藥物分析學(xué)課件：第十四章 維生素類藥物的分析

1、第14章維生素類藥物的分析Analysis of Vitamins1概 述維生素：是維持人體正常代謝機(jī)能所必需的微量營養(yǎng)物質(zhì)。人體不能自行合成維生素。2022/8/42 如果人體缺少某種維生素，就會(huì)引起維生素缺乏癥，而影響人體的正常生理機(jī)能。 例如: VitA 缺乏夜盲癥 VitB1缺乏腳氣病3 VitA、D2、D3、 E、K1 等 脂溶性水溶性 VitB族(B1、B2、B6、B12) VitC、葉酸、煙酸、煙酰胺VitMVitPP4維生素A維生素B掌握結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)，硫色素鑒別反應(yīng)非水滴定法和紫外分光光度法了解其它鑒別反應(yīng)和含量測定方法。掌握結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)三氯化銻鑒別反應(yīng)紫外分光光度法（三點(diǎn)

2、校正法）了解其它鑒別反應(yīng)和含量測定方法。維生素C掌握結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)掌握硝酸銀、二氯靛酚鈉的鑒別反應(yīng)，碘量法和二氯靛酚滴定法了解維生素C的雜質(zhì)檢查方法。學(xué)習(xí)要求維生素E掌握結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)熟悉顯色反應(yīng)和氣相色譜法測定了解生育酚及其有關(guān)物質(zhì)的檢查。5-H 維生素A醇-COCH3 維生素A醋酸酯-COC15H31 維生素A棕櫚酸酯R :第一節(jié) 維生素ACH3CH3CH2ORCH3CH3CH3具有共軛多烯側(cè)鏈的環(huán)己烯6具有一個(gè)共軛多烯側(cè)鏈的環(huán)己烯（一）結(jié)構(gòu)與性質(zhì)一、 具有UV吸收 存在多種立體異構(gòu)化合物2022/8/47維生素A 325.5 100% 新維生素Aa 328 75%新維生素Ab 320.5

3、 24%新維生素Ac 310.5 15%異維生素Aa 323 21%異維生素Ab 324 24% 相對生物效價(jià)maxl結(jié)構(gòu)與性質(zhì)一、8VitA2VitA3 易發(fā)生脫氫、脫水、聚合反應(yīng)CH2OHCH2結(jié)構(gòu)與性質(zhì)一、脫氫脫水2022/8/49鯨醇CH2OHCH2OHCH3結(jié)構(gòu)與性質(zhì)一、聚合2022/8/410 或有金屬離子存在時(shí)氧化共軛多烯側(cè)鏈 易被氧化（二）酸醛環(huán)氧化物、氧化劑紫外線、VitAVitAVitAOO2結(jié)構(gòu)與性質(zhì)一、11環(huán)氧化物VitA醛VitA酸OCH2OHHOCCOOH12 維生素A對酸不穩(wěn)定(lewis酸/無水氯化氫乙醇溶液)，脫水，生成去水維生素A，活性降低。避光，充氮保存2

4、022/8/413（三）與三氯化銻發(fā)生呈色反應(yīng)溶解性（四）不溶于水易溶于有機(jī)溶劑和植物油等CHCl3紫紅色藍(lán)色3SbClVitA結(jié)構(gòu)與性質(zhì)一、2022/8/414理化性質(zhì)15（一）三氯化銻反應(yīng)（Carr-Price）條件: 無水無醇鑒別二、CHCl3紫紅色藍(lán)色3SbClVitA16藍(lán)色紫紅色鑒別二、17（二）VitAVitAHCl去水無水乙醇鑒別二、18USP 顯色劑 磷鉬酸 規(guī)定斑點(diǎn)顏色和Rf值BP 雜質(zhì)對照品法 顯色劑 三氯化銻TLC法（三）鑒別二、19鑒別試驗(yàn)20基于： （1）維生素A醋酸酯的環(huán)己烷溶液在328nm有最大吸收，吸收系數(shù)E=1530； （2）維生素A醇的異丙醇溶液在325n

5、m有最大吸收，吸收系數(shù)E=1820.雜質(zhì)：立體異構(gòu)體；氧化產(chǎn)物及光照產(chǎn)物；合成中間體；去氫維生素A（ VitA2）；去水維生素A（ VitA3）UV法 （一）含量測定三、 雜質(zhì)也有紫外吸收。因此采用在三個(gè)波長處測得吸光度后，再按規(guī)定進(jìn)行校正-三點(diǎn)校正法。21三點(diǎn)校正法（ChP 2010）原理：（1）雜質(zhì)的吸收在310340nm波長范圍內(nèi)呈一條直線，且隨波長的增大吸收度減小；（2）物質(zhì)對光的吸收具有加和性。含量測定三、2022/8/422含量測定三、選擇依據(jù)：所選A值中雜質(zhì)的干擾已基本消除-等波長差法23第一法：維生素A醋酸酯的測定(等波長差法)2022/8/424等波長差法若此種情況下，分別計(jì)

6、算5個(gè)波長下的差值，若有一個(gè)或幾個(gè)超過0.02，按下法判斷：25注意： C 為混合樣品的濃度 第二步 求)()(%cm1%cm1純樣EE)(%cm1樣E)(LCAcm=E(%)%1樣(因?yàn)闃悠肥腔旌衔?2022/8/426第三步 求效價(jià)換算因數(shù)由純品計(jì)算而得：換算因數(shù))效價(jià)(樣樣=%)(cm1)(Eg/IU/%)(cm1EgIU純)效價(jià)(換算因數(shù)2022/8/427醋酸酯維生素Ag344.0IU1m=2907 000g344.0g101g/IU6=mm=）效價(jià)（15302907 000Eg/IU%)(cm1=純）效價(jià)（換算因數(shù)2022/8/428換算因數(shù))效價(jià)(樣樣=%)(cm1)(Eg/IU

7、1900)效價(jià)(樣樣=%)(cm1)(Eg/IU1900CA=L1900W稱重A=LD1002022/8/429第四步：求標(biāo)示量標(biāo)示量每丸的效價(jià)標(biāo)示量100標(biāo)示量平均丸重100)效價(jià)(樣)(g/IU1900W稱重A=LD100標(biāo)示量W1001900W稱重A=LD100標(biāo)示量W1002022/8/430 方法：直接測定法維生素A醋酸酯分別于300、316、328、340、360nm處測Aiml/IU159溶液環(huán)己烷樣品31 判斷 是否在326329nm之間在326329nm之間改用皂化法是否 求算 并與規(guī)定值比較maxl328iA/Amaxl2022/8/432 規(guī)定值 差值=-=-=-=-=-

8、299.0AA811.0AA0000.1AA907.0AA555.0AA328360328340328328328316328300？328iA/A2022/8/433 判斷差值是否超過規(guī)定值的有一個(gè)以上超過無超過 計(jì)算 A328（校正） 用A328計(jì)算02.002.02022/8/434()()3403163283282523AAA.A-=校正%100AAAf328328)(328-=校正35 VitAD軟膠囊中VitA的含量測定 精密稱取本品(規(guī)格10 000VitAIU/丸)裝量差異項(xiàng)下（平均裝量0.07985g/丸）的內(nèi)容物 0.1287g 至50ml量瓶中，用環(huán)己烷稀釋至刻度，搖勻；

9、精密量取2.0ml，置另一50 ml量瓶中，用環(huán)己烷稀釋至刻度，搖勻。以環(huán)己烷為空白，測定最大吸收波長為328nm，并在下列波長處測得吸收度如下：36A300 ：0.374A316 ：0.592A328 ：0.663A340 ：0.553A360 ：0.228A300 /A328 ：0.564A316/A328 ：0.893A328/A328 ：1.000A340/A328 ：0.834A360/A328 ：0.344 求本品中VitA的含量？37A300 /A328 ：0.564A316/A328 ：0.893A328/A328 ：1.000A340/A328 ：0.834A360/A328

10、 ：0.344 0.555 0.907 1.000 0.811 0.299 + 0.0090.014 0 + 0.023 + 0.045=()()()637.0553.0592.0663.0252.3252.3340316328328=-=-=AAAA校正2022/8/438()%9.93%10010 00007985.01005015021287.01900637.0%100)ml100/g(C1900A%328=標(biāo)示量平均丸重標(biāo)示量校正%)3%15(%92.3%100328328)(328-=-=AAAf校正2022/8/439第一法無法消除雜質(zhì)干擾時(shí)用此法40水溶性脂溶性i/KOHAnm

11、334325310300ml/IU159VitAVitA樣品處測、于稀釋至溶解異丙醇除去植物油的干擾甘油和脂肪酸鹽植物油醇醋酸酯皂化液揮干乙醚乙醚提取乙醇2022/8/441等吸收比42 判斷max是否在323327nm之間取未皂化樣品采用色譜法純化后再測定 計(jì)算是否325300AA2022/8/443 判斷 A300 /A325 是否大于0.73是否取未皂化樣品采用色譜法純化后再測定 計(jì)算A325(校正)2022/8/444（二） 高效液相色譜法測定維生素A的含量為ChP2010新增的分析方法，適用于維生素A醋酸酯原料及其制劑中維生素A的含量測定。高效液相色譜法451儀器與色譜條件(1)儀器

12、：高效液相色譜儀，紫外檢測器。(2)色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：填充劑：硅膠流動(dòng)相：正己烷-異丙醇(997:3)檢測波長：325nm。進(jìn)樣量：10l。維生素A醋酸酯主峰與其順式異構(gòu)體峰的分離度應(yīng)大于3.0。對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，主成分峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差不得過3.0%。46VitA對照品（約相當(dāng)于維生素A醋酸酯300mg）碘試液0.2ml混勻放置10min定量轉(zhuǎn)移至200ml量瓶中正己烷稀釋精密量取1ml置100ml量瓶中系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液47供試品（約相當(dāng)于15mg維生素A醋酸酯） 正己烷100ml量瓶精密量取5ml定量，搖勻50ml量瓶定量，搖勻正己烷供試品溶液 另精密稱取維生素A對照品適

13、量(約相當(dāng)于15mg維生素A醋酸酯)，同法制成對照品溶液。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算含量。 48三氯化銻比色法（二）優(yōu)點(diǎn) 簡便 快速max 618nm620nm標(biāo)準(zhǔn)曲線法缺點(diǎn)呈色不穩(wěn)定 （5 10s內(nèi)）水分干擾與標(biāo)準(zhǔn)曲線溫差1專屬性差三氯化銻有腐蝕性SbOClSbClOH23藍(lán)色+3SbClVitA(三)49維生素A類藥物母核：共軛多烯側(cè)鏈的環(huán)己烯主要理化性質(zhì)：脂溶性；不穩(wěn)定；與三氯化銻呈色；紫外吸收鑒別試驗(yàn)：化學(xué)法 三氯化銻反應(yīng)（Carr-Price反應(yīng)） 光譜法 UV 色譜法 TLC含量測定：三點(diǎn)校正法 三氯化銻比色法總 結(jié)50練習(xí)E51練習(xí)B 在鹽酸催化下加熱，發(fā)生脫水反應(yīng)，生成脫水維生素A，

14、比維生素A多一個(gè)雙鍵，最大吸收峰紅移。52氨基嘧啶環(huán)CH2噻唑環(huán)(季銨堿)第二節(jié) 維生素B1 HClCl-NSCH3CH2CH2OHNNH3CNH2CH2+（堿性，和酸成鹽）53（一）溶解性1. 易溶于水2. 水溶液呈酸性（二）UV共軛雙鍵max = 246nm結(jié)構(gòu)與性質(zhì)一、2022/8/454嘧啶環(huán) 伯氨噻唑環(huán) 季銨1. 可與酸成鹽2. 與生物堿3. 含量測定 非水堿量法（三）硫色素反應(yīng)（四）堿性藍(lán)色熒光硫色素正丁醇-OOH結(jié)構(gòu)與性質(zhì)一、2022/8/455鑒別試驗(yàn)二、（一）硫色素反應(yīng)熒光消失藍(lán)色熒光硫色素正丁醇）（環(huán)合+-HCNFeKOHNaOHVitB6321-OH2022/8/456-

15、H2O57硫色素(O)環(huán)合-H22022/8/458VitB1H+H+H+（二）沉淀反應(yīng)()4242HgIHBHgIK淡黃()OH4WO12OHSiOB23222H+白色硅鎢酸()2KIIIHIB2-紅色白色扇形苦酮酸鑒別試驗(yàn)二、具有嘧啶環(huán)和氨基，顯生物堿特征2022/8/459S元素反應(yīng)Cl-反應(yīng)（三）其他反應(yīng)()21PbSNaSVitBAcPbNaOHD3HNOU233OHNHAgNOAgCl白3HNO藍(lán)色淀粉試紙-22KIMnOCl2022/8/46061三、含量測定喹那啶紅亞甲藍(lán) （紫紅天藍(lán)）（一）非水溶液滴定法4-44-2+2HClOClOBHClOHClClBAcHg）（2022/

16、8/462()ml/mg.nMCT861622733710=2022/8/463UV法（二）片劑、注射劑ChP= 421A = ECLg/100ml2022/8/464（每片）相當(dāng)于標(biāo)示量的%=規(guī)格g/片g%WEA%cm100110011標(biāo)示量平均片重稀釋度2022/8/465（每ml）相當(dāng)于標(biāo)示量的%=規(guī)格g/mlml%VEA%cm1001110011標(biāo)示量稀釋度2022/8/466NaOH（三）硫色素?zé)晒夥晒饬蛏禺惗〈艰F氰化鉀1VitB原理1.2022/8/467激發(fā)波長365nm發(fā)射波長435nm方法與計(jì)算2、2022/8/468+ NaOH + 鐵氰化鉀 + 異丁醇+ NaOH +

17、 異丁醇+ NaOH + 鐵氰化鉀 + 異丁醇+ NaOH + 異丁醇SdAb對照液供試液%WWdSbA%VitB1001-=稀釋度稀釋度樣對2022/8/469特點(diǎn)3、（1）靈敏度高，線性范圍寬（2）代謝產(chǎn)物不干擾，適用于 體液分析2022/8/470練習(xí)多選：BC Chp2010 原料藥-非水溶液滴定； 片劑注射劑-紫外分光光度法 USP34-NF29 硫色素?zé)晒夥?1第三節(jié) 維生素CL抗壞血酸654321OOHHOO COHHCH2OH烯二醇結(jié)構(gòu)*手性碳原子2022/8/4721、易溶于水2、水溶液呈酸性結(jié)構(gòu)與性質(zhì)一、（一）溶解性2022/8/473二烯醇結(jié)構(gòu)二酮基結(jié)構(gòu)二烯醇結(jié)構(gòu)（二）強(qiáng)

18、還原性2022/8/474有活性有活性無活性CH2OHOOOO COHH2022/8/475糖類的顯色反應(yīng)50結(jié)構(gòu)與糖類相似（三）具糖的性質(zhì)藍(lán)色糠醛吡咯脫水+HVitC2022/8/476C3OH的pKa = 4.17C2OH的pKa = 11.57酸性（四）一元酸2022/8/477L(+)抗壞血酸活性最強(qiáng)手性C（C4、C5）（五）光學(xué)活性*OOHHOO COHHCH2OH1234562022/8/478與堿反應(yīng)（六）水解反應(yīng)單鈉鹽32CONa酮酸鹽水解NaOH2022/8/479NaOH2022/8/480（七）UV特征nmnmmaxOHmaxH265l245l-+2022/8/48182

19、與氧化劑的反應(yīng)（一）鑒別試驗(yàn)二、去氫抗壞血酸OVitC831. 與AgNO3反應(yīng)(ChP2010)（銀鏡）黑3AgAgNOVitC2.鑒別試驗(yàn)二、2022/8/484（玫瑰色）（無色）鑒別試驗(yàn)二、2022/8/4853、與堿性酒石酸銅反應(yīng)4、與KMnO4反應(yīng)紅色堿性酒石酸銅2OCuVitC+24MnKMnOVitC鑒別試驗(yàn)二、2022/8/486（二）薄層色譜法 ChP2010采用薄層色譜法對維生素C制劑進(jìn)行鑒別。鑒別試驗(yàn)二、87糖類的反應(yīng)（三）或鹽酸50吡咯藍(lán)色糠醛戊糖脫水三氯醋酸VitC鑒別試驗(yàn)二、88鑒別試驗(yàn)二、2022/8/489UV（三）BP0.01mol/L HClnmmax243

20、=l58554511E%cm=2022/8/49091雜質(zhì)檢查三、VitC、 VitC注射液草酸的檢查（三）（一）（二）92指示劑 淀粉指示液原理1、碘量法（一）含量測定四、-+IIVitCH去氫抗壞血酸29394 取本品約0.2g，精密稱定，加新沸過的冷水100ml與稀醋酸10ml使溶解，加淀粉指示液1ml，立即用碘滴定液（0.05mol/L）滴定，至溶液顯藍(lán)色，在30秒內(nèi)不褪。每1ml碘滴定液(0.05mol/L)相當(dāng)于8.806mg的C6H8O6方法2、2022/8/495（1）酸性環(huán)境 d . HCl （2）新沸冷H2O減慢VitC被O2氧化速度討論4、（3）立即滴定 趕走水中O2減少

21、O2的干擾2022/8/496（4）附加劑干擾的排除片劑 滑石粉 過濾注射劑 抗氧劑 丙酮甲醛Na2SO3 NaHSO3 Na2S2O3 Na2S2O5 2022/8/497二氯靛酚滴定法（二）USPJP原理1、酚亞胺二氯靛酚，6-2VitC98自身指示終點(diǎn)法方法2、空樣二氯靛酚液空白樣品VVHAcHPO-399（2）快速滴定 2min內(nèi) （1）酸性環(huán)境 HPO3-HAc 穩(wěn)定VitC防止其他還原性物質(zhì)干擾（3）剩余比色測定 （定量過量）（測剩余染料）討論3、100（4）缺點(diǎn) 需經(jīng)常標(biāo)定貯存一周不穩(wěn)定干擾多 氧化力較強(qiáng)101HPLC法（三）1. HPLC的優(yōu)點(diǎn)靈敏度高選擇性高分離分析同步微量分

22、析干擾少 快速2022/8/41022. HPLC法分離VitC常用方法及測 定對象 對象 制劑、生物樣品、果汁方法 離子交換色譜法 離子對色譜法 分配色譜法（正、反相）血、尿、組織、細(xì)胞等2022/8/4103練習(xí)D104 維生素C能使2,6-二氯靛酚試液顏色消失，是因?yàn)榫S生素C具有（ ）A氧化性 B還原性 C酸性 D堿性練習(xí)B105 用碘量法測定維生素C注射液含量時(shí)，為消除抗氧劑焦亞硫酸鈉的干擾，可加入的掩蔽劑是（ ）A丙酸 B甲醇 C酒石酸 D丙酮練習(xí)D106苯并二氫吡喃醇第五節(jié) 維生素E OHO107生物效價(jià) 右旋體 ：消旋體 = 1.4 ：10（天然品）（合成品）dl生育酚醋酸酯10

23、8名 稱R1R2相對活性-生育酚-生育酚 -生育酚 -生育酚CH3CH3HHCH3HCH3H1.00.50.20.1*OR1HOR2CH32022/8/4109結(jié)構(gòu)與性質(zhì)一、苯環(huán) + 二氫吡喃環(huán) + 飽和烴鏈1、易溶于有機(jī)溶劑，不溶于水2、UV3、酯鍵 易水解-+Oor OHHVitE醌型化合物生育酚2022/8/4110111（一）硝酸反應(yīng)橙紅色鑒別二、75 15minOHNO3VitE生育紅生育酚112（橙紅色）生育紅生育酚HNO3強(qiáng)氧化劑CH3HOOCH3C16H33CH3H3COOCH3C16H33H3CCH3O113 取本品約30mg，加無水乙醇10ml溶解后，加硝酸2ml，搖勻，在

24、75加熱15min，溶液應(yīng)顯橙紅色。2022/8/4114三氯化鐵聯(lián)吡啶反應(yīng)O（二）紅色生育醌對生育酚聯(lián)吡啶-+2FeKOHFeVitE3115生育酚對-生育醌O弱氧化劑CH3HOOCH3C16H33CH3H3C116紅色+23Fe3+2FeNNNN117 = 41.045.5max = 284nmmin = 254nm0.01%無水乙醇中UV法（三）118薄層板 硅膠G展開劑 環(huán)己烷 -乙醚（4 ：1）顯色劑 濃硫酸（105 5min） VitE Rf = 0.7TLC法（四）2022/8/4119 檢查 三、酸度 目的：檢查維生素E制備過程中引入的游離醋酸。乙醇15ml乙醚15ml酚酞指示

25、液0.5ml氫氧化鈉滴定液（0.1mol/L）微顯粉紅色本品1.0g溶解滴加氫氧化鈉滴定液(0.1mol/L) 滴定不得過0.5ml (一)120游離生育酚 硫酸鈰滴定液（0.01mol/L）二苯胺（亮黃灰紫） 利用游離生育酚的還原性，將硫酸鈰還原成硫酸亞鈰原理1.試劑2.生育醌對生育酚-+3422CeCe（二）121（M生育酚= 430.8）例 取本品0.10g，加無水乙醇5ml溶解后，加二苯胺試液1滴，用硫酸鈰液（0.01mol/L）滴定，消耗硫酸鈰液（0.01mol/L）不得過 1.0ml。2022/8/41222.15限量3.%15.2%1001.0002154.00.1%=限量123

26、藥典規(guī)定消耗硫酸鈰液（0.01mol/L）1.0ml設(shè)：應(yīng)消耗硫酸鈰液 V ml0.011.0 實(shí)際濃度 V若硫酸鈰液濃度不是0.01000mol/L，應(yīng)重新計(jì)算硫酸鈰的消耗量硫酸鈰實(shí)際濃度）（0.101.0mlV=124例 Ce(SO4)2 =0.01020mol/L）（）（ml.mlV98001020001010=125有關(guān)物質(zhì)殘留溶劑ChP2010版對維生素E（合成型）中有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行檢查。ChP2010版對維生素E（天然型）中殘留溶劑進(jìn)行檢查。(三)（四）126四、含量測定GC法（一）GC特點(diǎn)1. 選擇性好靈敏度高速度快分離效能好揮發(fā)性低、不穩(wěn)定、極性強(qiáng)衍生化易受樣品蒸氣壓限制2022/8/4127載氣N2固定液硅酮（OV-17）擔(dān)體硅藻土或高分子多孔小球柱溫265檢測器氫火焰離子化檢測器(FID)內(nèi)標(biāo)正三十二烷 n 500 R2VitE測定的色譜條件2. 內(nèi)標(biāo)法加校正因子2022/8/4128內(nèi)標(biāo)法供試液（樣品+內(nèi)標(biāo)）內(nèi)標(biāo)物對照液（對照+內(nèi)標(biāo)）是樣品中不存在的物質(zhì)與被測組分峰靠近能與各組分完全分離與被測組分的