宏基因組學(xué)的研究報告

1、因組學(xué)研究進展及其應(yīng)用摘要：本文先簡要介紹了當(dāng)前生物化學(xué)的一些研究熱點，再針對因組學(xué)展開論述，介紹了因組學(xué)的產(chǎn)生背景和概念，當(dāng)前的研究進展及應(yīng)用。因組學(xué)嘗試通過免培方法獲得微生物的純培養(yǎng)，主要技術(shù)包括DNA的提取、文庫的構(gòu)建和目標(biāo)基因克隆的篩選，可用于開發(fā)新型酶、發(fā)現(xiàn)新基因、篩選醫(yī)藥等方面。關(guān)鍵字：因組學(xué)；因組學(xué)根本策略；文庫構(gòu)建與篩選；因組學(xué)研究進展及其應(yīng)用引言：微生物是地球上種類最多、數(shù)量最大、分布最廣的生物群。僅原核生物（細菌和古細菌）即構(gòu)成地球生物總量的的2550%1。自然條件下，包括病毒在的微生物,通過群落廣泛參與C、N、O和S等重要元素的循環(huán)轉(zhuǎn)化，在人體的食物消化、毒素降解及機體免

2、疫反響，環(huán)境污染物降解等方面發(fā)揮著重要作用2。人們對于微生物的研究主要是建立在純培養(yǎng)根底上，后來人們發(fā)現(xiàn)通過純培養(yǎng)方法估計的環(huán)境微生物多樣性只占總量的0.1%1%3，多達99%以上的微生物是不可培養(yǎng)的,其中蘊含著巨大的應(yīng)用潛能其代產(chǎn)物中可能有眾多具有應(yīng)用開發(fā)價值的化合物4。為了研究不能培養(yǎng)的微生物，一個全新的理念因組學(xué)應(yīng)運而生，該技術(shù)不需預(yù)先培養(yǎng)就能開發(fā)這些微生物基因組，目前已廣泛應(yīng)用于微生物活性物質(zhì)的開發(fā)與利用、環(huán)境微生物種群分布及動態(tài)變化分析等方面的研究5。因組學(xué)的提出為解決上述問題提供了一個可行途徑。因組學(xué)以生境中全部DNA作為研究對象，通過克隆、異源表達來篩選有用基因及其產(chǎn)物。由于突破

3、了傳統(tǒng)研究領(lǐng)域無法涵蓋不可培養(yǎng)微生物的瓶頸，因組學(xué)概念及研究方法一經(jīng)提出，就被廣泛承受。盡管在方法上還存在一定缺陷，但并不阻礙不同領(lǐng)域?qū)W者利用該方法來研究各種生境中微生物生態(tài)以及篩選功能基因的熱情，有關(guān)因組學(xué)研究的文章逐年增多4。因組學(xué)的概念因組(metagenome)的概念是指從生境樣本中取得全部微生物的基因組,而不是采用傳統(tǒng)的培養(yǎng)微生物的基因組。因組的樣本既包括可培養(yǎng)的微生物，也包括更大量的傳統(tǒng)方法無法研究的不可培養(yǎng)微生物6。而所謂因組學(xué)(也稱元基因組學(xué)Metagenomics、微生物環(huán)境基因組學(xué)MicrobialEnvironmentalGenomics、生態(tài)基因組學(xué)Ecogenomic

4、s)就是一種以環(huán)境樣品中的微生物群體基因組為研究對象，以功能基因篩選和測序分析為研究手段，以微生物多樣性、種群構(gòu)造、進化關(guān)系、功能活性、相互協(xié)作關(guān)系及與環(huán)境之間的關(guān)系為研究目的的新的微生物研究方法，一般包括克隆、構(gòu)建文庫和功能分析篩選等工作7。因組學(xué)的根本策略及方法因組學(xué)的根本策略因組學(xué)的研究還處于初期開展階段，但其研究的根本過程和根本策略已根本清楚。在此要強調(diào)的是，因組學(xué)研究有著明確的指導(dǎo)思想，它是在反向生物學(xué)原那么指導(dǎo)下，基于特定生態(tài)環(huán)境根底上，依據(jù)整體、系統(tǒng)、動態(tài)變化和相互作用的觀點，運用特殊的技術(shù)路線和方法，對研究圍中所有基因組展開研究的學(xué)科。因組學(xué)是一種整體性的研究策略，它建立在微生

5、物基因組學(xué)的迅速開展和聚合酶鏈?zhǔn)椒错憦V泛應(yīng)用的根底之上，是一種不依賴于人工培養(yǎng)的微生物基因組分析技術(shù)，涵蓋了生物信息統(tǒng)計分析和基因組兩方面的意義和技術(shù)，其策略是從特定環(huán)境中直接別離所有微生物DNA,將大片段的DNA克隆到受體菌中表達，然后根據(jù)某些生物活性篩選有應(yīng)用價值的克隆。8因組學(xué)研究的根本方法因組學(xué)以基因組技術(shù)為根底，根本程序包括：環(huán)境樣品中因組的提取，將DNA克隆到載體中;載體轉(zhuǎn)化宿主細菌建立環(huán)境基因組文庫，環(huán)境基因組文庫分析和篩選。近年來，隨著新一代高通量、低本錢測序儀的問世，因組的研究可對特定生境中的基因組片段直接進展測序而不用構(gòu)建文庫，從而防止了在文庫構(gòu)建過程中利用細菌對樣品進展克

6、隆以及克隆中引起的偏差，簡化了因組研究的根本操作，提高了測序效率，極促進了因組學(xué)開展9。因組DNA的提取環(huán)境樣品DNA的提取是文庫構(gòu)建中最重要、最關(guān)鍵的一步，不僅要盡可能地將環(huán)境中所有微生物的DNA提取出來，還要保證一定的DNA片段長度和完整性。另外，環(huán)境樣品中都含有一定的雜質(zhì)（如土壤中的腐殖酸類物質(zhì)），這些物質(zhì)可抑制分子克隆中多種酶的活性，因此必須將其除去10。目的樣品的采集須嚴(yán)格遵循取樣規(guī)那么，使樣品能最好地代表自然狀態(tài)下的微生物狀態(tài)9。根據(jù)提取因組前是否別離細胞，提取方法可分為原位裂解法和異位裂解法。原位裂解法主要是通過去污劑處理（如SDS）,酶解法（如蛋白酶K）等直接破碎樣品中的微生物

7、而使DNA得以釋放。由于無須對樣品微生物進展復(fù)性，且黏附于顆粒上的微生物細胞亦能被裂解，原位裂解所得DNA能更好地代表樣品微生物的多樣性，且操作簡單，本錢低，DNA提取率高。但該法提取的DNA片段較小（150kb），通常適用于構(gòu)建小片段文庫的DNA提取11。異位裂解法先用物理方法將微生物從樣品中別離出來，然后采用較溫和的方法抽提DNA,可獲得純度較高的大片段DNA（20500kb），但該法操作繁瑣，一些微生物基因組在別離過程中可能喪失，溫和條件下一些細胞壁較厚的微生物DNA抽提不出來，提取率較低且本錢高，通常適用于構(gòu)建大片段插入文庫的DNA提取12。因組文庫構(gòu)建與篩選因組文庫的構(gòu)建沿用了分子克

8、隆的根本原理和技術(shù)方法，并根據(jù)具體環(huán)境樣品的特點和建庫目的采取了一些特殊的步驟和策略。構(gòu)建因組文庫的技術(shù)主要包括：提取和純化環(huán)境微生物DNA、選取適宜的克隆載體以及選擇宿主菌株。根本原那么是以別離獨立基因或者一些編碼新代功能的小操縱子為目的時，以小插入片段載體（如質(zhì)粒）構(gòu)建文庫，提取和純化DNA時只需考慮純度和物種的豐度13；而大插入片段文庫（如Cosmid、Fosmid或者BAC）適合于獲取編碼復(fù)雜生物合成途徑的大基因片段或者基因簇，但是構(gòu)建這種文庫需要提取和純化更高長度和純度質(zhì)量要求的DNA。載體選擇DNA提取后就可以構(gòu)建文庫。在文庫構(gòu)建過程中，載體是文庫構(gòu)建所必需的因素,而且在活性物質(zhì)篩

9、選是也發(fā)揮極其重要的作用。載體選擇的原那么主要考慮是否有利于目標(biāo)基因擴增、表達及在篩選細胞毒類物質(zhì)時表達量的調(diào)控等。篩選目標(biāo)物不同，其載體不同,篩選技術(shù)手段也有所不同。由于活性物質(zhì)多是微生物的次生代物，其代途徑由多基因調(diào)控。因此，有必要盡量插入大片段DNA以獲得完整的代途徑多基因簇，以期到達預(yù)期目的宿主選擇宿主在篩選目標(biāo)物的過程中起到至關(guān)重要的作用。選擇宿主主要考慮重組體在宿主細胞中的穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)化效率、因表達量、篩選的目標(biāo)性狀缺陷型(如溶血或抗菌)等因素。GUNNARHAGELINA等14指出，微生物種類不同，其所產(chǎn)生的活性物質(zhì)類型明顯不同。因此，應(yīng)結(jié)合不同的研究目的和篩選不同的活性物質(zhì)考慮選

10、擇與其相適應(yīng)的宿主菌株。因文庫的篩選目前對環(huán)境因組文庫篩選有3種途徑:功能的篩選(functiondrivenscreening、)序列的篩選(sequencedrivenscreening)口底物誘導(dǎo)基因表達技術(shù)的篩選(substrateinducedgeneexpressionscreening,SIGE。X)由于因組的高度復(fù)雜性,需要通過高通量和高靈敏度的方法來篩選和鑒定文庫中的有用基因。篩選技術(shù)大致可分為3類15，基于核酸序列差異分析的篩選、基于克隆子的特殊代活性(功能驅(qū)動)的篩選、基于底物誘導(dǎo)基因的表達的篩選，也叫SIGEX法(Substrateinducedgeneexpressi

11、onscreeningmeth16o。d)因組文庫的分析根據(jù)不同的研究目的，因組文庫的分析可以從生物活性水平、化合物構(gòu)造水平以及DNA序列水平設(shè)計不同的篩選方案，可分為功能分析和序列分析。功能分析根據(jù)重組克隆產(chǎn)生的新活性進展篩選,可用于檢測編碼新型酶的全部新基因或者獲取新的生物活性物質(zhì)。例如從文庫中篩選能表達抗菌物質(zhì)的克隆。功能分析法根據(jù)重組克隆產(chǎn)生的新活性進展篩選,可用于檢測編碼新型酶的全部新基因或者獲取新的生物活性物質(zhì)8。序列分析有2種主要方法:一種是根據(jù)保守序列設(shè)計引物或探針，通過PCR擴增或雜交來篩選目的克隆。另一種方法是對含有16SrRNA等系統(tǒng)進化錨定基因的克隆進展測序。一個典型的

12、因組分析涉及多個輪次,以確保從生態(tài)環(huán)境標(biāo)本中別離到目,及盡可能多地分析DNA序列所編碼的信息。因組序列分析技術(shù)的進步近年開展起來的高通量基因組測序技術(shù)17，不需要克隆或PCR便能獲取大量的DNA序列信息，相應(yīng)地需要有新的方法來比擬這些因組數(shù)據(jù)，不斷進步的序列分析技術(shù)以及眾多生物信息學(xué)工具和數(shù)據(jù)庫便利,如針對原核微生物因組進展分析的軟件交互分析和比擬的因組分析工具MEGANDNA,所以給基因的鑒定歸屬帶來很大困難有 5 kb 以上的片段可進展有效的鑒定歸類，這一問題21此外,比擬因組技術(shù)、基因芯片技術(shù)等均可用于分析因組序列18的出現(xiàn)將為因組數(shù)據(jù)的分析提供J Coas1t9、可對多組因組數(shù)據(jù)進展等

13、 20。由于因組技術(shù)提取的是環(huán)境總（這一過程被稱為binning） ，現(xiàn)今只DNA 條形碼技術(shù)已被用來嘗試解決22 。因組學(xué)研究進展及其應(yīng)用近年來,因組學(xué)研究已滲透到各個研究領(lǐng)域,包括海洋、土壤、熱液口、熱泉、人體口腔及胃腸道，并在醫(yī)藥、替代能源、環(huán)境修復(fù)、生物技術(shù)、農(nóng)業(yè)、生物防御及倫理學(xué)等各方面顯示出重要價值。在酶學(xué)開展方面因組學(xué)顯示出強大的生命力，在發(fā)現(xiàn)新型酶以及有新型功能的酶方面已經(jīng)取得一些進展23。應(yīng)用因組開發(fā)新型酶傳統(tǒng)的新型酶的篩選方法大大限制了篩選的廣泛性和有效性24。因組學(xué)那么克制了這一限制，通過直接從環(huán)境中提取DNA樣品，盡可能為后面的篩選提供更加全面和多樣的基因資源，從而有效

14、地提高了新酶的篩選效率。一般來說，新功能酶的篩選主要還是基于活性篩選。這種不依賴于序列的方法總體上可對所有新酶的活性或特異性進展鑒定24。雖然，基于序列的篩選方法可能不像功能篩選那樣具有較強的目標(biāo)性但通過有目的地設(shè)計雜交探針或PCR引物,可一定程度地減少文庫的容量，縮小篩選的圍25。應(yīng)用因發(fā)現(xiàn)新基因由于自然界多數(shù)微生物物種及其生物量是未知的，其中存在大量不可培養(yǎng)的微生物，無法通過培養(yǎng)法進展研究，而因組學(xué)的策略那么突破了這一束縛。通過構(gòu)建因組文庫，而且從中鑒定出的大多數(shù)基因?qū)⒍际切碌幕?。應(yīng)用因篩選醫(yī)藥因組學(xué)在現(xiàn)代醫(yī)藥學(xué)中扮演著極其重要的角色，對因組文庫進展功能篩選的重要目標(biāo)是篩選在醫(yī)藥業(yè)中具

15、有重要應(yīng)用價值的產(chǎn)物100如Doreen.E等26對土壤因組文庫進展篩選，得到了2種新的抗生素TurbomycinA和B,這2種抗生素對革蘭氏陰性和革蘭氏陽性微生物菌表現(xiàn)出廣譜的抗性。展望因組學(xué)研究將大大擴展我們對生命的了解，包括了解生命如何耐受極端環(huán)境、新的生物能源、生命進化以及微生物與環(huán)境之間的相互作用。因組技術(shù)通過對環(huán)境DNA的直接克隆,為研究和利用占微生物種類99%以上的未可培養(yǎng)微生物提供了新的途徑。隨著新的科技方法的不斷開展，因組的應(yīng)用圍將會越來越廣泛。參考文獻：1WhitmanWB,DCColeman,WJWiebe.Prokaryotes:TheunseenmajorityJ.P

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