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文檔簡介
1、關于生物大分子物質的制備第一張,PPT共六十一頁,創(chuàng)作于2022年6月生命大分子物質通常是指: 動物、植物和微生物在進行新陳代謝時所產生的蛋白質(包括酶)和核酸等有機化合物的總稱。 生命科學研究將進入后基因組時代。分離純化和測試分析蛋白質技術顯得十分重要。 本章將以蛋白質和核酸為主線討論其制備的一般過程,即材料的選擇與處理、測定方法的確立、有效成分的抽提、粗品的純化和純品的鑒定(這部分移至后面的章節(jié)介紹)等步驟。 第二張,PPT共六十一頁,創(chuàng)作于2022年6月第一節(jié) 材料的選擇與處理 一、材料的選擇 A.有效成分 是指欲純化的某種單一的生命大分子物質。而有效成分以外的其他物質則統(tǒng)稱雜質。 第三
2、張,PPT共六十一頁,創(chuàng)作于2022年6月 B.有效成分在材料中存在的特點有效成分的含量一般較少 如胰臟中胰島素的含量小于其鮮重的百萬分之一。有效成分穩(wěn)定性較差 大多數(shù)對酸、堿、高溫和高濃度有機溶劑等因子較敏感,易被微生物分解變質。 選用的材料不同,有效成分的含量就不同; 選用的材料即使相同,但是部位或生長期不同,有效成分的含量也不盡相同。 第四張,PPT共六十一頁,創(chuàng)作于2022年6月 C.材料選擇應遵循的原則有效成分含量多、穩(wěn)定性好來源豐富、保持新鮮提取工藝簡單有綜合利用價值等 第五張,PPT共六十一頁,創(chuàng)作于2022年6月 二、材料的處理 選擇到合適的材料后,應及時使用,或采用冰凍或干燥
3、等方法處理。 同時還應將易于去掉的非需物質除去。 第六張,PPT共六十一頁,創(chuàng)作于2022年6月 1 動物臟器 (1)冰凍 應在很短時間內置-10冰庫(可短期保存)或-70低溫冰箱(數(shù)月不變質)貯存。 脫脂 脂肪容易氧化酸敗,導致原料變質,而且還會影響純化操作和制品得率。 一般脫脂的方法有: A.人工剝去臟器外的脂肪組織; B.浸泡在脂溶性的有機溶劑(如丙酮、乙醚)中脫脂; C.采用快速加熱(50左右)、快速冷卻的方法,使熔化的油滴冷卻后凝聚成油塊而被除去; D.利用油脂分離器使油脂與水溶液得以分離。第七張,PPT共六十一頁,創(chuàng)作于2022年6月 (2)干燥 A.丙酮液中脫水,干燥后磨粉貯存?zhèn)?/p>
4、用; B.在沸水中蒸煮處理,烘干后能長期保存。第八張,PPT共六十一頁,創(chuàng)作于2022年6月 2 植物組織 A.葉片 用水洗凈即可使用; 或在l0h內置-4-30冰箱貯藏備用。 B.植物種子 需泡脹或粉碎才可使用。 材料含油脂較多時,要進行脫脂處理。 第九張,PPT共六十一頁,創(chuàng)作于2022年6月 3 微生物 為制備生命大分子物質的主要材料之一。 用離心法收集到的上清液, 可用于制備胞外酶和某些輔基等有效成分; 可置低溫下短時間貯存。 收集到的菌體,經破細胞處理后則可從中提取其他有效成分; 或制成凍干粉,在4保存(數(shù)月不會變質)。第十張,PPT共六十一頁,創(chuàng)作于2022年6月第二節(jié) 確立測定方
5、法 一、目的與要求 測定哪些材料含有目標有效成分? 哪些材料含量豐富? 提純過程純度是否逐漸增加? 要確立專一、準確、靈敏和簡便的測定方法。 因為:有效成分在原材料中含量較低;底物要專一性的。第十一張,PPT共六十一頁,創(chuàng)作于2022年6月二、常用的測定方法 1.光譜法2.電化學法3.生物活性檢測法4.免疫分析法5.生物傳感器第十二張,PPT共六十一頁,創(chuàng)作于2022年6月 1 光譜法(1)吸收光譜法直接測定法;比色法(2)熒光法(3)濁度法 特點: 測定時所需的樣品量較少,但往往能產生比較高的消光值; 且操作簡單,反應迅速、靈敏; 結果也較準確, 第十三張,PPT共六十一頁,創(chuàng)作于2022年
6、6月 (1)吸收光譜法 直接測定法、比色法 直接測定法 將待測物(如核酸、蛋白質)配制成一定濃度的溶液后,移至相應波長的分光光度計中, 即可從測定的消光值換算出待測物的含量。 第十四張,PPT共六十一頁,創(chuàng)作于2022年6月 A.測定核酸含量 構成核酸的堿基組分是分光光度計測定核酸含量的依據。 在測定過程中,DNA或RNA溶液濃度的增加或降低,會使其在波長260nm的消光值(A260) 隨之增加或降低,二者之間成正比關系。第十五張,PPT共六十一頁,創(chuàng)作于2022年6月 通常1個A260值分別相當于 雙鏈DNA 50gml 單鏈DNA 37gml 單鏈RNA 40gml 用A260A280比值
7、可確定DNA和RNA的純度: 純DNA比值為1.8 純RNA的比值為2.0 當此比值分別小于1.8和2.0時,表明樣品中已污染了蛋白質或酚類等物質。 第十六張,PPT共六十一頁,創(chuàng)作于2022年6月 B.測定蛋白質的含量及純度 蛋白質(包括酶和肽)溶液的A280值主要是由構成蛋白質組分的色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)的消光值決定的,胱氨酸的貢獻很小。第十七張,PPT共六十一頁,創(chuàng)作于2022年6月 比色法 將待測物(如蛋白質、核酸、糖類)與相關試劑(見表1-2)或酶的底物作用后,根據呈現(xiàn)的顏色或形成的產物特性,移至相應波長的分光光計中,即可從測定的消光值換算出待測物的含量。 例如: 鄰苯二
8、酚(在275nm有吸收峰) + 鄰苯二酚-2,3-雙加氧酶 黃色的- 羥基粘康酸半醛(在375nm有吸收峰) 通過檢測375nm消光值的升高即可換算出所用酶的活力。 第十八張,PPT共六十一頁,創(chuàng)作于2022年6月 還可用不同消光值之間的比值鑒定某些物質的純度 例如 純細胞色素c還原型A550氧化型A280比值為1.25 1.28。 假如比值過高或過低,就表明細胞色素C中污染了雜質。 第十九張,PPT共六十一頁,創(chuàng)作于2022年6月 (2)熒光法 特點: 熒光法的精確性、重復性和靈敏度比吸收光譜法好。 當分析物含量低、用吸收光譜法不能檢測時,改用熒光法卻能求得滿意結果。 如: NAD(菸酰胺腺
9、嘌呤二核苷酸)(輔酶) NADP(菸酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)(輔酶) 由于NADH2和NADPH2發(fā)熒光,用于偶聯(lián)NADH2 (或NADPH2)的氧化或NAD(或NADP)的還原反應系統(tǒng)進行熒光測定。 第二十張,PPT共六十一頁,創(chuàng)作于2022年6月 例子: 谷草轉氨酶(GOT)活力測定采用與蘋果酸脫氫酶(MDH)相偶聯(lián)反應進行。 天冬氨酸 +- 酮戊二酸 GOT 草酰乙酸 + 谷氨酸 草酰乙酸 + NADH+H+ MDH L - 蘋果酸+NAD+每生成1分子草酰乙酸就消耗1分子NADH,這樣GOT活力就可通過測定NADH在340nm消光值的下降來求得。 第二十一張,PPT共六十一頁,創(chuàng)作于2
10、022年6月 (3)濁度法 極稀的懸浮液可采用此法測定,即測定懸浮液在不被吸收的波長下表觀的消光值。 例如 伴刀豆球蛋白(Concanavalin,ConA)的活力測定方法之一就是采用此法(A420)。 培養(yǎng)液中細菌生長的濃度(A600) 也可用此法測定。第二十二張,PPT共六十一頁,創(chuàng)作于2022年6月 2 電化學法 有些反應過程會放出質子氫(H+),可用靈敏的pH計或NaOH溶液滴定等方法追蹤其變化,從而計算出欲測物的含量或活力。 例如:葡萄糖氧化酶能催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸,用NaOH溶液滴定該酸的含量,便可求出葡萄糖氧化酶的活力。 第二十三張,PPT共六十一頁,創(chuàng)作于2022年6月 3
11、 生物活性檢測法 大多數(shù)生命物質,尤其是一些激素類物質,當把它們注射入動物的特定器官時,所屬機體將發(fā)生相應的變化,并且二者間有一定的相關性。根據這一性質設計的方法,即可對生命活性物質進行檢測。 如:在某個動物器官中注射某種激素,使器官細胞加速分裂,通過檢測細胞的數(shù)量變化來推測激素的生物活性。第二十四張,PPT共六十一頁,創(chuàng)作于2022年6月 4 免疫分析法 采用抗體與抗原之間發(fā)生的特異反應,并結合放射性同位素標記或酶標記,就可對有關物質進行靈敏的定性或(和)定量分析(詳見第十九章)。 5 生物傳感器 用生物傳感器中的敏感膜(具有分子識別功能的生物活性材料如酶、蛋白、抗體、生物膜和微生物等作為敏
12、感元件)與待測溶液中的某一物質進行反應,即可通過顯示器反映出有效成分的數(shù)量(詳見第十七章)。 第二十五張,PPT共六十一頁,創(chuàng)作于2022年6月第三節(jié) 細胞的破碎 細胞是生物體結構和功能的基本單位。 有效成分可以分泌于細胞外,也有存在于細胞內的。 如淀粉酶和蛋白酶等就是分泌在胞外的培養(yǎng)液中,用適當?shù)娜軇┛芍苯犹崛 ?存在于細胞內的酶又有游離酶和結合酶之分,前者游離在細胞質中,后者則與細胞器緊密結合(如氧化還原酶和有機磷水解酶等)。 第二十六張,PPT共六十一頁,創(chuàng)作于2022年6月欲提取存在于細胞內的物質時,必須把細胞破碎(個別的則例外如采用Mg2+溶液提取酶蛋白)。動物臟器的細胞膜比較脆弱,
13、極易破損,往往在組織絞碎或提取時就被破壞了。植物和微生物的細胞壁較牢固,需要在提取前進行專門的破細胞操作。第二十七張,PPT共六十一頁,創(chuàng)作于2022年6月一、機械破碎1 研磨法剪碎的動物組織置研缽中,用研磨棒研碎。 用勻漿器處理,也能把動物細胞破碎。 大規(guī)模生產時,可用電動研磨法。 細菌和組織的細胞破碎均可用此法。 2 組織搗碎器法這是一種劇烈的破碎細胞方法。搗碎器(8 00010000r/min)處理3045s,植物和動物細胞能完全破碎。 第二十八張,PPT共六十一頁,創(chuàng)作于2022年6月3 超聲波法 它是借助聲波的振動力破碎細胞壁和細胞器的有效方法。 4 壓榨法 此法是一種溫和、徹底破碎
14、細胞的方法。 用1.771083.54108Pa的壓力迫使幾十毫升細胞懸液通過一個小孔(20kDa)或甘油中。 10ml抽提液可在1h內濃縮到幾乎無水的程度。 這種方法的濃縮速度與透析袋的表面積以及PEG的數(shù)量有密切關系。 B.真空透析 第四十五張,PPT共六十一頁,創(chuàng)作于2022年6月五、減壓蒸餾法當真空度較高時溶液的沸點可控制在30以下。 這種方法一般適用于常溫下穩(wěn)定性好的物質。第四十六張,PPT共六十一頁,創(chuàng)作于2022年6月 六、冰凍干燥法 冰凍的抽提液在真空狀態(tài)下,可以由固體直接變?yōu)闅怏w。用此原理進行濃縮,有效成分幾乎不會破壞。 凍干機 凍干機主要由:低溫干燥箱、真空泵和冷凍機構成。
15、 第四十七張,PPT共六十一頁,創(chuàng)作于2022年6月第六節(jié) 純化方案的設計與評價 純化方案: 是指在純化某一物質過程中,將幾種分離方法(如沉淀法、離子交換層析、葡聚糖凝膠等)有機地互補聯(lián)合、靈活應用的總稱。 第四十八張,PPT共六十一頁,創(chuàng)作于2022年6月 一、純化方案的設計 依據抽提液中有效成分和雜質之間理化性質的差異性,從諸多方法中挑選出兩種、兩種以上乃至更多種分離方法組成一個純化方案。 各分離方法的排布: 一般地, 先選用粗放、快速、有利于縮小樣品體積和后工序處理的方法; 后選用精確、費時和需樣品量少的方法。第四十九張,PPT共六十一頁,創(chuàng)作于2022年6月 二、純化方案的評價 對純化
16、方案的評價,實質上是對組成純化方案的每一種分離方法的評價。 這種評價僅采用理論分析是遠遠不夠的,只有經過實踐檢驗才能正確得出。 第五十張,PPT共六十一頁,創(chuàng)作于2022年6月 方法:純化過程的每一步收集到的溶液要進行:有效成分的含量測定; 并計算:比活力(活力單位數(shù)毫克蛋白)純化倍數(shù)(每步的比活力粗抽提液的比活力)收得率(每步的總活力/粗抽提液總活力)100 視純化倍數(shù)的大小,收得率的高低,就能初步確定每種分離方法的應用價值。第五十一張,PPT共六十一頁,創(chuàng)作于2022年6月一般認為:凡是在特定實驗中能增大純化倍數(shù)和提高收得率的方法均屬有應用價值的。反之,則應用價值不大,也不宜采用。 但是,
17、在純化過程中,隨著純化倍數(shù)的增大,有效成分的含量卻是逐漸減少,收得率也往往100(除非抽提液中存在酶的抑制)。 因此,實踐中對純化倍數(shù)和收得率的要求是根據材料來源的難易而變化的。若材料來源難,就希望提高收得率;反之,則希望提高純化倍數(shù)(見沉淀法)。 第五十二張,PPT共六十一頁,創(chuàng)作于2022年6月 例子 以從賽氏桿菌(Serratia sp)提取L-門冬酰胺酶為例,說明純化方案與純化倍數(shù)和收得率的關系(見表1-7)。第五十三張,PPT共六十一頁,創(chuàng)作于2022年6月表1-5 L-門冬酰胺酶的純化比活力 = 活力單位數(shù)毫克蛋白純化倍數(shù) = 每步的比活力粗抽提液的比活力收得率 = 每步的總活力/
18、粗抽提液總活力100步驟 總蛋白/g 總活力/u 比活力(u/mg) 純化倍數(shù) 收得率/%1.粗抽提液 30 21000 0.7 1 100 2.氯化錳處理 7.64 15017 2.0 2.8 723.冰凍融解 5.58 14872 2.7 3.8 714.DEAE-纖維 0.113 5025 44.5 63.5 24 素層析5.硫酸銨鹽析 0.048 3367 71.7 102.0 176.羥基磷灰石 0.016 3133 200.0 286.0 15 柱層析7.PAGE 0.012 3100 255.0 365.0 15第五十四張,PPT共六十一頁,創(chuàng)作于2022年6月此處,酶含量是用活力單位表示 酶純度用比活力表示 純化的有效成分不同,表示其含量和相對純度的單位亦不一樣。 如純化的物質是胰島素,其含量將用效價表示,純度用每毫克蛋白質所含效價單位表示。 第五十五張,PPT共六十一頁,創(chuàng)作于2022年6月第七節(jié) 有效成分純度和性質的分析 在實踐中 常用于鑒定生物制品純度的方法有:電泳(見第十八章)、免疫分析(見第十九章)、薄層層析和薄膜層析(見第三章)等。 用于檢測其含量和性質的方法有:光譜法和氣相層析(見第二十章)等; 用于測定有效成分分子質量的方法有:凝膠過濾(見第六章)和電泳法等; 用于測定核酸序列的方法有:化學直讀法、酶解直讀法(見第十三章)等; 用于測定
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