打贏“雙抗之戰(zhàn)”關(guān)鍵要有這兩個“武器”

1、打贏“雙抗之戰(zhàn)”關(guān)鍵要有這兩個“武器”展望未來，繼續(xù)尋找一種完美的雙特異性抗體format也許并不現(xiàn)實。怎樣充分利用現(xiàn)有（專利已經(jīng)或?qū)⒁^期）的 formats 開發(fā)出滿足自己需要的雙特異性抗體藥物或許是各大藥企面臨的最大挑戰(zhàn)。同寫意活動預(yù)告第 70 期復(fù)雜注射劑研發(fā)創(chuàng)新與一致性評價（ 2018 年 3 月 13-15 日，珠海）第71 期新藥項目估值（ 2018 年 3 月 31-4 月 1 日，蘇州）第72 期國際通用技術(shù)要求下的藥品質(zhì)量研究論壇（2018 年 4 月 21-23 日，蘇州）01 雙抗的發(fā)展史：一、二、三代上世紀70 年代隨著雜交瘤技術(shù)的出現(xiàn)，人們立即想到能否用同一個抗體來

2、靶向兩個不同靶點， 也就是雙特異性抗體（ Bispecific Antibody ， bsAb ） 。最早的雙特異性抗體大多使用化學偶聯(lián)的方法，雖然方法簡單，但是所得產(chǎn)物復(fù)雜不均一，很難用于工業(yè)化生產(chǎn)。直到上世紀 80 年代，隨著重組DNA 技術(shù)的推廣，以scFv 為基礎(chǔ)的重組雙特異性抗體出現(xiàn)并逐漸成為研究重點。第一代雙特異性抗體的典型代表就是Amgen/Micromet 的BiTE（Bispecific T-cell Engager），它結(jié)構(gòu)簡單，由兩個scFv連接而成（圖1A） ，但缺點也很明顯，就是半衰期短（僅2個小時） ，表達量低。因為半衰期短，所以在臨床上不得不使用一個泵持續(xù)給藥。好

3、在BiTE 的臨床給藥量低，不到普通抗體用量的十分之一，無形中解決了大量生產(chǎn)的難題。在克服各種困難后，第一個重組雙特異性抗體Blinatumomab( CD3-CD19 BiTE ) 終于在 2014 年 12 月獲 FDA 批準在美國上市。上世紀 90 年代 Genentech 的 Paul Carter 團隊發(fā)明了knob-into-hole 結(jié)構(gòu)的雙特異性抗體，成為第二代雙特異性抗體的典型代表(圖1B ) 。第二代雙特異性抗體有近似天然IgG 的結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定性，在表達及下游工藝方面也有了很大提高。Roche/Chugai 使用 knob-into-hole 技術(shù)的Emicizumab (

4、factor IX and factor X bsAb )于 2017 年 11月獲 FDA 批準成為第二個在美國上市的雙特異性抗體。目前全球有大約120 種雙特異性抗體在不同臨床開發(fā)階段，其中不乏所謂的第三代雙特異性抗體。究竟哪些可以稱得上第三代雙特異性抗體，恐怕是仁者見仁智者見智了。筆者認為如果以 T 細胞靶向治療為例，Roche 的 CEA-TCB (CD3-CEA雙特異性抗體) ( 圖 1C) 是第三代雙特異性抗體的典型代表。因為它不僅利用了第二代雙特異性抗體的knob-into-hole 技術(shù)，并且Roche 工程師在并購Genentech 后不久發(fā)明了CrossMab 技術(shù)而成功地

5、解決了knob-into-hole 技術(shù)在common light chain 方面的技術(shù)瓶頸。此外，CEA-TCB 實現(xiàn)了腫瘤抗原的雙價結(jié)合( bivalent binding ) 和 CD3 的單價結(jié)合( monovalent binding ) ，使得該雙特異性抗體能夠在結(jié)合腫瘤抗原時產(chǎn)生avidity 效果而同時減小CD3 抗體帶來的毒性。目前CEA-TCB 已經(jīng)完成1 期臨床并取得令人滿意的結(jié)果。圖 1. 雙特異性抗體的幾種不同formats02 雙抗發(fā)展滯后的原因從1986 年首個抗體藥物Muromonab （ OKT3 ）獲批上市，截至2017 年底， FDA 累 TOC o 1

6、-5 h z 計批準上市了73 個抗體類藥物。其中只有以上列舉的2 個雙特異性抗體?？梢钥闯?，雙特異性抗體的發(fā)展明顯滯后于治療性單克隆抗體。究其原因，不外乎以下幾個方面：1 、早期雙特異性抗體表達困難，穩(wěn)定性差，生產(chǎn)工藝復(fù)雜；2、雙特異性抗體早期研發(fā)成本明顯高于單克隆抗體。以Emicizumab 為例， Chugai 的科學家們是在篩選了4 萬個不同雙特異性抗體分子后才確定了成藥分子，這當中的付出與堅持恐怕不是一般企業(yè)能做得到的；3、雙特異性抗體項目立項牽涉到靶點生物學、結(jié)構(gòu)生物學、抗體工程、篩選策略，因此只有具備相當實力的公司才敢涉足也才有可能取得成功。 03 雙抗已成各大藥企重點布局方向2

7、017 年抗體藥物市場容量首次突破千億美元大關(guān)?？贵w藥物已成為整個制藥行業(yè)中發(fā)展最快的領(lǐng)域之一。而處于抗體藥物發(fā)展最前沿的雙特異性抗體也早已成為全球各大制藥企業(yè)重點布局的發(fā)展方向。 以 Roche 為例， 雙特異性抗體已占其大分子藥物研發(fā)管線的30% 以上（圖2） 。隨著癌癥免疫治療的持續(xù)升溫CAR-T 治療的異軍突起，相信雙特異性抗體在實體瘤治療領(lǐng)域?qū)⒄加邢喈敶蟮氖袌龇蓊~。相較CAR-T 而言，雙特異性抗體藥物具有劑量可控、用藥周期靈活的優(yōu)點。同時，雙特異性抗體藥物還可以針對其它免疫細胞，如NK、Macrophage 等等。圖 2. Roche 大分子藥物研發(fā)管線布局04 研究方向與篩選策略

8、針對雙特異性抗體項目立項，筆者認為研發(fā)雙特異性抗體必須要達到兩個單克隆抗體聯(lián)用無法達到的效果?？偨Y(jié)目前雙特異性抗體項目的主要研究方向大體可以分為五類：1 、免疫細胞 (尤其是T 細胞) 腫瘤靶向治療；2、 局部給藥 (穿透血腦屏障，關(guān)節(jié)炎癥病灶，眼球)； 3、信號通路協(xié)同效應(yīng)(Synergy) ； 4、利用雙靶點增強靶向特異性；5、 利用靶向同一靶點的不同表位(Epitope) 增強內(nèi)吞(Internalization) 或形成激動劑(Agonist ) 。 一旦確定靶點，接下來的問題就是選擇 bsAb formats 。目前文獻報道過的各種bsAb formats 在100 種以上，業(yè)內(nèi)推崇

9、的做法是根據(jù)專利保護、靶點特性、所要達到的治療目標而選擇2-3 種不同的formats 進行雙特異性抗體的構(gòu)建表達。同時，一個成功的雙特異性抗體項目離不開好的篩選策略。與單克隆抗體研發(fā)類似，能拿到什么樣的雙特異性抗體藥物取決于采用什么樣的篩選方法(Screening Funnel) 。 以 CD3-CEA 雙特異性抗體為例，理想化的雙特異性抗體藥物應(yīng)該是當且僅當CD3-CEA 雙特異性抗體在過表達CEA 的細胞存在時才激活T 細胞。這就需要設(shè)計相關(guān)的生物學實驗來進行篩選。05 常用的抗體工程工具此外，雙特異性抗體還要經(jīng)過一系列嚴格的成藥性(Developability) 實驗篩選才能滿足后期的

10、工業(yè)化生產(chǎn)的要求。往往在篩選過程中很多雙特異性抗體擁有生物學功能卻不能達到成藥性(特別是由于形成聚體aggregates )的要求。在這種情況下就需要進行抗體工程(Antibody Engineering)改造。目前常用的抗體工程工具有以下幾種：1 、利用計算模型 (Computational Modeling) 對雙特異性抗體的VH/VL(Fv)進行建模，找由并修改 hydrophobic patch 從而改善聚體的形成并提高溶解度(圖3A) ； 2、目前大多數(shù)雙特異性抗體 formats 都包含 (sc)Fv 作為其基本結(jié)構(gòu)單元，而很多時候雙特異性抗體的生物活性及成藥性取決于(sc)Fv

11、的活性及穩(wěn)定性；因此可以將scFv 在酵母表面進行展示(YeastDisplay)(圖3B)對其進行親和力及熱穩(wěn)定性的優(yōu)化；3、有時候雙特異性抗體成藥性差是由于framework 造成的， 這種情況可以將雙特異性抗體的CDRs 嫁接 (CDR grafting) 到已知的成藥性好的framework 上(圖 3C) 。 在實際研發(fā)過程中，往往要將幾種不同的抗體工程工具結(jié)合使用才能取得較好的結(jié)果。圖 3. 常用的抗體工程工具06 未來競爭的“核武器”近年來，跨國藥企紛紛投入巨資進行雙特異性抗體的研發(fā)。表現(xiàn)為不僅在內(nèi)部開發(fā)自己的formats 及擴充研發(fā)管線，還積極通過技術(shù)引進(in licens

12、e )買入其它不同formats (表 1 ) 。 表1. 近兩年跨國藥企在雙特異性抗體技術(shù)引進方面的交易以Roche 為例，在已有Knob-into-Hole 、 Crossmab 、 2-in-1的基礎(chǔ)上又分別在2014 年及 2017 年從 Dutalys 及Macrogenics 引進不同的雙特異性抗體formats 。這是為什么呢？這是因為目前已有的100 多種雙特異性抗體formats中沒有任何一個是完美的并且適合各種需要。在實際研發(fā)過程中， 往往某個單克隆抗體在一種format 上表現(xiàn)很好而在另一種 format 上完全無效。因此最好的策略就是同時使用幾種不同的 formats

13、進行雙特異性抗體的構(gòu)建表達及篩選，從中選出最好的分子。這種研發(fā)策略已經(jīng)逐漸在業(yè)內(nèi)取得共識。展望未來，繼續(xù)尋找一種完美的雙特異性抗體format 也許并不現(xiàn)實。怎樣充分利用現(xiàn)有(專利已經(jīng)或?qū)⒁^期)的formats 開發(fā)出滿足自己需要的雙特異性抗體藥物或許是各大藥企面臨的最大挑戰(zhàn)。未來雙特異性抗體研發(fā)的競爭不會是 format 與 format 的比拼而將是篩選策略以及抗體工程改造方面的競爭。誰掌握了全面的雙特異性抗體篩選策略并且擁有完整的雙特異性抗體工程改造工具包(tool box) ， 誰就能在未來激烈的雙特異性抗體研發(fā)競爭中取得領(lǐng)先地位。07 這兩項技術(shù)或?qū)ⅰ蔼氄荐楊^”最后，推薦兩項有希望

14、在未來雙特異性抗體的研發(fā)中“獨占鰲頭”的技術(shù)。 一是 Regeneron以及 Merus 這兩家公司各自擁有的common light chainhumantransgenic mice 正成為雙特異性抗體的生產(chǎn)工廠。單克隆抗體的研發(fā)經(jīng)驗告訴我們，從體內(nèi)得到的抗體往往具有更好的親和力及成藥性。因此，他們拿到的雙特異性抗體成功率可能更高而研發(fā)周期也隨之縮短。值得一提的是，2016年12 月美國 Incyte 公司支付了1.2 億美金首付款從Merus引進了這項技術(shù)。另一項是Adimab 的IgG 酵母展示技術(shù)，這使得雙特異性抗體建庫及細胞篩選成為可能。正因為這項技術(shù)的獨特性與前瞻性，已經(jīng)有包括E

15、li Lilly 及 Merck 在內(nèi)的多家跨國藥企出巨資購買了這項技術(shù)用于雙特異性抗體的研發(fā)。這兩項技術(shù)所產(chǎn)生的雙特異性抗體最后能否在臨床上取得成功，我們將拭目以待。參考文獻：1. BrinkmannU. and Roland RE. The making of bispecific antibodies.MAbs. 2017; 9: 182W122Spiess C et al.,Alternative molecular formats and therapeuticapplications for bispecific antibodies. Mol Immunol. 2015; 67:95-106.顧津明博士美國波士頓地區(qū)Abpro Labs 大分子創(chuàng)