熒光定量原理和應用第二版

1、關于熒光定量原理與應用第二版第一張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月提綱 PCR簡介 熒光定量PCR技術原理 熒光化學物質簡介定量方法實時熒光定量PCR技術簡介：第二張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月PCR概念什么是PCR？Polymerase Chain Reaction (PCR)聚合酶鏈反應是在體外選擇性的擴增特定DNA片段的方法。第三張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月Classic PCR第四張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月Classic PCR第五張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月PCR 循環(huán)第一步 加熱變性、雙鏈打開第二步退火、引物與單鏈結合第三步 -

2、 引物延伸變?yōu)閮蓚€雙鏈DNA第六張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月第七張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月常規(guī)PCR常規(guī)PCR技術：PCR后借助電泳對擴增反應的終產(chǎn)物進行定量及定性分析S1 S2 MDNA Engine第八張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月提綱 PCR簡介 熒光定量PCR技術原理 熒光化學物質簡介 定量方法實時熒光定量PCR技術簡介：第九張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月定量PCR定量PCR技術：利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標準曲線實現(xiàn)對起始模板的定量分析IQ5 Real-time PCR儀第十張，PP

3、T共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月PCR反應混合物Mg2+Mn2+dCTPdGTPdUTPdATPTaq DNA多聚酶引物模板DNA或緩沖液熒光物質第十一張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月提綱 PCR簡介 熒光定量PCR技術原理 熒光化學物質簡介定量方法實時熒光定量PCR技術簡介：第十二張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月 SYBR Green 1 TaqMan熒光化學第十三張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月SYBR Green ISYBR Green 1第十四張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月SYBR Green I 工作原理 SYBR Green 1 結合到雙鏈DNA的

4、小溝部位 SYBR Green 1染料結合狀態(tài)時熒光強度是非結合狀態(tài)的800-1000倍GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAA第十五張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月SYBR Green I第十六張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月SYBR Green I第十七張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月SYBR Green I第十八張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月與傳統(tǒng)PCR的比較實現(xiàn)了初始模板的絕對定量檢測靈敏度高可以檢測到低拷貝的目的基因可以區(qū)分微小的拷貝數(shù)差異可以對初始模板含量差異較大的樣品同時定量省時省力檢測設計靈活第十九張，PPT共五

5、十頁，創(chuàng)作于2022年6月Melt Curve Analysis第二十張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月Melt Curve Analysis第二十一張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月SYBR Green I 優(yōu)點 使用方便 - 不必設計復雜的熒光探針 沒有序列特異性 - 可以用于不同的模板 便宜 靈敏第二十二張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月SYBR Green I 缺點 與非特異性產(chǎn)物結合第二十三張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月TaqMan探針熒光素淬滅劑TaqMan水解型雜交探針第二十四張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月TaqMan 目標特異性探針 5為熒

6、光素， 3為淬滅劑5 熒光素3淬滅劑與目標序列互補第二十五張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月TAQMAN Probes第二十六張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月TAQMAN Probes第二十七張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月TAQMAN Probes第二十八張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月TAQMAN Probes第二十九張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月TaqMan優(yōu)點對目標序列有很高的特異性 -特別適合于SNP檢測第三十張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月TaqMan缺點 價格較高 只適合于一個特定的目標 不能進行融解曲線分析 背景高第三十一張，PP

7、T共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月兼容化學試劑總結結合于雙鏈DNA的小溝中發(fā)夾型雜交探針水解型雜交探針（5-3外切）延伸復性任何步驟定量和檢測目標基因融解曲線分析SNP分析定量和檢測目標基因SNP分析定量和檢測目標基因信號檢測工作原理有否淬滅劑化學試劑否有有主要應用范圍第三十二張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月熒光曲線 隨著PCR反應的進行，擴增產(chǎn)物不斷累積，熒光信號強度不斷增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一次熒光強度信號，得到一條熒光擴增曲線圖第三十三張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月定量原理 如何對起始模板定量？ 通過Ct值和標準曲線實現(xiàn)對起始模板的定量分析 引入兩個概念： 熒光閾值、

8、Ct值第三十四張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月定量原理熒光閾值在熒光擴增曲線指數(shù)增長期設定一個熒光強度標準(即PCR擴增產(chǎn)物量的標準)閾值線第三十五張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月Ct值的概念定量原理Ct值的定義是PCR擴增過程中，擴增產(chǎn)物(熒光信號）到達閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)C(t) 值C(t) 值18.12 +/0.04-閾值線第三十六張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月提綱 PCR簡介 熒光定量PCR技術原理 熒光化學物質簡介定量方法實時熒光定量PCR技術簡介：第三十七張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月 絕對定量 確定初始模板的準確含量 需要標準曲線 相對定

9、量 確定樣品間初始模板的含量倍數(shù)差異 相對標準曲線 不使用標準曲線，利用Ct值計算 Ct方法 Ct方法（看家基因） Pfaffl方法（考慮擴增效率） Vandesompele方法（多看家基因）14500 copies定量方法 第三十八張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月借助標準曲線由未知樣品的C(t)值反推出其初始量得到未知樣品初始量絕對值unknown104103Unknown contains 3108 copies絕對定量第三十九張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月 CT 法相對定量 無均一化處理 均一化依賴于加樣的一致性相對定量CT Sample1 Ct1 (25) Sampl

10、e2 Ct2 (22)CT=Ct1-Ct2 =25-22=3基因表達量Sample1/Sample2=2 CT= 2-3=1/8第四十張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月相對定量CTCT法相對定量 考慮到了加樣誤差 通常使用看家基因來完成均一化處理Sample1 Ct1(25) Sample2 Ct2(22)內(nèi)參基因 actin Ct 01 20 Ct02 21CT1= Ct1-Ct01=25-20=5 CT2=Ct2-Ct02=22-21=1CT= CT1- CT2=5-1=4基因表達量Sample1/sample2=2- CT=2-4=1/16第四十一張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022

11、年6月SimpleComplex 2CT 假定目的基因與看家基因的 擴增效率都是100% 只有一個看家基因 Pfaffl Modification 考慮到擴增效率的影響 只有一個看家基因 Vandesompele Method 考慮到擴增效率的影響 有多個看家基因相對定量第四十二張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月 利用相對標準曲線定量，定量結果相除得到倍數(shù)差別 同時建立兩條標準曲線 一條目的基因的標準曲線 至少再做一條看家基因的標準曲線 借助標準曲線校準擴增效率的影響 使用標準曲線法進行相對定量分析相對定量標準曲線法 第四十三張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月 進行可靠的定量實驗需

12、要對引物對進行優(yōu)化設計 用于優(yōu)化擴增產(chǎn)物產(chǎn)量和特異性的參數(shù) 引物設計 擴增片段選擇 試劑的濃度 循環(huán)條件 變性溫度和退火溫度PCR體系優(yōu)化第四十四張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月利用動態(tài)溫度梯度功能一次實現(xiàn)退火溫度的優(yōu)化退火溫度的優(yōu)化第四十五張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月45oC55oC65oC溶解曲線擴增曲線1. 95oC for 15 min2. 94oC for 10 sec3. Gradient from 45oC to 65oC for 15 sec4. 72oC for 30 sec5. 83oC for 1 sec6. Plate Read7. Go to li

13、ne 2 39 more times8. Melting curve from 65oC to 95oC, readevery 0.2oC, hold 1 sec.退火溫度的優(yōu)化第四十六張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月實時熒光定量PCR應用定量： DNA定量 RNA定量定性： SNP分析 基因型分析 RNA變異分析 融解曲線分析 第四十七張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月定量PCR應用I-實時定量 病原體定量檢測 轉基因拷貝數(shù)的檢測DNA定量拷貝數(shù)研究（替代Southern Blot）RNA定量基因表達差異（替代Northern Blot) 單個或多個基因地表達譜分析 不同組織、器官 不同時期 不同處理第四十八張，PPT共五十頁，創(chuàng)作于2022年6月定