臨床免疫學與檢驗：第二十二章 免疫細胞的分離與檢測

1、第二十二章 免疫細胞的分離與檢測（ Separate and assay of immunity cell）免疫細胞是指參與免疫應答或與免疫應答有關的細胞，主要包括淋巴細胞、單核-巨噬細胞、樹突狀細胞、各種粒細胞、紅細胞和肥大細胞等。 根據(jù)各類免疫細胞獨特的表面標志及其特殊功能。用體外或體內方法將各種參與免疫反應的細胞從血液或臟器中分離出來，對其進行數(shù)量和功能測定，是觀察機體免疫狀態(tài)的一種重要手段,也是細胞生物學、免疫學中進行細胞分離、培養(yǎng)和建立細胞株等研究的重要基本技術之一。第一節(jié) 免疫細胞的分離與純化白細胞的分離外周血單個核細胞的分離淋巴細胞的純化與亞群分離吞噬細胞的分離白細胞的分離血中紅

2、細胞和白細胞的比例約為6001000:1，兩類細胞密度不同，其沉降速度各異，通常用以下兩種方法分離。1自然沉降法是利用血細胞自然沉降率的分離方法。采集外周靜脈血，肝素抗凝，將含抗凝血的試管直立靜置室溫3060min后，由于紅細胞沉降速率較快，可使白細胞與之分離。上層為淡黃色血漿，底層為紅細胞，緊貼紅細胞層上面的灰白層為白細胞。吸取富含白細胞的細胞群，離心洗滌后加入少量蒸餾水或含氯化銨的Gey溶液，經短時間的低滲處理，使紅細胞裂解，經過反復洗滌可得純度較高的白細胞懸液。 2聚合物加速沉降法某些高分子聚合物如明膠、右旋糖酐、甲基纖維素和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等可使紅細胞凝集成串，加速紅細胞沉降，

3、使之更易與白細胞分離。此法白細胞獲得率比自然沉降法高，但其中的明膠法可使白細胞粘性增加，對實驗產生一定影響。 二、外周血單個核細胞的分離外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)主要指淋巴細胞和單核細胞，是免疫學實驗中最常用的細胞群，也是進行T細胞和B細胞分離純化的重要環(huán)節(jié)。PBMC的密度與血液中的其他成分不同。血小板的密度為1.0301.035，粒細胞為1.092，紅細胞為1.093，淋巴細胞和單核細胞的密度為1.0751.090。利用一種密度介于1.0751.092之間、近于等滲的溶液(分層液)進行密度梯度離心，可使不同類別的血細胞按

4、其相應密度分布，從而被分離。常用的分層液有聚蔗糖-泛影葡胺分層液法和Percoll分層液法兩種。(一)聚蔗糖-泛影葡胺分層液法聚蔗糖-泛影葡胺(ficoll-hypaque,F-H)分層液法是分離PBMC一種單次密度梯度離心分離法。 (二)Percoll分層液法Percoll是經過聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrolidone,PVP)處理的硅膠顆?；鞈乙?，對細胞無毒性和刺激性。Percoll混懸液的硅膠顆粒大小不一，經過高速離心后，可形成一個連續(xù)密度梯度，將密度不同的細胞分離純化。三、淋巴細胞的純化與亞群分離PBMC懸液主要含淋巴細胞，但一般還混雜有數(shù)量不等的單核細胞及少量粒細胞、

5、紅細胞和血小板。為獲得高純度的淋巴細胞或其亞群，可采用如下分離去除方法。(一)紅細胞的去除一般采用無菌蒸餾水低滲裂解法或0.83%氯化銨處理法。(二)血小板的去除將PBMC懸液通過離心洗滌23次，?？扇コ齈BMC中絕大部分混雜的血小板。在某些疾病狀態(tài)下，若外周血中血小板數(shù)量異常增多，可采用胎牛血清(FCS)梯度離心法去除PBMC中混雜的血小板 。(三)單核細胞和粒細胞的去除1粘附去除法 單核細胞和粒細胞具有粘附玻璃、塑料和葡聚糖凝膠的特性，通過PBMC與玻璃或塑料平皿的粘附作用，采集的非粘附細胞即為淋巴細胞。亦可應用玻璃纖維或葡聚糖凝膠Sephadex G-10柱，清除粘附的細胞，洗脫液中主要

6、是淋巴細胞。此法簡便易行，對細胞損傷極少，缺點是B細胞也有較弱的粘附能力，因此有部分B細胞丟失。該法去除單核細胞后，大約95%的單個核細胞為淋巴細胞，活性大于95%。2羰基鐵粉吞噬法 單核細胞具有吞噬羰基鐵粉的能力，吞噬羰基鐵粉后的單核細胞密度增大，再經聚蔗糖-泛影葡胺分層液密度梯度離心后，則單核細胞沉積于管底而被去除。也可在單核細胞懸液內加入羰基鐵粉顆粒，待單核細胞充分吞噬羰基鐵粉后，用磁鐵將細胞吸至管底，上層液中即含較純的淋巴細胞。3苯丙氨酸甲酯去除法 苯丙氨酸甲酯(PME)具有親溶酶體性質，能滲入細胞溶酶體內被水解為游離氨基酸，導致溶酶體內因滲透壓改變而破裂，釋放出的酶類物質可引起細胞溶

7、解。用該法可溶解含溶酶體的細胞，如單核細胞、粒細胞和成纖維母細胞等，B細胞和大多數(shù)T細胞因缺乏溶酶體酶，因而不受影響。該法去除單核細胞后，約99%的單個核細胞為淋巴細胞，活性大于95%。(四)淋巴細胞亞群的分離淋巴細胞是復雜的不均一的細胞群體，它包括了許多形態(tài)相似而表面標志和功能各異的細胞群和亞群。根據(jù)細胞的表面標志和功能等不同，借助多種方法分離淋巴細胞亞群。1E花環(huán)分離法成熟的T細胞表面表達綿羊紅細胞(SRBC)受體，即E受體。T細胞能與SRBC結合形成E花環(huán)，而B細胞則不能。該方法簡便易行，所獲細胞的純度可達95%99%，可同時獲得B細胞。缺點是E花環(huán)形成后可能使T細胞活化。 2尼龍棉柱分

8、離法將淋巴細胞懸液加入尼龍棉柱內，B細胞易粘附于尼龍棉纖維(聚酰胺纖維)表面，而T細胞則不易粘附，由此可將T細胞與B細胞分離。 該法簡便易行，不需特殊儀器，淋巴細胞活性不受影響，所獲T細胞純度可達90%以上，B細胞純度可達80%。 3親和板結合分離法分為直接法和間接法。直接法是用特異性抗體包被塑料平皿或細胞培養(yǎng)板，表達特定膜抗原的細胞即與相應抗體結合而被吸附于平皿或培養(yǎng)板表面，懸液中為不表達特定膜抗原的細胞(見圖24-3)。間接法是用羊(或兔)抗鼠IgG抗體(第二抗體)包被平皿，將預先與特異性單克隆抗體結合的淋巴細胞與之反應后，可發(fā)生吸附固定，從而被分離。 4免疫磁珠分離法包括直接法和間接法。

9、直接法是將特異性抗體與磁性微粒(平均直徑小于1.5m)交聯(lián)，形成免疫磁珠(IMB)。IMB與表達相應膜抗原的細胞結合，用強磁場分離磁珠結合細胞與磁珠非結合細胞，從而對特定細胞進行陽性或陰性分選。間接法是用羊(或兔)抗鼠IgG抗體(第二抗體)包被磁性微珠，可與任何已結合鼠源性單克隆抗體(第一抗體)的細胞發(fā)生反應，從而對細胞進行分離。 5流式細胞術分離法用流式細胞儀可自動化地對單個細胞進行多參數(shù)定量測定分析，從而可分選出用特異性熒光抗體標記的陽性細胞。其優(yōu)點是分離細胞準確、快速，純度達90%100%，回收率高，所分離的細胞可保持無菌，細胞結構和生物學活性不受影響。缺點是費用昂貴，擬分離的細胞在混合

10、群體中含量過低時，耗時較長才能獲得所需數(shù)量細胞。四、 吞噬細胞的分離體內具有吞噬功能的細胞群按其形態(tài)的大小分為兩類：一類為大吞噬細胞，即血液中的單核細胞和組織中的巨噬細胞；另一類為小吞噬細胞，即中性粒細胞。這兩類細胞在形態(tài)上各具特征，其分類和計數(shù)對診斷大多數(shù)感染性疾病具有重要參考價值。1單核細胞的分離用Percoll分層液法或粘附去除法可獲取人外周血單核細胞，但所獲得的細胞數(shù)量較少。2巨噬細胞的分離用斑蟊敷貼法可從人體組織滲出液中獲取巨噬細胞。用斑蟊乙醇浸液刺激前臂內側皮膚，誘發(fā)無菌性皮炎，從皮泡滲出液中可獲取來自皮下組織中的巨噬細胞。該法獲取的巨噬細胞數(shù)量較多且純度較高，但對皮膚有一定損傷，

11、有時可引起局部感染，應慎用。第二節(jié) 淋巴細胞的數(shù)量檢測（ Assay of the lymphocyte quantity）不同的淋巴細胞表面具有特定的表面標志，借此可以對不同的淋巴細胞及其亞群進行鑒定和計數(shù)。一、T細胞數(shù)量檢測間接熒光免疫法酶免疫組織化學法 微量細胞毒試驗 花環(huán)試驗 間接熒光免疫法間接熒光免疫法是通過檢測T細胞表面的CD抗原來了解外周血T細胞數(shù)量和亞群的變化。 方法：分離PBMC,分別與鼠抗人CD3、CD4和CD8的單克隆抗體進行結合，再用熒光素標記的羊(或兔)抗鼠IgG作為第二抗體，借助單克隆抗體的介導與PBMC結合，在熒光顯微鏡下觀察結果，細胞膜上呈現(xiàn)特異性熒光的細胞即為

12、陽性細胞。計數(shù)100200個淋巴細胞，根據(jù)陽性細胞確定T細胞及其亞群的百分率。 外周血T細胞及其亞群的平均正常值為: CD3+T細胞60%80%，CD4+T細胞55%60%，CD8+T細胞20%30%，CD4+T細胞與CD8+T細胞的比值約為2:1。如有條件，細胞經熒光抗體著染后，可用流式細胞儀自動計數(shù)，快速而準確。酶免疫組織化學法目前常用于鑒定T細胞和亞群的酶免疫組織化學法有ABC法和APAAP法。1.ABC法將親合素與酶標生物素反應形成復合物(avidin-biotin-peroxidase complex,ABC)，再與生物素化的第二抗體反應，借助T細胞的CD單克隆抗體介導和酶催化底物的

13、作用，可使T細胞著色。通過計數(shù)著色的陽性細胞數(shù)，可以確定T細胞及其亞群的百分率。2APAAP法分離PBMC,分別與鼠抗人CD3、CD4、和CD8的單克隆抗體反應，用兔抗鼠IgG起搭橋作用，其中一個Fab段連接抗T細胞單克隆抗體，另一個Fab段連接堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶(APAAP)復合物，再通過復合物中的堿性磷酸酶(AP)催化底物顯色來判斷CD抗原的存在，從而確定T細胞及其亞群的百分率。微量細胞毒試驗 針對淋巴細胞CD分子的單克隆抗體與淋巴細胞相應的CD分子結合，借助補體依賴的細胞毒作用，可造成表達特定表面抗原的細胞損傷，破壞膜的完整性，應用伊紅染料滲入細胞內，使之著染紅色，而無相應CD分子

14、的細胞則不受損傷，因而不著色。在高倍鏡下計數(shù)死亡數(shù)，即可判斷待檢細胞是否具有相應的CD分子，從而確定T細胞及其亞群。花環(huán)試驗 E花環(huán)試驗葡萄球菌花環(huán)法花環(huán)技術抗體致敏細胞花環(huán)法 1E花環(huán)試驗(erythrocyte rosette test) T細胞表面有特異性綿羊紅細胞 (SRBC) 受體，即E受體。將T細胞與SRBC按一定比例混勻，置4至少2h或過夜，T細胞表面的E受體能與SRBC結合形成以T細胞為中心，四周環(huán)繞SRBC的花環(huán)樣結構（圖24-5 ），鏡檢計數(shù)可得總花環(huán)(Et)形成率，亦即T細胞的百分率。 如減少淋巴細胞與SRBC的比例，兩者混合后，經短時間后即行涂片染色，仍可見部分淋巴細胞

15、形成花環(huán)，稱為活性E(Ea)花環(huán)，它可能代表T細胞的一個亞群，Ea花環(huán)正常值僅為Et花環(huán)的1/31/2，約20%40%。檢測Ea花環(huán)形成細胞比Et花環(huán)形成細胞更能反映受檢者的細胞免疫水平。 2葡萄球菌花環(huán)法花環(huán)技術葡萄球菌蛋白A(SPA)可與多種動物的IgGFc段結合而不影響抗體的活性。應用金黃色葡萄球菌結合單克隆抗體(直接法)或兔抗鼠IgG抗體(間接法)，所形成的SPA-IgG復合物可與表達相應膜抗原的細胞結合，使金黃色葡萄球菌被動吸附在細胞周圍形成花環(huán)狀。通過計數(shù)花環(huán)形成細胞百分率，從而確定T淋巴細胞及其亞群的數(shù)量。 3抗體致敏細胞花環(huán)法采用戊二醛交聯(lián)技術將單克隆抗體或兔抗鼠IgG與SRB

16、C結合，制成致敏的SRBC?？贵w致敏的SRBC可與T淋巴細胞直接或間接結合，在T淋巴細胞周圍形成花環(huán)。通過計數(shù)花環(huán)形成率，從而確定T淋巴細胞及其亞群的百分率。二、B細胞數(shù)量檢測B細胞表面有：膜表面免疫球蛋白(SmIg)、CD抗原、Fc受體、補體受體、EB病毒受體和小鼠紅細胞受體等標志，據(jù)此可對B細胞進行數(shù)量檢測。1SmIg的檢測SmIg為B細胞所特有，是鑒定B細胞的可靠指標。大多采用熒光素或酶標記的抗人Ig抗體通過直接熒光免疫法或酶免疫組織化學法檢測SmIg，正常人外周血中SmIg+細胞一般為8%12%。2CD抗原檢測B細胞表面抗原有CD19、CD20、CD21、CD22和CD29等分化抗原，

17、其中有些是全部B細胞所共有，而有些僅活化B細胞所特有，據(jù)此可用相應的系列單克隆抗體，通過間接熒光免疫法或酶免疫組織化學法加以檢測。正常成年人外周血CD20陽性細胞約占淋巴細胞總數(shù)的8%12%。3Fc受體和補體受體的檢測B細胞表面具有與IgG Fc段結合的受體，極易與抗原抗體復合物中抗體Fc 段結合，故用相應抗體致敏的紅細胞(EA)作指示物，在一定條件下，它能與帶Fc受體的B細胞形成EA花環(huán)，故稱EA花環(huán)試驗。而B細胞表面的補體受體，則能與紅細胞(E)-抗紅細胞抗體(A)-補體(C)復合物(EAC)中的補體相結合，從而建立EAC花環(huán)試驗。3.小鼠紅細胞受體的檢測部分B細胞能與小鼠紅細胞形成花環(huán)，

18、慢性B細胞白血病患者外周血淋巴細胞形成小鼠紅細胞花環(huán)率高達60%85%，但健康人該花環(huán)率僅占總淋巴細胞的5%10%，據(jù)此推知形成該花環(huán)的性能是某些B細胞亞群的標志。第三節(jié)、淋巴細胞的功能檢測（ Assay of lymphocyte faction）T細胞功能檢測 B細胞功能檢測 NK細胞活性測定一、T細胞功能檢測 T細胞增殖試驗 T細胞介導的細胞毒試驗 體內試驗（一）T細胞增殖試驗T細胞在體外受到有絲分裂原或抗原的刺激后，細胞的代謝和形態(tài)發(fā)生變化，主要表現(xiàn)為胞內蛋白質和核酸合成增加，發(fā)生一系列增殖反應，如細胞變大、胞質增多、胞質現(xiàn)空泡、核染色質疏松、核仁明顯，并轉化為淋巴母細胞（見表24-6

19、）。因此，淋巴細胞增殖反應又稱淋巴細胞母細胞轉化(lymphoblast transformation)。常用刺激物體外刺激T細胞增殖反應的刺激物包括植物血凝素 (PHA)刀豆素A(ConA)美洲商陸(PWM)白喉類毒素破傷風類毒素純化蛋白衍生物(PPD)白色念珠菌檢測T細胞增殖反應 1形態(tài)學檢查法 23H-TdR摻入法3MTT比色法 1形態(tài)學檢查法分離PBMC，與適量PHA混合，置37培養(yǎng)72h。取培養(yǎng)細胞作涂片染色，借助光學顯微鏡進行檢測。根據(jù)細胞的大小、核與胞質的比例、胞質的染色性以及有無核仁等特征(見圖24-6)，分別計數(shù)未轉化的淋巴細胞和轉化的淋巴細胞，每份標本計數(shù)200個細胞，按公

20、式計算淋巴細胞轉化率。轉化率= 轉化率在一定程度上可反映細胞免疫功能，正常人的T細胞轉化率為60%80%，小于50%可視為降低。形態(tài)學方法簡便易行，普通光學顯微鏡便能觀察結果，適于基層實驗室應用。缺點是依靠肉眼觀察形態(tài)學變化，判斷結果易受主觀因素影響，重復性和準確性較差。23H-TdR摻入法T細胞在有絲分裂原或抗原刺激下，在轉化為淋巴母細胞的過程中，DNA合成明顯增加，且其轉化程度與DNA的合成呈正相關。在終止培養(yǎng)前816h，若將3H標記的胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)加入到培養(yǎng)液中，即被轉化的淋巴細胞攝取而摻入到新合成的DNA中。培養(yǎng)結束后，用液體閃爍儀測定淋巴細胞內放射性核素量，記錄每分鐘脈

21、沖數(shù)(cpm)，計算刺激指數(shù)(stimulating index，SI)，判斷淋巴細胞的轉化程度。 PHA刺激管cpm均值 SI= 對照管cpm均值 3H-TdR摻入法敏感性高，客觀性強，重復性好，可自動操作。但需一定設備條件，受放射性核素半衰期和污染的影響 3MTT比色法MTT是一種噻唑鹽，化學名為3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四唑(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)。將淋巴細胞與絲裂原共同培養(yǎng)，在細胞培養(yǎng)終止前數(shù)小時加入MTT，混勻繼續(xù)培養(yǎng)，MTT作為細胞內線粒體琥珀酸脫氫酶的底

22、物參與反應，形成藍黑色的甲替顆粒，并沉積于細胞內或細胞周圍。甲月替可被隨后加入的鹽酸異丙醇或二甲基亞砜完全溶解，用酶標測定儀測定細胞培養(yǎng)物的A570nm值。因甲月替的生成量與細胞增殖水平呈正相關，故樣品的A570n值可反映細胞增殖水平，以刺激指數(shù) (SI) 判斷淋巴細胞增殖程度。試驗孔A570nm均值 SI=對照孔A570nm均值本方法的敏感性雖不及3H-TdR摻入法，但操作簡便，無放射性污染。 (二)T細胞介導的細胞毒試驗 T 細胞介導的細胞毒性是細胞毒性 T 細胞( CTL)的特性，凡致敏的T細胞再次遇相應的靶細胞抗原， 可表現(xiàn)出對靶細胞的破壞和溶解作用， CTL 主要通過細胞裂解和細胞凋

23、亡兩種機制殺傷靶細胞。 試驗的原則是選用適當?shù)陌屑毎?，常用可傳代的已建株的人腫瘤細胞如人肝癌細胞、食管癌、胃癌等細胞株，經培養(yǎng)后制成單個核細胞懸液，按一定比例與待檢的淋巴細胞混合，共溫一定時間，觀察腫瘤細胞被殺傷情況。1形態(tài)學檢查法 待檢細胞與相應的靶細胞(如腫瘤細胞等)混合共育后，以瑞氏染液染色，用顯微鏡計數(shù)殘留的腫瘤細胞數(shù)，通過計算淋巴細胞對腫瘤細胞生長的抑制率，判斷效應細胞的殺傷活性。251Cr釋放法用Na251CrO4標記靶細胞，若待檢細胞能殺傷靶細胞，則51Cr從靶細胞內釋放出來，用計數(shù)儀測定靶細胞釋放的51Cr放射活性。靶細胞溶解破壞越多，51Cr釋放越多，上清液的放射活性越強，通

24、過計算51Cr特異釋放率，判斷淋巴細胞的殺傷活性。3細胞凋亡檢查法形態(tài)學方法電泳法 ELISA法 TUNEL法 流式細胞術 (1)形態(tài)學方法將待檢淋巴細胞和靶細胞按比例混合，培養(yǎng)一定時間后，取培養(yǎng)物涂片，借助普通光學顯微鏡(HE染色)、熒光顯微鏡(碘化丙錠染色)或透射電鏡可對細胞進行形態(tài)學觀察，凋亡細胞表現(xiàn)為核致密濃染、核碎裂等。該法簡便、經濟，可定性，但不能定量。(2)電泳法將待檢淋巴細胞細胞和靶細胞按比例混合，培養(yǎng)一定時間后，對凋亡細胞的基因組DNA進行瓊脂糖凝膠電泳，由于內源性核酸酶的激活，DNA鏈被切割成為180200bp或其倍數(shù)的DNA片段，故在瓊脂糖電泳中呈現(xiàn)“DNA梯狀圖譜”。該

25、法簡便，可定性和定量，但無法顯示凋亡細胞形態(tài)結構。 (3) ELISA法凋亡細胞內DNA裂解產生單/低聚體核小體片段，核小體DNA與組蛋白形成緊密結合物而不被核酸內切酶裂解。采用雙抗體夾心ELISA法，應用抗組蛋白和抗DNA單克隆抗體，可特異性檢測細胞溶解物中的核小體，該法可定性和定量。(4)TUNEL法將待檢效應細胞和靶細胞按比例混合，培養(yǎng)一定時間后，取培養(yǎng)物涂片。凋亡細胞由于內源性核酸酶的激活，核DNA被切割，其每個片段均含有3-OH末端，加入末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT)和生物素標記的核苷酸(dUTP-biotin)，TdT能在3-OH末端連接上生物素標記的核苷酸，利用親合素-生物素-酶

26、放大系統(tǒng)，在DNA斷裂處顯色，可原位特異地顯示出凋亡細胞。正常細胞無DNA斷裂，則不顯色。光鏡下檢查計數(shù)凋亡細胞，可反映待檢細胞的殺傷活性。該法所用標記核苷酸多為dUTP，故稱TUNEL法(TdT dependent dUTP-biotin nick end labeling)。 該法測定凋亡細胞數(shù)目特異性強，靈敏度高，形態(tài)上尚未發(fā)生典型變化的凋亡細胞也可以早期顯示，但試劑昂貴。上述方法中也可將生物素標以熒光素，用流式細胞儀直接測定凋亡細胞數(shù)。(5)流式細胞術凋亡細胞因核斷裂，呈亞二倍體，因此可用流式細胞儀分析亞二倍體數(shù)目，指示細胞凋亡程度。流式細胞儀檢測凋亡細胞敏感性高、可自動化操作，已成為

27、研究凋亡的重要手段之一。(三)體內試驗 本試驗不僅可以檢查受試者是否對某種抗原具有特異性細胞免疫應答能力，而且可以檢查受試者總體細胞免疫狀態(tài)。目前臨床上常用于診斷某些病原微生物感染(結核、麻風等) 和細胞免疫缺陷等疾病，也常用于觀察細胞免疫功能在治療過程中的變化及判斷預后等。1特異性抗原皮膚試驗 2PHA皮膚試驗 3二硝基氯苯或二硝基氟苯皮膚試驗 二、B細胞功能檢測B細胞增殖試驗 溶血空斑試驗酶聯(lián)免疫斑點法 體內試驗 (一)B細胞增殖試驗與T細胞增殖試驗相同，但刺激物不同，小鼠B細胞可用細菌脂多糖(LPS)作為刺激物，人則用含SPA的金黃色葡萄球菌菌體及抗IgM抗體刺激。 (二)溶血空斑試驗(

28、hemolytic plaque assay)經典溶血空斑形成試驗用于檢測實驗動物抗體形成細胞的功能。將SRBC免疫的小鼠脾臟制成單個細胞懸液，與SRBC在瓊脂糖凝膠內混合傾注于小平皿或玻片上。脾細胞中的抗體生成細胞釋放抗SRBC抗體，使其周圍的SRBC致敏，在補體參與下可將SRBC溶解，形成肉眼可見的溶血空斑。每一個空斑中央含一個抗體形成細胞，空斑數(shù)目即為抗體形成細胞數(shù)。空斑大小表示抗體形成細胞產生抗體的多少。 (三)酶聯(lián)免疫斑點法(enzyme-linked immune spot ,ELISPOT)用抗原包被固相載體，加入待檢的抗體產生細胞，即可誘導抗體的分泌。分泌的抗體與包被抗原結合，

29、在抗體分泌細胞周圍形成抗原抗體復合物，使細胞吸附于載體上，加入酶標記的第二抗體與細胞上的抗體結合，通過底物顯色反應的深淺，可測定出生成的抗體量，并可在鏡下計數(shù)著色的斑點形成細胞。該方法既可檢測抗體分泌細胞，又可檢測抗體分泌量，其優(yōu)點是穩(wěn)定、特異、抗原用量少；可同時檢測不同抗原誘導的不同抗體分泌，并可定量；可檢測組織切片中分泌抗體的單個細胞。三、NK細胞活性測定NK細胞表面至少存在CD2、CD11b、CD11c、CD16、CD56和CD59等多種抗原，但均非NK細胞所特有，現(xiàn)今極少以CD系列抗原為指標鑒定和計數(shù)NK細胞，而多檢測NK細胞活性。NK細胞具有細胞介導的細胞毒作用，能直接殺傷靶細胞。測

30、定人NK細胞活性多以K562細胞株作為靶細胞，而測定小鼠NK細胞活性常采用YAC-1細胞株作為靶細胞。(一)形態(tài)學法以人PBMC或小鼠脾細胞作為效應細胞，與靶細胞按一定比例混合溫育，用臺盼藍或伊紅Y等活細胞拒染的染料處理，光鏡下觀察著染的死亡細胞，計算出靶細胞的死亡率即為NK細胞的活性。該法簡便易于掌握，但結果判斷具有一定的主觀性，也無法計數(shù)輕微損傷的細胞。 (二)酶釋放法乳酸脫氫酶(LDH) 是活細胞胞漿內含酶之一。正常情況下，LDH不能透過細胞膜。當靶細胞受到效應細胞的攻擊而損傷時，細胞膜通透性改變，LDH從胞漿中釋出。釋放出來的LDH在催化乳酸生成丙酮酸的過程中，使氧化型輔酶(NAD+)

31、變成還原型輔酶(NADH2)。后者再通過遞氫體-吩嗪二甲酯硫酸鹽(PMS)還原碘硝基氯化氮唑藍(INT) 或硝基藍四氮唑(NBT)，形成有色的甲月替類化合物，在570nm波長處有一高吸收峰，利用讀取的A值，經過計算即可得知NK細胞殺傷靶細胞的活性。 也可采用NAG酶熒光比色法測定NK細胞活性。NAG酶(N-乙酰-D-氨基己糖酶)存在于溶酶體中，當其由受損的靶細胞釋出后，可與底物作用而生成熒光物質，應用熒光光度計測定，重復性好。(三)化學發(fā)光法NK細胞殺傷靶細胞時發(fā)生呼吸爆發(fā)，產生大量活性氧自由基，包括超氧陰離子(O2-)、過氧化氫(H2O2)、羥自由基(OH-)和單態(tài)氧(1O2)等。它們與細胞

32、內某些可激發(fā)物質發(fā)生反應，產生微弱的發(fā)光現(xiàn)象。在反應體系中加入魯米諾(luminol)能起增強效應，從而使發(fā)光強度大大增強，發(fā)光強度與NK細胞活性呈正相關?；瘜W發(fā)光測定法操作簡便快速，樣品用量少，是氧化爆發(fā)檢測中最為敏感，并可直接定量的方法。(四)時間分辨熒光免疫分析法將靶細胞用鑭系元素銪(Eu3+)的螯合物標記，經與效應細胞共溫后，用時間分辨熒光分析儀檢測熒光，可除去非特異性熒光本底。本法實驗時間短，效靶細胞僅需共溫2h，檢測速度快，特異性強。(五)流式細胞術利用碘化丙啶染料排斥法，碘化丙啶(PI)只能滲透到死亡細胞內并與DNA和RNA結合，在488nm波長激發(fā)下產生綠色熒光。同時，NK細胞

33、體積及光散射特性均不同于靶細胞。據(jù)此，可用流式細胞術檢測受NK細胞作用后靶細胞的死亡率來反映NK細胞的活性。(六)放射性核素釋放法應用放射性核素51Cr或125I-UdR標記靶細胞，當靶細胞受到NK細胞攻擊后，靶細胞被破壞，釋放出放射性核素，通過測定上清和細胞部分的放射性強度(以cpm值表示)計算NK細胞活性。本法敏感性較高，結果客觀精確。缺點是靶細胞的放射性核素自然釋放率較高，51Cr半衰期短，試驗設備要求較高，并存在放射性核素污染。第一節(jié)吞噬細胞功能檢測（Assay the macrocyte faction ）吞噬細胞的吞噬運動大致分為趨化、吞噬和胞內殺傷作用三個階段，可分別對這三個階段

34、進行功能檢測。一、中性粒細胞功能檢測(一)趨化功能檢測(二)吞噬和殺菌功能測定 (一)趨化功能檢測中性粒細胞在趨化因子如微生物的細胞成分及其代謝產物、補體活性片段C5a、C3a、某些細胞因子等作用下產生趨化運動。趨化運動是整個吞噬過程的第一步，對吞噬功能影響很大。 1濾膜滲透法又稱Boyden 小室法。上室加待檢細胞，下室加趨化因子，上下室用微孔濾膜隔開。反應后，取濾膜清洗、固定、染色和透明，在高倍鏡觀察細胞穿越濾膜的移動距離，從而判斷其趨化作用。2瓊脂糖平板法將瓊脂糖溶液傾倒在玻片上制成瓊脂糖凝膠平板，在中央內孔加白細胞懸液，兩側孔內分別加趨化因子或對照液。反應后通過固定和染色，測量白細胞向

35、左側孔移動距離即趨向移動距離 (A) 和向右側孔移動的距離即自發(fā)移動距離 (B)，計算趨化指數(shù)(A/B)，判斷細胞的定向移動能力。 (二)吞噬和殺菌功能測定1顯微鏡檢查法 將白細胞與葡萄球菌或白色念珠菌懸液混合溫育，涂片，固定，堿性美蘭液染色。在油鏡下觀察靶細胞對細菌的吞噬情況，計數(shù)吞噬細菌和未吞噬細菌的白細胞數(shù)。對有吞噬作用的白細胞，應同時記錄所吞噬的細菌數(shù)。 吞噬率(%)=吞噬指數(shù)= 殺菌率(%)= 2溶菌法將白細胞懸液與經新鮮人血清調理過的細菌(大腸桿菌或金黃色葡萄球菌)按一定比例混合，溫育。每隔一定時間取定量培養(yǎng)物，稀釋后接種固體平板培養(yǎng)基。37培養(yǎng)18h后，計數(shù)生長菌落數(shù)，以了解中性粒細胞的殺菌能力。殺菌率(%)= 3NBT還原試驗中性粒細胞在吞噬殺菌過程中，能量消耗劇增，耗氧量也隨之增相應增加，磷酸己糖旁路的代謝活性增強，6-磷酸葡萄糖脫氫酶使葡萄糖的中間代謝產物6-磷酸葡萄糖氧化脫氫轉變?yōu)槲焯恰Ｈ缂尤胂趸{四氮唑 (