微生物生理學(xué)6細(xì)菌結(jié)構(gòu)基因的鑒定副本課件

1、基因鑒定：對(duì)某個(gè)基因全方位的研究，包括基因序列測(cè)定、基因位置分析和基因編碼產(chǎn)物生理功能研究。核心是生理功能研究。正向遺傳學(xué)：首先獲得突變菌株，接著確定靶基因，同時(shí)研究基因功能。即從生物的性狀、表型到遺傳物質(zhì)來(lái)研究基因的功能。適用于所有細(xì)菌基因功能的研究。研究策略反向遺傳學(xué)：在獲得基因序列的基礎(chǔ)上，對(duì)靶基因進(jìn)行必要的改造，得到突變菌株，同時(shí)研究基因的功能。即從基因到性狀、表型來(lái)研究基因功能。適用于已經(jīng)完成全基因組測(cè)序的細(xì)菌。研究手段遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等研究層次與內(nèi)容基因、蛋白質(zhì)和細(xì)胞三個(gè)層次，體內(nèi)和體外兩個(gè)方面內(nèi)容?；?qū)用妫簶?gòu)建表達(dá)載體、對(duì)其定向突變等。蛋白質(zhì)層面：分離純

2、化蛋白質(zhì)、體外分析蛋白質(zhì)生化特性等。細(xì)胞層面：構(gòu)建突變菌株、遺傳互補(bǔ)分析等。經(jīng)典模式細(xì)菌基因鑒定主要包括大腸桿菌、鼠傷寒沙門(mén)氏菌、枯草芽孢桿菌通過(guò)基因定位鑒定未知基因（以大腸桿菌為例）基因定位意義確定發(fā)現(xiàn)的基因?yàn)樾碌幕颉｀徑幕蚩赡転樾禄蛱峁┮恍┕δ芎驼{(diào)節(jié)方面的信息?；蜻z傳圖位的知識(shí)可能為以后的遺傳操作提供幫助。接合與基因定位F質(zhì)粒的特性大腸桿菌的致育因子，為100kb質(zhì)粒其上主要有轉(zhuǎn)移區(qū)、復(fù)制區(qū)和插入序列三個(gè)區(qū)域根據(jù)攜帶F質(zhì)粒的情況，大腸桿菌分四種：F、F、F和HfrHfr又叫高頻重組菌株，是F質(zhì)粒通過(guò)同源重組整合到宿主染色體上，且能隨宿主染色體的復(fù)制而復(fù)制。在HfrF中，供體菌的染

3、色體可由F質(zhì)粒的牽引進(jìn)入受體菌中，且與受體菌染色體同源區(qū)域發(fā)生重組的效率高，因此得名。F質(zhì)粒通過(guò)插入序列IS間的同源重組整合到宿主染色體上。可以逆時(shí)針插入，也可以順時(shí)針插入，且可以插入染色體多個(gè)位置，形成了許多不同的Hfr菌株。不同Hfr菌株中斷雜交與染色體圖譜 HfrF雜交規(guī)律 供體菌染色體在F質(zhì)粒牽下按一定方向和均勻速度逐漸進(jìn)入F細(xì)胞。DNA轉(zhuǎn)移從F質(zhì)粒的oriT起始，F(xiàn)質(zhì)粒的主要部分在最后進(jìn)入受體。整個(gè)染色體進(jìn)入受體菌約需用100分鐘，由于在接合過(guò)程中常發(fā)生染色體斷裂，一般不能將完整的染色體轉(zhuǎn)移進(jìn)受體菌，因此F菌株不變?yōu)镕。中斷雜交實(shí)驗(yàn)：將接合中的細(xì)菌按不同時(shí)間取樣，并將樣品放入攪拌器內(nèi)

4、猛烈攪拌，以打斷細(xì)菌的接合管，終止接合。由于接合時(shí)間不同，不同長(zhǎng)度的細(xì)菌染色體（基因組）從供體轉(zhuǎn)移到受體，分析受體的基因型即可知細(xì)菌染色體的基因轉(zhuǎn)移順序，以確定細(xì)菌染色體上基因位置（包括基因順序和距離）Hfr a+b+c+d+e+ StrsF-a-b-c-d-e-Strr不同時(shí)間取樣，分別在含有Str和a、b、c、d、e的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選。DNA轉(zhuǎn)移從F質(zhì)粒的oriT起始，越靠近oriT的基因，越先進(jìn)入受體菌。從上述實(shí)驗(yàn)中可知，基因的排列順序?yàn)閎aecd不同的Hfr菌株的染色體原點(diǎn)不同，轉(zhuǎn)移方向也不同。從不同的Hfr菌株的各個(gè)轉(zhuǎn)移基因之間毗鄰關(guān)系相同但轉(zhuǎn)移起點(diǎn)及方向不同的事實(shí)推斷出，大腸桿

5、菌的染色體是環(huán)狀DNA分子。利用供體基因進(jìn)入受體細(xì)胞的順序和時(shí)間可繪制出細(xì)菌的遺傳學(xué)圖。大腸桿菌染色體圖譜圖距是時(shí)間：分鐘整個(gè)染色體為100分鐘。規(guī)定了起始0點(diǎn)，順時(shí)針?lè)较?。每個(gè)基因占據(jù)獨(dú)立的時(shí)間位置。約有1000多個(gè)基因被標(biāo)定在這一圖譜上。接合與基因定位大腸桿菌一突變株：ace，不能利用乙酸鹽為碳源。Hfr1F-(ace)獲得原養(yǎng)型接合子1000個(gè)。通過(guò)突變菌株與幾個(gè)不同Hfr菌株接合，檢測(cè)原養(yǎng)型接合子的數(shù)量定位ace基因。Hfr2F-(ace)獲得原養(yǎng)型接合子50個(gè)。Hfr3F-(ace)獲得原養(yǎng)型接合子1200個(gè)。Hfr4F-(ace)獲得原養(yǎng)型接合子200個(gè)。ace在85分鐘與5分鐘之

6、間。轉(zhuǎn)導(dǎo)與基因定位P1噬菌體溫和性噬菌體，有兩種生活方式：溶原和裂解。溶原狀態(tài)以環(huán)狀質(zhì)粒形式存在于大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)，不與大腸桿菌染色體整合。P1噬菌體DNA全長(zhǎng)為90kb，約等于大腸桿菌染色兩分鐘的圖距。裂解狀態(tài)以隨機(jī)包裝方式形成成熟顆粒，能將大腸桿菌的染色體隨機(jī)地包裝進(jìn)噬菌體顆粒中。轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程基因定位共轉(zhuǎn)導(dǎo)：一種噬菌體同時(shí)將兩個(gè)或多個(gè)供體基因轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入受體菌的現(xiàn)象。兩個(gè)基因在染色體上的位置越近，被共轉(zhuǎn)導(dǎo)的頻率就越高。在大腸桿菌染色體上相距2分鐘之內(nèi)的基因均有可能被P1噬菌體共轉(zhuǎn)導(dǎo)。受體菌：WTD731，對(duì)氯離子敏感（cl-），氨卞青霉素抗性(AmR)。通過(guò)接合，定位在大腸桿菌染色體12-17。供體

7、菌：ME8975：zbc-3105:Tn10，13，TcRME8795：zbd-601:Tn10，15，TcRME8451：zbe-280:Tn10，16，TcRME8799：zbh-29:Tn10，18，TcR雜交結(jié)果ME8795WTD731 36%ME8451WTD731 40%ME8975WTD731 2%ME8799WTD731 0%重組率（TcR Cl+）根據(jù)上述結(jié)果目的基因位于15 -16 應(yīng)用實(shí)例構(gòu)建特殊的大腸桿菌菌株E.coli MH121 fabA:cat，為油酸的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株。E.coli YYC1257 cfa:kan，不產(chǎn)生環(huán)丙烷十七脂肪酸。構(gòu)建E.coli fabA

8、:cat cfa:kan。？小結(jié)大腸桿菌接合定位確定的基因位置較為粗放，P1轉(zhuǎn)導(dǎo)定位較為準(zhǔn)確，更精確定位需使用其它方法?；蚨ㄎ粌H確定了基因的位置，DNA序列仍然未知，由此獲得的關(guān)于基因功能的信息有限。但是通過(guò)基因定位積累的大腸桿菌突變菌株和相關(guān)知識(shí)對(duì)于現(xiàn)在研究大腸桿菌仍有幫助?，F(xiàn)代細(xì)菌基因鑒定對(duì)于未知序列的基因，采用正向遺傳學(xué)策略，先確定其DNA序列，然后研究其生理功能。對(duì)于已知序列的基因，采用反向遺傳學(xué)策略，構(gòu)建突變菌株，然后研究其生理功能。現(xiàn)代基因鑒定的實(shí)質(zhì)是生理功能的鑒定。未知序列的基因主要通過(guò)篩選突變菌株獲得，已知序列基因是指那些全基因組測(cè)序完成的細(xì)菌中存在的大量未知功能的基因。未知

9、基因的序列鑒定前提條件獲得了該基因的突變菌株、已知該基因產(chǎn)物的某些功能、有模式細(xì)菌的此類基因的研究結(jié)果等。構(gòu)建基因文庫(kù)鑒定未知基因基因文庫(kù)：基因文庫(kù)是指通過(guò)克隆方法保存在適當(dāng)宿主中的一群混合的DNA分子，所有這些分子中的插入片段的總和，可代表某種生物的全部基因組序列或全部mRNA序列，按此可分為基因組文庫(kù)和cDNA文庫(kù)。細(xì)菌一般構(gòu)建基因組文庫(kù)。細(xì)菌基因文庫(kù)構(gòu)建要求制備100kb以上的基因組DNA。選擇合適的限制性內(nèi)切酶，部分切割總DNA，回收25-40kb的DNA片段。細(xì)菌基因文庫(kù)一般選用cosmid克隆載體?？滤馆d體（cosmid）：一類人工構(gòu)建的含有噬菌體DNA 的cos序列和質(zhì)粒復(fù)制子的

10、特殊類型的載體。復(fù)制子一般為ColE1的，攜帶抗性基因，如AmpR。有噬菌體的cos序列。有多克隆位點(diǎn)（MCS），大小一般為710kb，能在大腸桿菌中轉(zhuǎn)化和增殖。能攜帶大小為3045kb的外源DNA片段。體外連接時(shí)，外源DNA片段與柯斯載體連接成線性DNA，噬菌體頭部包裝蛋白識(shí)別線性DNA上的兩個(gè)cos位點(diǎn)，進(jìn)行包裝，產(chǎn)生有感染能力的重組噬菌體顆粒，用于感染宿主細(xì)胞。柯斯載體克隆的策略體外包裝噬菌體在大腸桿菌體內(nèi)以滾環(huán)形式復(fù)制，形成多聯(lián)體線狀DNA，其外殼蛋白能識(shí)別cos位點(diǎn)，并將兩個(gè)cos位點(diǎn)間的DNA包裝，形成成熟的噬菌體。研究發(fā)現(xiàn)缺失D包裝蛋白的噬菌體突變株和缺失E 包裝蛋白的噬菌體突變

11、株，均不能單獨(dú)包裝 噬菌體DNA，但將兩種突變株分別感染大腸桿菌，從中提取缺失蛋白D的包裝物(含E蛋白) 和缺失E蛋白的包裝物(含D蛋白)，兩者混合后就能包裝噬菌體DNA。目前D包裝蛋白和E 包裝蛋白已經(jīng)商品化，可直接用于包裝重組DNA，感染宿主大腸桿菌，構(gòu)建柯斯文庫(kù)。注意完整的基因文庫(kù)，必須使任何一個(gè)基因進(jìn)入庫(kù)內(nèi)的概率均達(dá)99 。換句話說(shuō)，要求在文庫(kù)內(nèi)釣取任何一個(gè)基因，均有99 的可能性。因此需要估算文庫(kù)至少包含多少個(gè)陽(yáng)性克隆。用于計(jì)算基因文庫(kù)應(yīng)有的克隆數(shù)（N值），公式如下：Nln(1P)/ln(1f/g)其中，P為從基因文庫(kù)中選出的任一基因概率，一般定為99（0.99）；f為載體容量（kb

12、）；g為基因組大小（kb）。細(xì)菌未知基因的鑒定：遺傳互補(bǔ)以鑒定霍亂弧菌烯脂酰ACP還原酶基因（fabV）為例：使用福斯載體（fosmid）和專一性宿主（大腸桿菌EPI300）構(gòu)建基因文庫(kù)。福斯載體（fosmid）：pCC1FOS具有一般質(zhì)粒、F因子和噬菌體的三重特性。攜帶有F因子單拷貝復(fù)制子，可調(diào)控的高拷貝復(fù)制子和噬菌體的cos位點(diǎn)。像一般柯斯載體一樣可進(jìn)行體外重組和包裝，感染大腸桿菌宿主菌后可像F因子一樣以單拷貝存在，在誘導(dǎo)條件下可增加拷貝。宿主菌：EPI300專一性地與pCC1FOS匹配，誘導(dǎo)時(shí)能提供高拷貝復(fù)制子復(fù)制所需的TrfA蛋白。EPI300的改造EPI300為烯脂酰ACP還原酶原養(yǎng)

13、型菌株，不宜直接用于篩選霍亂弧菌烯脂酰ACP還原酶基因。大腸桿菌JP1111為烯脂酰ACP還原酶基因（fabI）溫度敏感突變菌株，但是不宜直接做為福斯載體的宿主用于基因文庫(kù)構(gòu)建。大腸桿菌fabI位于染色體29分鐘處，trpC基因位于28.38分鐘處。有一菌株CAG18455為trpC:Tn10，四環(huán)素抗性。以EPI300 fabI(Ts) trpC:Tn10為宿主構(gòu)建霍亂弧菌的基因組文庫(kù)，并在42C篩選可生長(zhǎng)的菌株，在經(jīng)多次亞克隆，得到fabV。細(xì)菌未知基因的鑒定：酶活性鑒定遺傳互補(bǔ)不僅可以互補(bǔ)大腸桿菌突變菌株，也可以互補(bǔ)其它細(xì)菌的相應(yīng)突變菌株。但是在互補(bǔ)其它細(xì)菌時(shí)使用的柯斯載體上應(yīng)該攜帶能夠

14、通過(guò)接合轉(zhuǎn)移的基因序列，如pLAFR3。Massengo-Tiasse, R. P., and J. E. Cronan. 2008. Vibrio cholerae FabV defines a new class of enoyl-acyl carrier protein reductase. J. Biol. Chem. 哈氏弧菌（Vibrio harveyi）中有一種脂酰ACP合成酶，催化脂肪酸直接合成脂酰ACP。編碼基因未知。用EPI300和福斯載體構(gòu)建哈氏弧菌的基因組文庫(kù)，將文庫(kù)菌制備無(wú)細(xì)胞提取物，并檢測(cè)Aas活性克隆基因。最終獲得克隆。Jiang, Y., C. H. Chan,

15、 and J. E. Cronan. 2006. The soluble acyl-acyl carrier protein synthetase of Vibrio harveyi B392 is a member of the medium chain acyl-CoA synthetase family. Biochemistry.細(xì)菌未知基因的鑒定：Southern雜交通過(guò)一定的技術(shù)能獲得部分未知基因的序列，如生物信息學(xué)能提供該基因的保守序列或者能獲得部分蛋白質(zhì)氨基酸序列等。根據(jù)部分基因序列制備標(biāo)記雜交探針，通過(guò)原位雜交獲得陽(yáng)性克隆，確定未知基因。也可以直接用探針與經(jīng)過(guò)適當(dāng)酶切的總DN

16、A雜交，得到目的片段后再克隆，然后再通過(guò)原位雜交獲得未知基因。構(gòu)建隨機(jī)突變菌庫(kù)鑒定未知基因用轉(zhuǎn)座子構(gòu)建細(xì)菌隨機(jī)突變庫(kù)，從中篩選目的突變菌株。通過(guò)構(gòu)建基因文庫(kù)，遺傳互補(bǔ)確定未知基因。通過(guò)質(zhì)粒拯救，獲取未知基因的部分序列，再通過(guò)southern雜交確定基因序列。應(yīng)用細(xì)菌蛋白質(zhì)組鑒定未知基因蛋白質(zhì)組(proteome) ：一個(gè)細(xì)胞在特定生理下表達(dá)的所有種類的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)：指研究蛋白質(zhì)組的技術(shù)及這些研究所得到的結(jié)果，其內(nèi)容包括蛋白質(zhì)鑒定、翻譯后修飾、蛋白質(zhì)功能確定。二維電泳：將不同種類的蛋白質(zhì)按照等電點(diǎn)和分子量差異進(jìn)行高分辨率的分離分析方法。等電聚焦：電荷，SDS凝膠電泳

17、：分子大小。蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析：對(duì)目的蛋白進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶幚?，然后采用多種質(zhì)譜分析技術(shù)，分析確定肽指紋圖譜或部分氨基酸序列。根據(jù)部分氨基酸序列設(shè)計(jì)DNA探針，通過(guò)適當(dāng)技術(shù)獲得基因。已知序列的基因確定目前已經(jīng)有1000多種細(xì)菌的基因組已經(jīng)測(cè)定完成，功能得到鑒定的基因不足10。生物信息學(xué)對(duì)一些基因進(jìn)行了注釋，但是仍有許多沒(méi)有任何信息的未知功能的基因?；蜃⑨屩皇翘峁┝嘶蚓哂心撤N功能的可能的信息，不一定表明這些基因一定有某種生物學(xué)功能，因此仍然需要生物化學(xué)、遺傳學(xué)的證據(jù)。大腸桿菌基因組有兩個(gè)編碼長(zhǎng)鏈脂酰ACP合成酶的基因：fabB和fabB。而在茄科雷爾氏菌基因組有4個(gè)與大腸桿菌fabF同源的基因，1個(gè)與

18、fabB同源的基因。如何從眾多的基因中選擇要研究的基因？應(yīng)用細(xì)菌轉(zhuǎn)錄組鑒定未知基因轉(zhuǎn)錄組（transcriptom）：一個(gè)活細(xì)胞所能轉(zhuǎn)錄出來(lái)的所有mRNA。轉(zhuǎn)錄組學(xué)（transcriptomics）：一門(mén)在整體水平上研究細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄的情況及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律的學(xué)科。研究轉(zhuǎn)錄組的一個(gè)重要方法就是利用DNA芯片技術(shù)檢測(cè)有機(jī)體基因組中基因的表達(dá)。DNA芯片（基因芯片）：固定有寡核苷酸、基因組DNA或cDNA等的生物芯片。利用這類芯片與標(biāo)記的生物樣品進(jìn)行雜交，可對(duì)樣品的基因表達(dá)譜生物信息進(jìn)行快速定性和定量分析。首先，制備細(xì)菌全基因組芯片，接著在不同生理?xiàng)l件下提取mRNA，并標(biāo)記，然后與芯片雜交，分析雜交結(jié)果，確定目的基因。通過(guò)同源比較確定未知