實驗六微生物生理生化反應觀察

1、實驗六 微生物生理生化反應觀察1一、實驗目的初步了解微生物生化鑒定與分類的原理與方法；掌握淀粉水解實驗、明膠水解實驗、尿素水解實驗、糖發(fā)酵實驗的原理和方法。2二、實驗原理1.淀粉酶能水解淀粉為小分子的糊精、雙糖和單糖，而淀粉遇碘液會產(chǎn)生藍色，因此能產(chǎn)淀粉酶的微生物在淀粉培養(yǎng)基上培養(yǎng)用碘處理會產(chǎn)生無色區(qū)域，據(jù)此可分辨微生物能否產(chǎn)生淀粉酶。32.明膠是由膠原蛋白水解產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，在25以下可維持凝膠狀態(tài)，以固體形式存在，而在25以上明膠會液化。如果接種的微生物能夠產(chǎn)生明膠酶就可以使明膠生化管在25 以下發(fā)生液化，據(jù)此性質(zhì)可以鑒別產(chǎn)明膠酶的微生物。43. 尿素酶能夠使尿素分解釋放出氨氣和二氧化碳，氨

2、溶于水使加有酚紅酸堿指示劑的營養(yǎng)瓊脂由中性變成堿性，從而產(chǎn)生顏色變化（由黃色變成深粉紅色）。通過生化管的顏色變化就可以判斷接種的培養(yǎng)基是否產(chǎn)生尿素酶。54、有些微生物能夠分解葡萄糖或乳糖產(chǎn)生有機酸（乳酸、醋酸、丙酸）使生化管的PH值降低，從而使含酸堿指示劑溴甲酚紫的營養(yǎng)瓊脂由紫色變成黃色，通過生化管的顏色變化可以判斷是否能產(chǎn)生相應的糖水解酶類。6三、實驗步驟（二人一組）1.淀粉水解實驗：每人接種二支淀粉生化管（分別接種大腸桿菌和枯草芽孢桿菌），37培養(yǎng)2d，加盧革氏碘液觀察和記錄每管顏色變化，得出結論。72.明膠水解實驗：每人接種二支明膠生化管（分別接種大腸桿菌和金黃色葡萄球菌），20培養(yǎng)2天

3、，從20取出即觀察和記錄各管的明膠水解情況，得出結論。83.尿素水解實驗：每人接種兩支尿素生化管（分別接種變形桿菌和金黃色葡萄球菌），37培養(yǎng)2天，觀察和記錄每管培養(yǎng)前后顏色變化，得出結論。 94、葡萄糖發(fā)酵試驗：每人接種二支葡萄糖生化管（一支接種大腸桿菌、一支接種變形桿菌），37培養(yǎng)2天，觀察和記錄每管培養(yǎng)前后顏色變化，得出結論。105、乳糖發(fā)酵試驗：每人接種二支乳糖生化管（一支接種大腸桿菌、一支接種變形桿菌），37培養(yǎng)2天，觀察和記錄每管培養(yǎng)前后顏色變化，得出結論。11四、實驗注意事項淀粉水解實驗，在觀察時需要加盧革氏碘液以便觀察淀粉的水解情況；接種均在無菌條件下操作，接種完畢以后用滅菌好

4、的棉花塞住管口防止污染；生化管用砂輪切割玻璃后接種。12思考題接種后的明膠試管可以在37 下培養(yǎng)，在培養(yǎng)后你必須做什么才能證明水解的存在?對你的實驗現(xiàn)象進行分析13示 教腸道致病菌的分離鑒定14分離鑒定步驟1、分離培養(yǎng)糞便標本劃線分離S-S平板培養(yǎng)大，紅色，非致病性菌菌落小，無色半透明，為可疑菌落糞便標本劃線分離糞便標本劃線分離S-S平板糞便標本劃線分離培養(yǎng)S-S平板糞便標本劃線分離培養(yǎng)S-S平板糞便標本劃線分離培養(yǎng)S-S平板糞便標本劃線分離大，紅色，非致病性菌菌落培養(yǎng)S-S平板糞便標本劃線分離小，無色半透明，為可疑菌落大，紅色，非致病性菌菌落培養(yǎng)S-S平板糞便標本劃線分離2、初步鑒定選取可疑

5、菌落轉種半固體，雙糖鐵培養(yǎng)基培養(yǎng)觀察培養(yǎng)基變化153、進一步鑒定 對初步鑒定的菌種進一步做生化鑒定4、血清學鑒定 腸道桿菌型別較多，常需血清學方法進行確證5、藥敏試驗 為針對性治療提供依據(jù)16（一）腸道桿菌的形態(tài)、染色及在選擇培養(yǎng)基上的生長情況1、常見腸道致病菌菌種：傷寒桿菌、痢疾桿菌等2、選擇培養(yǎng)基：SS平板、EMB17SS瓊脂培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)原理：此培養(yǎng)基是強選擇性培養(yǎng)基中性紅為指示劑，酸性時呈現(xiàn)紅色，堿性時呈淡黃色。在此培養(yǎng)基上，大腸桿菌屬的菌落大而混濁，因發(fā)酵乳糖，菌落呈現(xiàn)紅色 志賀氏菌屬和沙門氏菌屬的菌落形態(tài)為光滑無色透明，園形、中等大小，邊緣整齊的菌落。由于宋內(nèi)氏痢疾桿菌有分解膽鹽中

6、的某些物質(zhì)和發(fā)酵乳糖(產(chǎn)酸)較慢等特點，而使菌落呈淡紅或紅色的較大或邊緣不整齊的扁平菌落。某些沙門氏菌屬及變形桿菌因 產(chǎn)生硫化氫，使菌落呈現(xiàn)黑色中心。18伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基（）選擇培養(yǎng)原理：此培養(yǎng)基為弱選擇性培養(yǎng)基。以伊紅美蘭作指示劑（）大腸桿菌分解乳糖產(chǎn)酸時染上伊紅，因為伊紅和美蘭結合所以菌落不是紅色而呈現(xiàn)紫黑色，且有金屬光澤(大腸桿菌)或棕色(產(chǎn)氣桿菌)，扁平混濁，而較大邊緣色淡的菌落。（）致病菌的菌落為無色半透明、園形，中等大小，邊緣整齊的菌落，在靠近大腸桿菌的可疑菌落往往呈現(xiàn)淡蘭色。 19方法：1、分離培養(yǎng)、觀察菌落特征：分別取四的培養(yǎng)物，用分離劃線方法接種SS平板或EMB培養(yǎng)基37培

7、養(yǎng)18-24h以后觀察結果。2、革蘭染色、觀察形態(tài)學特征：取各菌培養(yǎng)物少許涂片，革蘭染色、鏡檢。20菌落觀察SS平板沙門氏菌：無色透明菌落，有黑色中心志賀氏菌：無色透明菌落。21腸道桿菌形態(tài)學觀察22（二）腸道桿菌生化反應及動力試驗培養(yǎng)基：克氏雙糖斜面培養(yǎng)基、生化反應管、半固體培養(yǎng)基23克氏雙糖斜面培養(yǎng)基生化反應原理 該培養(yǎng)基含葡萄糖與乳糖的比例為1:10，并含硫酸亞鐵和指示劑酚紅。大腸桿菌發(fā)酵乳糖和葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，所以上層呈黃色，直立段有氣泡存在腸道病原菌不能發(fā)酵乳糖，只能發(fā)酵葡萄糖，分解葡萄糖產(chǎn)酸，使PH下降，因斜面部分先呈現(xiàn)黃色，由于葡萄糖含量少，所生之酸接觸空氣而氧化，又因細苗的生長利

8、用含氮物質(zhì)生成堿性化合物，所以斜面部分后來又變成紅色由于直立段(底層)呈厭氧狀態(tài)，細菌發(fā)酵葡萄糖所生的酸不被氧化，所以一直呈黃色。大腸桿菌產(chǎn)氣，有動力(沿穿刺線向周圍擴散生長)傷寒桿菌有動力，而痢疾桿菌則沒有動力 某些細菌如變形桿菌，乙型副傷寒桿菌能分解培養(yǎng)基中含硫氨基酸（如胱氨酸）產(chǎn)生硫化氫、硫化氫與硫酸亞鐵中的亞鐵離子結合形成黑色的硫化鐵，而痢疾桿菌不產(chǎn)生硫化鐵 24生化反應管原理（1）尿素試驗：此培養(yǎng)基鑒別沙門氏菌和變形桿菌屬細菌，自鐵質(zhì)雙糖培養(yǎng)基上取菌苔作斜面接種，置37恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)1824小時同時作鏡檢觀其是否為純培養(yǎng)變形桿菌含有尿素酶，經(jīng)24小時培養(yǎng)能分解培養(yǎng)基中較多量尿素產(chǎn)生大量

9、的氨，使培養(yǎng)基PH變?yōu)辂|性，而呈現(xiàn)紅色。即陽性反應，陽性反應可棄之。痢疾桿菌屬及沙門氏菌屬之細菌不能分解尿素而不呈現(xiàn)堿性反應即陰性反應，陰性反應 需繼續(xù)作生化反應及血清學試驗。25生化反應管原理（2）糖發(fā)酵試驗，細菌具有多種酶系統(tǒng)能分解糖類，產(chǎn)酸產(chǎn)氣。不同的細菌對各種糖類的分解不同，因而可以利用糖發(fā)酵進行各種細菌(特別是腸道細菌)的鑒別。大腸桿菌能發(fā)酵乳糖、葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣。志賀痢疾桿菌、沙門氏菌、變形桿菌不分解乳糖，但能分解葡萄糖產(chǎn)酸。宋內(nèi)氏痢疾桿菌遲緩發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸，能分解葡萄糖產(chǎn)酸。26生化反應管原理（3）硫化氫試驗：某些細菌能分解培養(yǎng)基中硫氨基酸（如胱胺酸）產(chǎn)生硫化氫、硫化氫與硫酸亞鐵中的亞鐵離子結合形成黑色的硫化鐵，變形桿菌，乙型副傷寒桿菌能產(chǎn)生硫化鐵痢疾桿菌不產(chǎn)生硫化鐵。 27方法：1、克氏雙糖鐵斜面培養(yǎng)基：分別取四種腸道桿菌的培養(yǎng)物，用穿刺加斜面劃線接種方法接種于4支克氏雙糖斜面培養(yǎng)基，37培養(yǎng)18-24h以后觀察結果。2、生化反應管：取尿素反應管、硫化氫反應、葡萄糖反應、乳糖反應管，每種反應管分別穿刺接種大腸桿菌、傷寒桿菌、痢疾桿菌、變形桿菌，37培養(yǎng)18-24h以