醫(yī)學分子生物學醫(yī)學分子生物學課件

1、醫(yī)學分子生物學生命科學是研究生命現(xiàn)象和生命活動規(guī)律的綜合性學科研究內容：生命物質的結構與功能，生物與生物之間及生物與環(huán)境之間相互關系。前沿領域：分子生物學、分子遺傳學、細胞生物學、發(fā)育生物學和神經生物學。而分子生物學是生命科學的前沿。生命科學的發(fā)展過程 整體水平 細胞水平 分子水平從整體水平到分子水平示意圖分子生物學:從分子水平研究生命現(xiàn)象、生命的本質、生命活動及其規(guī)律的科學。醫(yī)學分子生物學:從分子水平研究人體在正常和疾病狀態(tài)下生命活動及其規(guī)律的科學。主要研究人體生物大分子和大分子體系的結構、功能、相互作用及其同疾病發(fā)生、發(fā)展的關系。 參考書1. 周春燕 馮作化主編醫(yī)學分子生物學 (供研究生用

2、) 人民衛(wèi)生出版社 (2014)2. 田余祥 秦宜德主編醫(yī)學分子生物學 (供長學制學生和研究生用) 科學出版社 (2013)主要內容1一、蛋白質蛋白質分子的折疊和定位蛋白質的修飾與降解蛋白質相互作用蛋白組學主要內容2二、基因組與基因表達基因組、基因組學與轉錄組學基因組復制及DNA損失傷與修復基因表達的表觀遺傳調控真核生物基因表達的轉錄調控非編碼RNA與基因表達及其調控三、基本生命活動的分子調控細胞增殖的分子調控細胞分化的分子調控細胞凋亡的分子調控代謝的分子調控主要內容3四、分子醫(yī)學基因和基因組異常與疾病蛋白質分子異常與疾病代謝異常與疾病癌基因和抑癌基因異常與疾病基因工程與基因工程藥物主要內容4

3、 第一部分 蛋白質分子的折疊和定位1）作為生物催化劑（酶）2）代謝調節(jié)作用3）免疫保護作用4）物質的轉運和存儲5）運動與支持作用6）參與細胞間信息傳遞蛋白質的生物學功能 蛋白質分子結構高級結構或空間構象 (conformation)一級結構(primary structure)二級結構(secondary structure)三級結構(tertiary structure)四級結構(quaternary structure)蛋白質怎樣形成正確的空間構象？如果出現(xiàn)錯誤的折疊，如何糾正？蛋白質如何被運輸?shù)郊毎奶囟ú课唬?蛋白質分子的折疊和定位研究意義： 揭示蛋白質的生物學功能、認識疾病的發(fā)病機制

4、、 設計特異的蛋白質、工業(yè)化制備功能蛋白質等方面具有重要的學術和社會意義。第一節(jié) 蛋白質分子的折疊 概念： 重要 從一條伸展無序的多肽鏈折疊成具有正確空間結構的蛋白質分子的過程，稱為蛋白質的折疊（protein folding)。蛋白質分子的折疊一、蛋白質折疊的機制體現(xiàn)了 熱力學和動力學的統(tǒng)一牛胰核糖核酸酶體外變性-復性實驗變性復性 蛋白質體外折疊機制與“自組裝”熱力學假說天然蛋白質多肽鏈可以在體外復性；天然蛋白質在生物學環(huán)境中處于熱力學最穩(wěn)定的狀態(tài)；多肽鏈的氨基酸序列包含了可以形成熱力學意義上穩(wěn)定的天然構象所必需的全部信息。 Anfinsen 的“自組裝”熱力學假說得到了許多體外實驗的支持，

5、一些小分子量蛋白質在體外可進行可逆的變性和復性。 該假說發(fā)展成“蛋白質一級結構決定高級結構”的著名論斷，并榮獲1972年諾貝爾化學獎。 一些蛋白折疊“自組裝”假說不能解釋的現(xiàn)象。有些蛋白變性-復性并非完全可逆；蛋白質變性與復性是在不同條件下進行的，不符合熱力學準靜態(tài)標準。 Levinthal推斷蛋白質折疊不可能是完全隨機和反復嘗試所有可能的構象直到找到自由能最低構象的過程，由此引出蛋白質折疊動力學學說。蛋白質折疊也是一個動力學控制的過程蛋白質折疊遵循從高能態(tài)向低能態(tài)轉變的的熱力學理論；蛋白質折疊中存在著某種能級勢壘（energy barrier ），阻礙蛋白質形成最穩(wěn)定的空間構象。從而使得蛋白

6、質結構處在某種亞穩(wěn)態(tài)，受到了動力學的控制。蛋白質折疊示意圖 J1 Ji U I1 Ii NA1AiU 非折疊多肽鏈; 折疊中間態(tài)；A有序聚集多肽鏈(不可逆)J無序聚集多肽鏈(可逆)； N天然構象多肽鏈蛋白質復性不可單一解釋為熱力學或動力學過程，兩者在多肽鏈折疊反應中的作用是統(tǒng)一的。結構簡單小蛋白質，折疊過程相對簡單，在熱力學控制下能進行可逆的變性和復性。結構復雜的蛋白質，總體受熱力學控制，但折疊途徑受到動力學控制。二、不同模型從不同視角描述了 蛋白質的折疊過程蛋白質體外折疊模型成核-快速生長模型（Nucleation-rapid growth model）拼圖模型（jip-saw puzzle

7、 model)框架模型（framework model)快速疏水垮塌模型（rapid hydrophobic collapse model)擴散-碰撞-締合模型（diffusion-collosion-adhesion model)動力學模型（kinetic model)格點模型（ HP model)成核-快速生長模型（Nucleation-rapid growth model）多肽鏈開始折疊時先在某一區(qū)域形成許多“折疊晶核”。晶核由特定氨基酸殘基形成接近天然狀態(tài)相互作用的結構。以晶核為核心向兩側擴大，使得整個肽鏈迅速折疊成為天然構象。拼圖模型（jip-saw puzzle model)多肽鏈

8、可沿多條不同途徑進行折疊，最終形成天然構象。外界環(huán)境變化或突變可能會給單一折疊造成較大的影響，對其他途徑影響不大?？蚣苣Ｐ停╢ramework model)多肽鏈折疊起始先迅速形成不穩(wěn)定的二級結構單元；二級結構靠近形成穩(wěn)定的二級結構框架；二級結構框架相互拼接，肽鏈緊縮，形成三級結構?？焖偈杷逅Ｐ停╮apid hydrophobic collapse model)疏水側鏈基團引導多肽鏈快速折疊，使蛋白質處于既不是完全的折疊狀態(tài)，也不是完全的非折疊狀態(tài)。在形成二級結構和三級結構之前發(fā)生很快的非特異性的疏水塌縮，再進一步折疊成天然構象。擴散-碰撞-締合模型（diffusion-collosion

9、-adhesion model)折疊起始于幾個位點，形成不穩(wěn)定二級結構單元以非特異性布朗運動方式擴散、碰撞、相互黏附，生成較大的結構域形成疏水核心和二級結構的球形中間體調整為致密的、無活性的、類似天然結構的、高度有序的熔球態(tài)結構無活力的熔球態(tài)轉變?yōu)樘烊粦B(tài)動力學模型（kinetic model)起始階段與“拼圖模型”類似，多肽鏈沿多條途徑迅速形成一些具有局部結構的中間體；中間階段與“成核-快速生長模型”的快速生長階段類似，在局部結構基礎上快速折疊，形成具有較多天然結構的中間體；最后階段是中間體向天然構象的轉變。格點模型（ HP model)二維格點模型：在平面中產生正交的單位長度的網格。每個氨基

10、酸分子按在序列中的先后順序依次放置到這些網格交叉點上，如果出現(xiàn)所要放置的氨基酸分子沒有位置，說明該構型是不合理的，需要重新放置。三維格點模型：是在三維空間產生的單位長度的立體網格。 三、蛋白質體內折疊同時受到 內在因素和外部條件制約（一）氨基酸側鏈及二級結構是影響蛋白質折疊的內在因素 氨基酸側鏈影響二級結構有一定的傾向性二硫鍵的形成和脯氨酸殘基酰胺鍵的順反異構化形成-螺旋的起始階段是慢反應單個結構域作為獨立單位進行折疊1.氨基酸側鏈影響二級結構有一定的傾向性 氨基酸側鏈大小、極性、疏水性、親水性等影響二級結構的形成，進而影響蛋白質空間結構和穩(wěn)定性。 (Trp)R groups are pola

11、r: -OH, -SH, and -NH2.疏水性氨基酸殘基：僅參與范德華相互作用親水性氨基酸殘基：與肽鏈主鏈，其他氨基酸殘基側鏈，極性有機分子和水分子形成氫鍵。丙氨酸、亮氨酸：容易形成-螺旋脯氨酸：很少出現(xiàn)在-螺旋苯丙氨酸：芳香側鏈參與弱的極性相互作用2.二硫鍵的形成和脯氨酸殘基酰胺鍵的順反異構化與蛋白質的折疊蛋白質二硫鍵異構酶催化二硫鍵的形成是蛋白質折疊的限速酶。脯氨酸（環(huán)狀氨基酸）缺少酰胺質子（-NH），脯氨酸順反異構化抑制蛋白質的折疊。3.形成-螺旋的起始階段與蛋白質折疊 在-螺旋形成初始階段，新生肽鏈處在一個無序的狀態(tài)下，在間隔3個氨基酸的兩個殘基之間形成氫鍵是一個慢反應。一旦-螺旋

12、形成，將從這個有序的-螺旋區(qū)域迅速擴張。 形成-螺旋的起始階段是個慢過程。4.單個結構域作為獨立單位進行折疊 較大的蛋白質有多個結構域，每個結構域是獨立的結構單位，可作為獨立單位進行折疊。（二）細胞內特殊環(huán)境影響蛋白質折疊細胞內大分子擁擠效應影響多肽鏈的折疊溫度和pH影響多肽鏈的折疊金屬離子配位效應影響蛋白質的天然構象1.細胞內大分子擁擠效應影響多肽鏈折疊大分子擁擠效應產生的原因：細胞內蛋白質總濃度高達200-300g/L；胞質中蛋白質濃度隨著細胞周期變化出現(xiàn)上調和下調；大分子不可穿透性使實際可用空間減?。?生物大分子占據了細胞的大部分體積，產生“大分子擁擠效應”，影響新生肽鏈的折疊過程。2.

13、溫度和pH影響多肽鏈的折疊 細胞溫度37左右，pH在中性范圍，影響蛋白質體內的折疊。3.金屬離子配位效應影響蛋白質 的天然構象 金屬離子通過與氨基酸側鏈基團配位，穩(wěn)定蛋白質結構。四、蛋白質的折疊需要其他 輔助分子參與分子伴侶：幫助肽鏈正確折疊成中間折疊體，阻止和糾正不正確折疊。折疊酶：催化與折疊直接有關的化學反應。分子內分子伴侶：一些蛋白質在體內以前導肽的形式合成，具有類似分子伴侶的功能。（一）分子伴侶是蛋白質在體內進行正確折疊最主要的輔助因子 1978年 Laskey R 在體外研究組蛋白與DNA 時發(fā)現(xiàn)，只有在細胞核內一種酸性蛋白存在的條件下，二者才能組裝成核小體，否則就會發(fā)生沉淀。該蛋白

14、被稱為分子伴侶（chaperone).分子伴侶（chaperone)概念：是一類序列和結構上沒有相關性，但有共同功能的保守蛋白質。其功能是幫助其他蛋白質在體內進行非共價鍵的組裝和卸裝；但是它們不是這些蛋白質發(fā)揮正常生物學功能時應有的永久性組成成分。分子伴侶（chaperone)分子伴侶本身不包括控制正確折疊所需的構象信息，但能阻止非天然態(tài)多肽鏈的錯誤折疊或凝集，為多肽鏈提供更多正確折疊的機會。分子伴侶家族包括熱激蛋白（HSP100、HSP90 、HSP70、HSP60)，crystallins、prefoldin、核質素、TCP-1ring complex(TRiC)、觸發(fā)因子等。分子伴侶的作

15、用方式1. HSP70 和 HSP40 以ATP依賴方式參與蛋白質折疊過程2. 伴侶素 HSP60 和 HSP10 形成圓桶狀復合物輔助多肽鏈的正確折疊3. 觸發(fā)因子是可以與核糖體結合的分子伴侶HSP40結合待折疊多肽片段 HSP70-ATP復合物 HSP40- HSP70-ADP-多肽復合物 ATP水解GrpE ATPADP復合物解離，釋出多肽鏈片段進行正確折疊 伴侶素系統(tǒng)促進蛋白質折疊過程 （二）折疊酶輔助共價鍵的形成蛋白質二硫鍵異構酶參與二硫鍵的形成肽基脯氨酰順反異構酶催化反式肽基脯氨酰鍵轉變?yōu)轫樖綐嬓停ㄈ┓肿觾确肿影閭H是具有前導肽的蛋白質的前體有前導肽（Pro肽）的前體形式蛋白質分子

16、，必須要有Pro肽的參與才能完成折疊。Pro肽具備了分子伴侶的作用。Pro肽可以看作是一種折疊酶，特異性催化蛋白質的折疊過程。（四）分子伴侶輔助其他生物大分子的折疊分子伴侶并不局限于蛋白質，也可以是脂分子伴侶，如磷脂乙醇胺是乳糖透性酶折疊所必需的。分子伴侶所輔助的分子也不局限于蛋白質，如DNA 分子伴侶，RNA分子伴侶。五、膜蛋白的折疊研究具有較大的挑戰(zhàn)性 膜蛋白質在磷脂膜中的二級結構可以全部是-螺旋結構，也可以全部是-片層結構，如通道蛋白。膜蛋白具有重要功能細胞信號的接受和轉導物質轉運能量轉換細胞間識別病毒和細菌感染腫瘤發(fā)生細菌耐藥為什么膜蛋白折疊所知甚少？細胞膜蛋白分離或表達膜蛋白有一定困

17、難膜蛋白體外變性-復性要在疏水環(huán)境進行，研究難度大。到目前為止，只有幾種膜蛋白成功進行了變性-復性實驗。-螺旋跨膜蛋白折疊的“兩步模型”1.形成約25個氨基酸的疏水-螺旋，插入膜中。2.在膜內疏水條件下，內部-螺旋相互作用，引導蛋白質趨向天然結構。 膜內疏水環(huán)境使得肽鏈主鏈上的極性基團N-H和C=O只能相互形成氫鍵，有利于-螺旋的形成和穩(wěn)定。對于只是部分插入到膜中的外周蛋白的折疊，一般認為在插入之前，蛋白質要進行部分折疊。通道蛋白（porin）由多個-片層在外膜形成-桶狀結構的通道，能夠輔助較小極性分子進入細胞質。-桶狀結構的疏水殘基側鏈位于與脂質雙分子層直接接觸的區(qū)域，極性殘基的側鏈遠離疏水

18、的脂質雙分子層，與空腔的水形成氫鍵。通道蛋白可由信號肽引導，以成熟的蛋白質形式分泌到細胞質中，然后插入到膜。該過程包括了部分的折疊和與其他鏈的相互作用。體外實驗也證明通道蛋白可以在脂質雙分子層中完全重折疊。第二節(jié) 蛋白質的定位蛋白質的定位概念：蛋白質合成后被定向輸送到發(fā)揮作用的靶區(qū)域的過程稱為蛋白質的靶向輸送 （protein targeting)。蛋白質的靶向輸送是由蛋白質上所攜帶的定位信號決定的。一、蛋白質分子上攜帶不同的定位信號 20世紀70年代，Blobel G 提出“信號肽假說”即所有靶向輸送的蛋白質的一級結構中都存在定位信號，引導蛋白質轉移到適當?shù)募毎胁课弧?1999年獲諾貝爾生

19、理學或醫(yī)學獎。定位信號：定位信號是決定蛋白質靶向輸送的關鍵因素，引導蛋白質轉移到適當?shù)募毎胁课?。信號肽序列：是肽鏈N-末端長度為13-36個氨基酸的序列。靶向輸送蛋白信號序列或成分分泌蛋白信號肽內質網腔蛋白信號肽，C端-Lys-Asp-Glu-Leu-COO-(KDEL序列)線粒體蛋白N端靶向序列（2035氨基酸殘基）核蛋白核定位序列（-Pro-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-，SV40 T抗原）過氧化體蛋白-Ser-Lys-Leu-（PST序列）溶酶體蛋白Man-6-P（甘露糖-6-磷酸）靶向輸送蛋白的信號序列或成分 二、不同的定位信號引導蛋白質轉運到不同的細胞部位

20、線粒體中蛋白質由胞質游離核糖體合成并靶向輸送到線粒體中細胞核蛋白的入核和出核由核定位信號和核輸出信號決定成熟的、完全折疊的蛋白質才能被轉運到過氧化物酶中分泌型蛋白質的靶向輸送起始于粗面內質網膜蛋白的插入具有方向性（一）線粒體中的蛋白質由胞質游離核糖體合成并靶向輸送到線粒體中1.線粒體蛋白質的N-末端帶有定位信號2.蛋白質進入線粒體需要TOM和TIM復合體3.線粒體蛋白質的輸送模型具有保守型線粒體蛋白的靶向輸送 （二）細胞核蛋白的入核和出核是由核定位信號和核輸出信號所決定 蛋白質的核定位信號（nuclear localization signal,NLS）決定了蛋白質在細胞核內外的轉運。NLS由4-8個氨基酸殘基組成，富含帶正電荷的賴氨酸，精氨酸及脯氨酸。可位于肽鏈不同部位，完成定位后不被切除。核輸出信號（nuclear export signal,NES）負責把蛋白質從細胞核內轉運至細胞質。NES含有一段10個氨基酸殘基序列，含有一