個(gè) 51270（-）+52769（ +）。UHRR 共 152183 個(gè)：正鏈：76755（50.4%）負(fù)鏈：75428（49.6%）其中，已知位點(diǎn)有105406個(gè)（69.3%），未知的有46777個(gè)（30.7%）, 與非鏈特異交集 118437 個(gè)（57929（-）+60508（ +）。非鏈

18、特異的數(shù)據(jù)使用tophat方法檢測(cè)到的junction位點(diǎn)：HBRR 共 146257 個(gè)正鏈：73777（50.4%）負(fù)鏈：72480（49.6%）已知：105733（72.3%） 未知：40524（27.7%）UHRR 共 168462 個(gè)正鏈：85143（50.5%）負(fù)鏈：83319（49.5%）已知：114702（68%） 未知：53760（32%）表五樣品HBRR發(fā)現(xiàn)的可變剪切的數(shù)目比較鏈特異非鏈特異類(lèi)型HBRR正鏈HBRR負(fù)鏈SUMHBRR鏈特異與非鏈特 異的交集A3SS26952437 513258652278A5SS21982258 445649461871RetainedInt80373715402335926ronSkippedExon13961464 286030831361表六樣品UHRR發(fā)現(xiàn)的可變剪切的數(shù)目比較鏈特異非鏈特異類(lèi)型UHRR正鏈UHRR負(fù)鏈SUMUHRR鏈特異與非鏈特異 的交集A3SS41193685780492333577A5SS34443347679181183190RetainedInt15001482298236381734ronSkippedExon215621114267475019798.小結(jié)8.1鏈特異性結(jié)果與非鏈特異性結(jié)果相比，在與基因組和