免疫電泳技術(shù)

1、丄、免疫電泳技術(shù)的發(fā)展二、免疫電泳技術(shù)的相關(guān)概念1、介紹幾種經(jīng)典的免疫電泳技術(shù)（重點(diǎn)）四、凝膠免疫電泳技術(shù)要點(diǎn)五、免疫增殖性疾病及免疫檢測一、免疫電泳技術(shù)的發(fā)展1953年Grabar和Williams將凝膠擴(kuò)散置于直流電場中，讓電流來加速抗原與抗體的擴(kuò)散并規(guī)定其運(yùn)動(dòng)方向，并與免疫沉淀反應(yīng)相結(jié)合,從而加快了沉淀反應(yīng)的速度，建立了免疫電泳技術(shù)，之后又衍生出對(duì)流免疫電泳、火箭電泳、及免疫固定電泳等新方法。2.2.二、免疫電泳技術(shù)的相關(guān)概念（一）免疫電泳技術(shù)的定義瓊脂電泳與免疫擴(kuò)散沉淀技術(shù)相結(jié)合的一門技術(shù)。1.電泳優(yōu)點(diǎn)免疫電泳時(shí)分析immunoelectrophoresis（1）將蛋白電泳分開（2）加

2、快反應(yīng)速度y沉淀反應(yīng)(二)電泳的基本原理及其影響因素基本原理電泳(electrophoresis):帶電顆粒在電場中通過液體介質(zhì)的移動(dòng)，稱為電泳。蛋白質(zhì)具有可解離的酸性和堿性基團(tuán)，在一定PH值條件下，使蛋白質(zhì)分子帶正電荷或負(fù)電荷。在電場中，帶正電荷的粒子向負(fù)極移動(dòng)，而帶負(fù)電荷的粒子向正極移動(dòng)，由于各種蛋白質(zhì)遷移率不同而分為不同的區(qū)帶。II.電泳的影響因素1顆粒（蛋白）本身特性：兩性、大小、形狀2載體性質(zhì)：最常用的載體是瓊脂和瓊脂糖凝膠3；電場強(qiáng)度溶液PH值及離子強(qiáng)度緩沖液的作用最適電泳緩沖液0.05M,PH8.6巴比妥緩沖液電滲（主要與載體特性有關(guān)）電滲定./電滲方向號(hào)電泳坍的翼*I/j電泳遷

3、移率：指在同一電場條件下，各種帶電（粒子在單位時(shí)間內(nèi)移動(dòng)的距離。電源三、介紹幾種經(jīng)典的免疫電泳技術(shù)定戈：區(qū)帶電泳+免疫雙擴(kuò)散(K)基本原理:在電場作用下，將標(biāo)本于瓊脂凝膠中進(jìn)行區(qū)帶電泳，電泳結(jié)束后，于瓊脂板旁挖一長形槽，加入相應(yīng)抗血清，抗體呈直線擴(kuò)散，電泳分離后的各種抗原呈放射狀擴(kuò)散，反應(yīng)生成弧狀沉淀線。Ag+Ag2址梢內(nèi)加入血清1抗原的分離將蛋白質(zhì)抗原在瓊脂平板上進(jìn)行電泳，使不同的抗原彼此分離。撤去電壓，在與電泳方向平行的瓊脂扌槽并加入相應(yīng)抗體進(jìn)行雙向免疫分散。分離成區(qū)帶的各種抗原成分與相應(yīng)抗體在瓊脂中擴(kuò)散后相遇，在二者比例合適處形成弧形沉淀線O即可對(duì)樣品中所含成分及其性質(zhì)進(jìn)行分析、鑒定。(

4、K)/點(diǎn)樣.電泳、分區(qū)帶在載體上挖槽加Ab血清、孵育出現(xiàn)肉眼可見的沉淀技術(shù)評(píng)價(jià):*結(jié)果復(fù)雜（經(jīng)驗(yàn)判斷）*可不生成沉淀線（濃度太高或太低），或沉淀線重合結(jié)查分析(K)由量及單克隆性與沉淀線致密度關(guān)系Ig量與抗體槽距離之間的關(guān)系:抗原抗體最適比關(guān)系應(yīng)用:血清蛋白的分析，如多發(fā)性骨髓瘤、r球蛋白缺之癥ffipH8.0)pI汎讖2對(duì)流免疫電泳定義:定向加速度的免疫雙擴(kuò)散技術(shù)（K）電滲：指在電場中液體對(duì)于一個(gè)固定介質(zhì)的相對(duì)移動(dòng)。在pH&O的緩沖液中，蛋白質(zhì)抗原帶負(fù)電荷向正極泳動(dòng)；而抗體Ig由于分子量大，暴露的極性基團(tuán)較少，在離子瓊脂中泳動(dòng)緩慢，同時(shí)受電滲作用的影響向負(fù)極泳動(dòng)在抗原抗體相遇的最適比例處形成

5、乳白色沉淀線。對(duì)流免疫電泳操作步驟:Ab瓊脂pH8.0Ag瓊脂pH8.0沉淀線X肚丄制瓊脂板T打孔T加樣電泳出現(xiàn)沉淀線-洗滌、染色、分析結(jié)果技術(shù)評(píng)價(jià):高電滲為特點(diǎn),但電滲連強(qiáng)會(huì)使蛋白質(zhì)向陰極移動(dòng)(K)*對(duì)流免疫電泳簡便、快速、敏感度較高務(wù)抗原、抗體比例要親嚴(yán)格II抗原或抗體PI相近或遷移率非常接近，不宜做對(duì)流免疫電泳應(yīng)用:可用于乙肝病人血清鑒定；甲胎蛋白的測定，但近年多以ELISA替代。3.火箭免疫電泳宅義:加速度的單向擴(kuò)散(J)火箭基本原理:瓊脂凝膠中的抗體不發(fā)生移動(dòng)(K),樣品孔中的抗原向正極泳動(dòng)，隨抗原含量的逐漸減少，抗原泳動(dòng)的基底區(qū)越來越窄，抗原抗體分子復(fù)合物形成的沉淀線逐漸變窄，形成

6、一個(gè)狀如火箭的不溶性免疫復(fù)合物沉淀峰?；鸺庖唠娪静僮鞑襟E:制備含抗體的瓊脂板(K)f打孔T加樣f電泳T出現(xiàn)火箭形沉淀線T洗滌、染色、分析結(jié)果火箭免疫電泳的定量測定吟峰高濃度標(biāo)準(zhǔn)”曲線:以不同稀釋度標(biāo)準(zhǔn)抗原泳動(dòng)后形成的沉淀峰為縱坐標(biāo),抗原濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品的沉淀峰長度即可計(jì)算出待測抗原的含量O唯一的定量方法(K)電滲小電泳終點(diǎn)時(shí)間較應(yīng)掌握開啟小電流后再加樣，否則形冷、成寬底峰/IgG電泳應(yīng)先將其甲?；?，使只帶負(fù)電荷:PH8.6時(shí)，分析蛋白質(zhì)抗原帶有負(fù)電荷:免球測定應(yīng)先甲?；?，以增加其凈負(fù)電荷量大多數(shù)蛋白質(zhì)均可用這一方法進(jìn)行測定，但目前已被敏感度高，特異性好的ELISA等方法代

7、替。(IgA九型5免疫固定電泳(K)(immunoOxationelectrophoresis。IFE)基本原理:將抗血清直接加于電泳后蛋白質(zhì)區(qū)帶表面，抗原與對(duì)應(yīng)抗體直接發(fā)生沉淀反應(yīng)，未結(jié)合的游離抗原或抗體洗去，則岀現(xiàn)被結(jié)合而固定的某種蛋白。海倫娜免疫固定儀應(yīng)用廠*免疫固定蛀泳最常用于M總帥鑒定。I鑒定方法：先將患者血清在瓊脂上等作區(qū)帶電泳，之后，加抗血清，依次加抗IgG、抗IgA、抗IgM抗K輕鏈和抗L輕鏈。必要時(shí)還可加抗Fab、抗Fc等特殊抗血清，作用后，洗滌，染色后分析固定的M蛋白成分。該方法可用于各種蛋白水平的定性檢測。電泳載體的選擇與電泳要求的具體條件如摩擦力/電滲、及電泳物質(zhì)分子量

8、大小等決定。凝膠打孔及處理用打孔器在凝膠板上打孔后，要用瓊脂溶液封底，以免樣品滲漏。加樣/加樣時(shí)瓊膚板應(yīng)先通上微翕電流，以免樣品過多自由擴(kuò)散。選擇抗原與抗體比例適當(dāng)比例抗原抗體反應(yīng)生成大的免疫復(fù)合物,選擇抗原和抗體的比例盡量減少前后帶現(xiàn)象的發(fā)生。y護(hù)檢測方法如果沉淀鏈理想，通訥目響察即可為性。/在一些定量測定中，直往輔曲以下方法來提高檢測的敏感度。染色光密度測定法放射性自顯影6干燥與保存除鹽及游離蛋白質(zhì)后，干燥/保存將染色片浸泡在5%10%甘油中30min,保存效果更好。五、免疫增殖性疾病及免疫檢測（重點(diǎn):免疫增殖病淋巴細(xì)胞異常增殖r良性增殖：常多克隆增殖免疫球蛋白異常增生性疾?。{細(xì)胞異常增

9、殖）惡性增殖：常單克隆增殖免疫球蛋白惡性增生性疾病的免疫損傷1.免疫球蛋白合成異常，血液粘稠增加2.正常體液免疫抑制/-/%免疫球蛋白或其片段可以沉積于組織，激活細(xì)胞免疫或補(bǔ)體系統(tǒng)，造成器官損傷漿細(xì)胞瘤的浸潤性生長，溶骨性病變介紹幾種免疫球蛋白異常增生性疾病芋多發(fā)性骨髓瘤（MM）貧血骨痛腎功損害免疫功能障礙高粘血癥血M蛋白或尿本周蛋白正常的免疫球蛋白含量明顯降低骨髓發(fā)現(xiàn)大量漿細(xì)胞J溶骨性損害檢測方法：火箭和對(duì)流用于檢測有無抗體，檢測MM效果不好(K)1.血清蛋白電泳M蛋白2.尿本周氏蛋白檢測免疫球蛋白及輕、重鏈定量3.免疫檢測方法免疫固定電泳免疫固定電泳免疫球蛋白定量Case1IgGKappamonoclonalgammopathyIgquantitationsbyRID:IgG3524mg/dLIgAV40mg/dLIgM20mg/dL巨球蛋白血癥好發(fā)于若錚性./臨床特劇淋巴對(duì)、肝論腫大/IlL舖滯過高綜#特點(diǎn)/.r血igM蛋白ttI.檢查特花III其它免疫球蛋白常在正常范圍嚴(yán)7重鏈?。褐劓湹牟煌煞譃檠拘?、CC型、卩型臨床特點(diǎn)N淋巴結(jié)腫大細(xì)菌感染r重鏈ItI正常的免疫球蛋白含量可降低免疫球蛋白水平可降低或正常輕鏈病：K型、九型（此型預(yù)后