CRISPR-Cas9技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專(zhuān)心-專(zhuān)注-專(zhuān)業(yè)專(zhuān)心-專(zhuān)注-專(zhuān)業(yè)精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上專(zhuān)心-專(zhuān)注-專(zhuān)業(yè)CRISPR/Cas9技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用Zujia.W摘要： 成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列/成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列關(guān)聯(lián)蛋白(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins, CRISPR/Cas) 技術(shù)是近兩年出現(xiàn)的一種定點(diǎn)基因組編輯新工具，具有靈活、高效、廉價(jià)且易于操作等優(yōu)點(diǎn)。這種新的基因編輯工具的出現(xiàn)，為基因功能、疾病分子機(jī)制的研究帶來(lái)了便利,并

2、且在研究和使用過(guò)程中不斷創(chuàng)新發(fā)展，擴(kuò)大了其應(yīng)用范圍。關(guān)鍵詞：成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列/成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列關(guān)聯(lián)蛋白 基因編輯 轉(zhuǎn)錄調(diào)控 基因治療 ABSTRACT: Clustered regularly interspaced short palindromic repeats /CRISPR-associated proteins (CRISPR/Cas) has been developed as a new targeted genome editing tool since the last 2 years. Because its flexible, efficient,

3、cheap and easy to operate, it quickly surpass the previous technologies to become the hottest genome editing tool.The emergence of this new gene editing tool have brought great convenience for researcher in gene function, molecular mechanisms of disease.In the process of research and use,this techno

4、logy is going through continuous innovation and development, expanding its scope of application.Key words: CRISPR/Cas genome edting transcription regulation gene therapy基因編輯技術(shù)指采用一定的方法技術(shù)對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行“編輯”，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定DNA片段的的突變，敲除、插入等改變?；蚓庉嫾夹g(shù)主要包括：化學(xué)和UV誘導(dǎo)的基因突變；DNA重組酶介導(dǎo)的基因置換；鋅指酶（ZFNs）和類(lèi)轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)因子核酸酶（TALENs）基因編輯系統(tǒng)，以及20

5、13年問(wèn)世的以gRNA為向?qū)У腃RISPR/Cas系統(tǒng)1。CRISPR/Cas系統(tǒng)的組成CRISPR/Cas系統(tǒng)最初在細(xì)菌中被發(fā)現(xiàn)，是細(xì)菌體內(nèi)重要的適應(yīng)性免疫的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，幫助細(xì)菌抵抗病毒和噬菌體。細(xì)菌體內(nèi)的CRISPR/Cas系統(tǒng)包括介導(dǎo)DNA識(shí)別的CRISPR RNA(crRNA)，和介導(dǎo)DNA切割的Cas核酸酶。典型的CRISPR基因主要由Cas基因家族和CRISPR序列原件構(gòu)成。CRISPR序列是高度保守的一段序列，由嚴(yán)格保守的21-48bp的重復(fù)序列（repeats）和高度可變的間隔物序列（Spacers）交相間隔組成。CRISPR基因的典型結(jié)構(gòu) 目前，主要鑒定發(fā)現(xiàn)了三種CRISPR/

6、Cas系統(tǒng)，而Type是最常見(jiàn)最常用的一種CRISPR/Cas系統(tǒng)，該系統(tǒng)發(fā)揮作用只需要一種Cas蛋白Cas9。通過(guò)晶體結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)2，Cas9蛋白主要包含有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，分別是發(fā)揮識(shí)別功能的REC結(jié)構(gòu)域，發(fā)揮剪切功能的NUC結(jié)構(gòu)域。其中NUC結(jié)構(gòu)域又由RuvC, HNH 和 PAM-interacting (PI)組成，當(dāng)RuvC和HNH同時(shí)發(fā)揮切割作用時(shí)，就可以形成DNA的雙鏈斷裂（DSB）。CRISPR/Cas9技術(shù)的發(fā)展利用CRISPR/Cas9技術(shù)，通過(guò)設(shè)計(jì)特異性的sgRNA，可以實(shí)現(xiàn)特異性的DNA識(shí)別，并且在靶向位置完成切割，再通過(guò)細(xì)胞本身的DNA修復(fù)機(jī)制，完成斷裂處的修復(fù)，從而實(shí)現(xiàn)

7、目標(biāo)基因的“編輯”。隨著CRISPR/Cas9技術(shù)的廣泛應(yīng)用和研究的深入，從經(jīng)典的CRISPR/Cas9技術(shù)中也衍生出了各種更為精準(zhǔn)有效的應(yīng)用技術(shù)。通過(guò)修飾改變Cas9的功能結(jié)構(gòu)域，完成了對(duì)CRISPR/Cas9技術(shù)的一次次創(chuàng)新。Cas9切口酶（Cas9 nikase, Cas9n） 將Cas9蛋白的NUC結(jié)構(gòu)域（切割域）中RuvC或HNH任意一個(gè)切割結(jié)構(gòu)位點(diǎn)誘導(dǎo)突變，使其失去切割DNA的活性，這樣的Cas9蛋白就稱(chēng)為Cas9切口酶（Cas9 nikase, Cas9n）。Cas9n由于其中一個(gè)切割活性位點(diǎn)發(fā)生突變，就不能完成DNA的雙鏈切割，只能切割DNA的一條鏈，形成單鏈斷裂（SSB）。如

8、果將Cas9n和兩條不同的sgRNA聯(lián)合使用，就可以形成交錯(cuò)的雙鏈斷裂（DSB），再激活DNA的修復(fù)機(jī)制。這種斷裂方式能夠進(jìn)一步提高CRISPR/Cas9系統(tǒng)的特異性和效率，有著深遠(yuǎn)的意義和應(yīng)用潛力3。失活Cas9（Dead Cas9，dCas9）將Cas9蛋白的NUC結(jié)構(gòu)域（切割域）中RuvC和HNH兩個(gè)切割結(jié)構(gòu)位點(diǎn)都誘導(dǎo)突變，獲得的Cas9蛋白失去了切割DNA的活性，這種Cas9蛋白稱(chēng)為失活Cas9（Dead Cas9，dCas9）。dCas9與sgRNA組成的復(fù)合物可以靶向地結(jié)合到目標(biāo)DNA位點(diǎn)，但不能發(fā)揮切割、“編輯”的功能，僅僅只起到“識(shí)別”的作用。這種dCas9-sgRNA復(fù)合體，

9、可以起到“干擾”基因表達(dá)的作用。因?yàn)閐Cas9蛋白的結(jié)合，影響了基因的表達(dá)，或者誘導(dǎo)了目標(biāo)基因的沉默，所以這種系統(tǒng)也稱(chēng)為CRISPR/Cas9 inference（CRISPRi）4。除了抑制作用以外，dCas9也可發(fā)揮激活基因表達(dá)的作用。這種功能通過(guò)某種“激活物”（activitor）（如VP16，VP64）5與dCas9結(jié)合而實(shí)現(xiàn)。dCas9通過(guò)與一些效應(yīng)酶或者效應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，從而發(fā)揮抑制或激活基因表達(dá)的作用，這種功能在表觀(guān)遺傳學(xué)，癌癥，神經(jīng)失調(diào)等研究領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用潛能。光激活Cas9（Light-activated Cas9） Cas9蛋白上的賴(lài)氨酸殘基是制動(dòng)CRISPR/Cas9

10、系統(tǒng)的的重要位點(diǎn)，賴(lài)氨酸的暴露能夠抑制CRISPR/Cas9系統(tǒng)的作用發(fā)揮。其中，Cas9蛋白上的163位賴(lài)氨酸和886位賴(lài)氨酸能夠在光的調(diào)控下影響CRISPR/Cas9系統(tǒng)的功能6。光激活CRISPR/Cas9系統(tǒng)含有兩種融合蛋白：（1）CIb1，與Cas9蛋白融合，起到靶向基因組序列的作用；（2）CRY2，一種光敏蛋白，含有一段光解酶的同源區(qū)域。當(dāng)受到藍(lán)光刺激時(shí)，CRY2與CIb1異源二聚化，Cas9-CIb1就會(huì)大量募集到靶位點(diǎn)，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用7。這種光激活CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以受到藍(lán)光照射的調(diào)控，在時(shí)間上或空間上特異性地發(fā)揮基因編輯的作用。CRISPR/Cas9技術(shù)的應(yīng)用一基

11、因編輯（Genome editing）CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)在生物工程與生物醫(yī)學(xué)方面有廣泛的應(yīng)用， 例如: 可快速建立基因突變的動(dòng)物或細(xì)胞模型，從而揭示遺傳變異或表觀(guān)遺傳變異與生物功能或疾病之間的關(guān)系; 可作為新的作物育種技術(shù)，實(shí)現(xiàn)抗極端環(huán)境、 病蟲(chóng)害以及無(wú)外源 DNA 殘留的重要農(nóng)作物的快速獲得; 還可在藻類(lèi)或玉米中直接導(dǎo)入有效的乙醇合成代謝途徑， 獲得可持續(xù)生產(chǎn)的低成本生物燃料; 還可利用基因組編輯改造細(xì)菌細(xì)胞工廠(chǎng)， 生產(chǎn)大宗化學(xué)品與精細(xì)化學(xué)品如藥品前體等8。近些年最為振奮人心的研究結(jié)果莫過(guò)于利用CRISPR/Cas9技術(shù)在人類(lèi)細(xì)胞中阻斷了HIV-1的感染9。這意味

12、著CRISPR/Cas9技術(shù)是我們用于攻克人類(lèi)復(fù)雜疾病、重大疾病的有利工具。轉(zhuǎn)錄調(diào)控 除了基因編輯，CRISPR/Cas還被用于調(diào)控內(nèi)源基因的表達(dá)。CRISPR干涉(CRISPR interference, CRISPRi)技術(shù)4，能夠在不改變 DNA序列的情況下可逆抑制目的基因的表達(dá)，其原理是在 gRNA引導(dǎo)下 dCas9定向結(jié)合到 DNA 上，對(duì) RNA 聚合酶復(fù)合體產(chǎn)生位阻效應(yīng)，干擾轉(zhuǎn)錄延伸從而降低基因轉(zhuǎn)錄水平。表觀(guān)遺傳調(diào)控表觀(guān)遺傳修飾在生物生長(zhǎng)發(fā)育和遺傳過(guò)程中扮演著重要角色。DNA甲基化或組蛋白乙酰化是表觀(guān)遺傳的標(biāo)記，由一系列的酶調(diào)控。將dCas9 與組蛋白修飾因子和DNA 甲基化相關(guān)

13、蛋白融合，能在特定位點(diǎn)人為添加或去除表觀(guān)遺傳標(biāo)記，這將為研究表觀(guān)遺傳學(xué)修飾在調(diào)控基因網(wǎng)絡(luò)中的作用提供一個(gè)更靈活的平臺(tái)。RNA編輯除了編輯雙鏈的DNA，CRISPR/Cas9也可用于編輯單鏈的RNA序列10。編輯RNA的CRISPR/Cas9系統(tǒng)由PAMmer，ssRNA，gRNA,Cas9蛋白組成。PAMmer與PAM的功能一樣，能被Cas9特異性識(shí)別并指導(dǎo)Cas9結(jié)合并切割ssRNA。因?yàn)镽NA比DNA具有更多的功能，所以用于編輯單鏈的RNA序列的CRISPR/Cas9系統(tǒng)具有更為靈活和廣泛的用途。CRISPR/Cas9的倫理和技術(shù)挑戰(zhàn) 盡管CRISPR/Cas9技術(shù)為生命科學(xué)領(lǐng)域研究帶來(lái)了

14、很大的便利和提高了工作效率，但是伴隨其產(chǎn)生的一些倫理和生物安全問(wèn)題也必須得要引起我們高度的重視。 CRISPR/Cas9技術(shù)介導(dǎo)的疾病治療面臨的最大問(wèn)題是脫靶現(xiàn)象，我們不希望在治好了一種疾病的同時(shí)，卻帶來(lái)了另外一個(gè)問(wèn)題。然而，新的全基因組高通量測(cè)序技術(shù)，結(jié)合干細(xì)胞技術(shù)，使得在基因治療過(guò)程中通過(guò)全基因組測(cè)序的手段來(lái)挑選特定位點(diǎn)被修復(fù)，而其他位點(diǎn)又未發(fā)生非特異編輯的細(xì)胞系來(lái)進(jìn)行進(jìn)一步的應(yīng)用成為可能，從而消除人們對(duì)干細(xì)胞中基因組編輯的安全性的擔(dān)憂(yōu)11。 短短的幾年，由在細(xì)菌和古細(xì)菌等原核生物中發(fā)現(xiàn)的遺傳物質(zhì)靶向編輯系統(tǒng)演變而來(lái)的 CRISPR/Cas9 技術(shù)取得了令人欣喜的發(fā)展，使得研究人員能快速地

15、對(duì)遺傳物質(zhì)進(jìn)行隨心所欲地操作或修飾，與成熟的 ZFN 和 TALEN 等基因靶向編輯系統(tǒng)相比，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)具有得天獨(dú)厚的優(yōu)越性，如構(gòu)建簡(jiǎn)單、方便、快捷，安全性高、毒性小等。相信基于 Cas9 的基因編輯工具極有可能是未來(lái)進(jìn)行精確和高效的基因修飾的解決辦法，在臨床治療、基礎(chǔ)理論研究和農(nóng)牧漁業(yè)等領(lǐng)域必將發(fā)揮巨大的作用，并且將會(huì)對(duì)分子生物學(xué)研究和基因治療領(lǐng)域產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。參考文獻(xiàn)：1 Mali P, Yang L, Esvelt K M, et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9.J. Science, 2013, 33

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