四川地區(qū)結(jié)瘤大豆根際土壤中紫云英、苜蓿和三葉草根瘤菌的

1、 四川地區(qū)結(jié)瘤大豆根際土壤中紫云英、苜蓿和三葉草根瘤菌的多樣性分析收稿日期 Received: 接受日期 Accepted: *教育部博士點(diǎn)基金項(xiàng)目（NO.20135103120003）、國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31300461）、四川農(nóng)業(yè)大學(xué)“人才引進(jìn)項(xiàng)目”和四川農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目和科研興趣計(jì)劃項(xiàng)目 Supported by Doctoral Fund of Ministry of Education of China (NO. 20135103120003), National Natural Science Foundation of China (NO. 31300461)

2、, Research Foundation for the Introduction of Talent of Sichuan Agricultural University and Innovative experiment and Research Interest Project of Undergraduate in Sichuan Agricultural University.*通訊作者 Corresponding author (E-mail: HYPERLINK mailto: )李艷梅 鐘宇舟 譚淵 何中山 徐雯芳 陳強(qiáng) 余秀梅*四川農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院微生物系 成都 610

3、041摘 要 目的分析四川地區(qū)結(jié)瘤大豆根際土壤是否存在與紫云英、苜蓿和三葉草共生結(jié)瘤的根瘤菌及其多樣性, 從而為豆科植物的在四川地區(qū)種植與輪作提供依據(jù)。方法本研究從四川盆地采集了不同種植模式下結(jié)瘤大豆根際土壤樣品31份；利用紫云英、苜蓿和三葉草進(jìn)行盆栽捕獲試驗(yàn)以獲得共生根瘤，從根瘤中分離純化出根瘤菌，對其做表型和分子鑒定；將根瘤菌回接到紫云英、苜蓿、三葉草和大豆中，以檢測根瘤菌的寄主范圍。結(jié)果苜蓿和三葉草分別在6個(gè)土壤樣品中共生結(jié)瘤，而紫云英只在2個(gè)土樣中共生結(jié)瘤，并從共生根瘤中分離出14株根瘤菌；16SrDNA基因序列的相似性分析表明這14株根瘤菌均屬于根瘤菌屬（Rhizobium），且16

4、SrDNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹分析揭示它們分屬于根瘤菌屬的不同種；回接實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明這些根瘤菌都只能讓捕獲豆科植物結(jié)瘤，而不能讓其他三種豆科植物結(jié)瘤。結(jié)論四川地區(qū)結(jié)瘤大豆根際土壤中能與紫云英 （Rhizobium astragali）、苜蓿 （Rhizobium meliloti）和三葉草 （Rhizobium leguminosarum var. trifolii）共生根瘤菌資源較少，且其與大豆根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum）分屬于不同的屬；根瘤菌的回接實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了根瘤菌的寄主專一性，且這些根瘤菌并不是大豆根瘤菌。關(guān)鍵詞 根瘤菌；大豆根際土壤；紫云英；苜蓿；三葉草 A

5、nalysis for the diversity of rhizobia nodulating Astragalus sinicus, Medicago sativa and Trifolium repens in nodulated soybean rhizosphere soil in SichuanLI Yanmei, ZHONG Yuzhou, TAN Yuan, HE Zhongshan, XU Wenfang,CHEN Qiang &YU Xiumei*Department of Microbiology, College of Resource and Environmenta

6、l Sciences, Sichuan Agricultural University, Chengdu611130, ChinaAbstract:Objective: The research aimed to analyze whether rhizobia nodulating with Astragalus sinicus, Medicago sativa and Trifolium repens appear around nodulated soybean rhizosphere in Sichuan and the diversity of the rhizobia. which

7、 should apply some useful basis information for planting leguminous plants in Sichuan.Methods: Thirty-one rhizosphere soil samples of nodulated soybean with different planting style were collected from Sichuan basin. Three leguminous plants of Astragalus sinicus, Medicago sativa and Trifolium repens

8、 were planted in the 31 soil samples to capture rhizobia. Rhizobia strains were isolated from different root nodules, and then phenotype and molecule identification were performed for them. To test nodulating host scope, rhizobia isolates was used to inoculate for Astragalus sinicus, Medicago sativa

9、 and Trifolium repens and Glycine max.Result: Medicago sativa and Trifolium repens were nodulated in six different soil samples, respectively, whereas only two Astragalus sinicus could were nodulated in two different soil samples. Therefore, 14 representative rhizobia strains were isolated from the

10、14 root nodule samples. Similarity analysis of 16SrDNA genes suggested that the 14 representative rhizobia strains were identified as Rhizobium genus. Phylogenetic tree of 16SrDNA genes indicated that the 14 representative stains were different species of Rhizobium genus. Nodulation test for each le

11、guminous plants suggested the rhizobia strains could nodulate only for the original leguminous plant but for others.Conclusion: Rhizobia nodulating Astragalus sinicus, Medicago sativa and Trifolium repens were very few in nodulated soybean rhizophere soil with rich Bradyrhizobium japonicum, and they

12、 were different genus from Bradyrhizobium japonicum. Nodulation test of rhizobia indicated the host specificity, and the isolated rhizobia strains werent Bradyrhizobium japonicum. . Keywords: HYPERLINK /liyanmei/AppData/Local/Yodao/DeskDict/frame/20140811194502/javascript:void(0);Rhizobia; Soybean r

13、hizosphere soil; Astragalus sinicus; Medicago sativa; Trifolium repens 根瘤菌(rhizobia)是一類廣泛分布于土壤中的革蘭氏陰性細(xì)菌，可以侵染豆科植物根部形成根瘤，固定空氣中的分子態(tài)氮形成氨，為植物提供氮素營養(yǎng)，其所固定的氮約占生物固氮總量的651。早期的根瘤菌分類以互接種族和寄主范圍及一些簡單的形態(tài)和生理性狀為依據(jù)2。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，根瘤菌分類學(xué)不斷地被補(bǔ)充與完善，根瘤菌系統(tǒng)發(fā)育研究更加趨于系統(tǒng)化、科學(xué)化。目前為止，根瘤菌科已發(fā)展到13屬90種3，主要有：根瘤菌屬（Rhizobium），中華根瘤菌屬（

14、Sinorhizobium），中慢生根瘤菌屬（Mesorhizobium），慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium），固氮根瘤菌屬（Azorhizobium），土壤桿菌屬(Agrobacterium)，葉瘤茵屬(Phyllobacterium)等；其中，慢生根瘤菌是固氮體系中最主要的根瘤菌4。近年來，“可持續(xù)農(nóng)業(yè)”和“綠色農(nóng)業(yè)”的提出更使得科研工作者越來越重視生物氮肥的制造者-根瘤菌，因此，根瘤菌的屬種分類還會逐漸增多。大豆是世界上種植面積最大的油料作物和飼料作物之一，我國是大豆和大豆根瘤菌的起源和分布中心，大豆根瘤菌的資源十分豐富5。四川是主要的種植的大省之一，大豆種植推廣新型的種植模式

15、，其中“麥/玉/豆”和“麥/玉/豆+苕”模式是四川發(fā)展大豆生產(chǎn)的主要模式6。土著的大豆根瘤菌對于大豆的種植模式的推廣起著促進(jìn)作用，研究價(jià)值較廣。我國的土壤中含有與大豆共生結(jié)瘤的根瘤菌較多，主要包括慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）中的日本慢生根瘤菌（B. japomicum）、遼寧慢生根瘤菌（B. liaoningense）、圓明慢生根瘤菌（B.yuanmingense）和艾爾坎慢生根瘤菌（B. elkanii）, 中華根瘤菌屬(Sinorhizobium)中的費(fèi)氏中華根瘤菌（S. fredii）以及中慢生根瘤菌屬（Mesorhizobium）中的天山中慢生根瘤菌（M. tiansh

16、anense）等 3。1982年，Harold從大豆根瘤中分離出了快生型根瘤菌，其與慢生型大豆根瘤菌完全不一樣，但其能夠使大都結(jié)瘤固氮7?？焐痛蠖垢鼍?Rhizobium fredii) 生長速度快、耐鹽、耐堿且有很強(qiáng)的結(jié)瘤競爭力，對大豆品種有明顯的選擇性，但其能與我國的栽培大都有效共生，當(dāng)兩者形成良好的共生體系后其固氮效果可超過日本慢生根瘤菌，并能夠被很好地應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中8。四川地區(qū)豆科植物較多，作為飼料和肥料的紫云英、苜蓿和三葉草在部分地區(qū)也有小面積種植，但是不像大豆一樣被推廣。紫云英不僅可以作為綠肥，還具有較高的食用、飼用價(jià)值，其根瘤菌的寄主范圍較窄，感染性比較專一，接種根瘤菌在其

17、種植成敗中起著關(guān)鍵作用，且多年種植紫云英的地區(qū)接種優(yōu)良的根瘤菌也能促進(jìn)地上部分的增產(chǎn)9。苜蓿是一種豆科牧草，口感好，營養(yǎng)高，適合大面積飼料種植，其根瘤菌的固氮能力與根瘤菌的結(jié)瘤能力有關(guān)，接種篩選高效根瘤菌后，固氮效率較高10。三葉草具有生長范圍廣的特點(diǎn)，便于種植和管理，且其優(yōu)越的固氮性能對于草料產(chǎn)量的提高和畜牧業(yè)的發(fā)展尤為關(guān)鍵，但其根瘤菌的研究相對較少11。四川地區(qū)的土壤類型主要是紫色土壤，主要分布在遂寧市，綿陽市，資陽市，樂山市，自貢市等多市。黃懷瓊121等人研究發(fā)現(xiàn)種植過大豆的紫色土壤中根瘤菌數(shù)量和種類明顯多于種植非大豆植物紫色土壤，同時(shí)證明了四川地區(qū)紫色土壤中含有豐富的大豆根瘤菌。本實(shí)驗(yàn)

18、采集的土壤樣品主要是四川地區(qū)的結(jié)瘤大豆根際紫色土壤，所以土樣中含有豐富的土著根瘤菌。目前，雖有報(bào)道對四川地區(qū)三葉草和苜蓿根瘤菌多樣性分析的相關(guān)研究，但并未發(fā)現(xiàn)四川地區(qū)紫云英的根瘤菌多樣性的研究報(bào)道，而且也沒發(fā)現(xiàn)四川地區(qū)其他的豆科植物根瘤菌與三葉草、紫云英和苜蓿共生結(jié)瘤的相關(guān)報(bào)道。本研究通過盆栽捕獲試驗(yàn)分析四川地區(qū)結(jié)瘤大豆根際土壤中是否存在與紫云英、苜蓿和三葉草共生結(jié)瘤的根瘤菌，并分析其多樣性，為在四川地區(qū)種植紫云英、苜蓿和三葉草提供依據(jù)和可利用的菌株資源，并為充分利用土地資源開展大豆與紫云英、苜蓿和三葉草等豆科植物的輪作種植提供依據(jù)。1 材料與方法1.1材料2012年8月份從四川樂山、峨眉、綿

19、陽、廣安、南充、簡陽、眉山等地采集31份結(jié)瘤大豆根際土壤（表1）。大豆種植模式包括大豆、玉米大豆套種、花生大豆套種、紅苕大豆套種、玉米大豆紅薯套作。采集結(jié)瘤的大豆根際土壤（距根表面10厘米范圍內(nèi)）裝于無菌自封袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室在室溫黑暗條件下短期保存，并盡快進(jìn)行豆科植物盆栽捕獲根瘤菌試驗(yàn)。1.2方法1.2.1豆科植物盆栽實(shí)驗(yàn)選擇紫云英、苜蓿和三葉草大小相近且完好無損的種子，用紗布包裹后95%的酒精浸泡30s，0.1%的HgCl2溶液浸泡滅菌5min，無菌水清洗5-6次13；撒在滅菌的瓊脂糖固體培養(yǎng)基（15g L-1）上，置于溫室避光發(fā)芽。 將發(fā)芽的種子種在裝有大豆根際土壤的花盆中，深度3-4cm

20、，放置在植物光照室培養(yǎng)3個(gè)月后，調(diào)查并收集根瘤。種植過程中，每隔3-5天補(bǔ)充滅菌的無氮營養(yǎng)液14（MgSO4.7H2O 0.1 g L-1，CaSO4 0.46 g L-1，K2HPO4 0.136 g L-1，KCl 0.75 g L-1，檸檬酸鐵0.075 g L-1， H2BO3 2.86 mg L-1，MnSO4 1.81 mg L-1，ZnSO4 2.2 mg L-1，CuSO4.5H2O 0.8 mg L-1，H2MoO4 0.02 mg L-1）。1.2.2菌株的分離、純化和保存用蒸餾水洗凈根瘤表面的土壤后，用0.1%的升汞溶液表面滅菌3min，再用75%的乙醇溶液再次表面滅菌5

21、min，然后用無菌水沖洗5次以確保根瘤菌表面無殘留升汞和乙醇15；取3顆根瘤放置在牛肉膏培養(yǎng)基16（牛肉膏5.0 g.L-1、蛋白胨10 g.L-1、NaCl 5.0 g.L-1，瓊脂粉 18 g.L-1，pH值為7.27.4）平板上培養(yǎng)24h以檢測表面滅菌是否徹底。于無菌條件下，選取表面滅菌徹底的根瘤放入無菌EP管中，用無菌鑷子壓破根瘤后，用無菌接種環(huán)沾取根瘤漿液，在YMA培養(yǎng)基16（甘露醇5.0 g.L-1， 酵母粉1.0 g.L-1， K2HPO4 0.5 g.L-1，MgSO4.7H2O 0.2 g.L-1，NaCl 0.1 g.L-1，CaCO3 3.0 g.L-1，瓊脂粉18 g.

22、L-1，pH7.0）上進(jìn)行平板劃線，28培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-12天后， 挑取在YMA培養(yǎng)基上不吸剛果紅色素呈乳白色略透明且有粘性的單菌落17，觀察菌體形態(tài)，以獲得表型似根瘤菌的菌株，保種于YMA斜面上（-20 ）和15%甘油管（-80 ）中。表1 結(jié)瘤大豆根際土樣信息及紫云英、苜蓿和三葉草捕獲分離的根瘤菌Table 1 The informations of soil samples from nodulated soybean rhizosphere and the rhizobia strains captured by Astragalus sinicus, Medicago sativa

23、and Trifolium repens 土樣采集地點(diǎn)大豆種植模式捕獲根瘤菌紫云英苜 蓿 三葉草SR1仁壽縣 (295507.0 N 10408 31.8 E)玉/豆套種-SR2井研縣 (293458.6 N 10403 02.0 E)玉/豆套種HR1-SR3貢井區(qū) (292324.5 N 10434 11.5 E)玉/豆+苕套種-HR11SR4富順縣 (291056.8 N 10457 10.3 E)花生/豆套種-SR5翠屏區(qū) (284518.0 N 10441 28.7 E)玉/豆套種-SR6長寧縣 (284020.5 N 10458 51.7 E)大豆單種-HR14SR7江安縣 (284

24、555.3N 10516 19.9 E)大豆單種-SR8龍馬潭 (285627.6N 10526 46.9 E)大豆單種-SR9瀘 縣 (290819.5N 10522 28.2 E)大豆單種-SR10東興區(qū) (292330.3N 1050458.1 E)大豆單種-SR11資中縣 (294949.3N 1044310.2 E)大豆單種-SR12安岳縣 (300853.3N 1052151.8 E）大豆單種-HR9SR13安岳縣 (295716.5N 1043651.3 E)苕/豆套種-HR10 SR14簡陽市 (302051.3N 1043519.5 E)玉/豆+苕套種-HR5-SR15簡陽市

25、 (301823.4N 1044559.2 E)花生/豆套種-SR16樂至縣 (300956.4N 1051013.2 E)玉/豆套種-SR17船山區(qū) (303420.2N 1053702.0 E)玉/豆套種-SR18蓬溪縣 (302817.4N 1054913.0 E)玉/豆套種-SR19武勝縣 (302208.0N 1062019.5E)大豆單種-HR8-SR20岳池縣 (304012.1N 1062726.4E)大豆單種-SR21蓬安縣 (310112.7N 1062734.9E)玉/豆套種-SR22儀隴縣 (311737.6N 1062801.9E)玉/豆套種-HR3-SR23南部縣

26、(311246.9N 1061153.8E)玉/豆套種-HR12SR24西充縣 (310901.9N 1055049.4E)玉/豆套種-SR25鹽亭縣 (311318.7N 1051737.7E)玉/豆套種HR2-SR26三臺縣 (310842.1N 1050614.6E)大豆單種-SR27中江縣 (310500.2N 1044643.6E)玉/豆套種-HR6-SR28梓潼縣 (313624.0 N 1030636.0E)玉/豆套種-HR13SR29峨眉山 (293534.7 N 10322 38.0 E)大豆單種-HR7-SR30峨眉山 (293556.9 N 10317 29.6 E)大豆

27、單種-SR31峨眉山 (293447.4N 1032634.7E)大豆單種-HR4-“-”：豆科植物在盆栽捕獲實(shí)驗(yàn)中未結(jié)瘤，因而無分離純化的根瘤菌。1.2.3 菌株的生理生化鑒定為了進(jìn)一步證明分離菌株為根瘤菌，將分離保存的根瘤菌進(jìn)行部分生理生化實(shí)驗(yàn)18 ：首先，進(jìn)行3-酮基乳糖反應(yīng)，用無菌接種環(huán)點(diǎn)種菌株在各自的酮基乳糖培養(yǎng)基上，置于28培養(yǎng)箱培養(yǎng)2d長出明顯的菌落后，加本迪尼克特試劑掩蓋菌落，室溫放置1h，觀察菌落的顏色變化，菌落周圍未出現(xiàn)黃褐色沉淀的則可初判定為根瘤菌；然后，將3-酮基乳糖反應(yīng)結(jié)果顯示為疑似根瘤菌的菌株進(jìn)行牛肉膏蛋白胨反應(yīng)測試，即：將菌株接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中35培養(yǎng)

28、72h，不接菌的做空白對照，如果接種菌株不能在試管中生長，與空白試管一樣清澈，則是根瘤菌；反之則不是根瘤菌。1.2.4 根瘤菌DNA的提取 根瘤菌DNA提取采用異硫氰酸胍（GUTC）法19：即接種根瘤菌到Y(jié)MB菌液中，在28150 r min-1的搖床中培養(yǎng)2-3天，收集菌液到滅菌的Eppendorf 管（1.5 ml）中，再將Eppendorf 管置于離心機(jī)(Centrifuge 5804R，北京博儀恒業(yè)科技發(fā)展有限公司）內(nèi)以轉(zhuǎn)速8000 r min-1離心5min，棄去上清液收集菌體。首先，往收集好菌體的離心管中加入10l的溶菌酶置于37的控溫箱裂解菌體30min， 再加入300ul的4m

29、oll-1 GUTC充分混勻后10000r min-1離心1min，轉(zhuǎn)移上清液加入硅藻土吸附液30l，靜置15min后10000r min-1離心1min，棄上清液；再加200l4moll-1GUTCC，離心后棄上清液；先用洗滌緩沖液300ul洗滌硅藻土沉淀三次，再用200ul70%酒精洗滌1次，10000r min-1離心3min棄上清液，37烘干40min，加入40ul 1TE緩沖液（Tris-HCl：0.02422g ，EDTA：0.07455g ，先用超純水溶解，待溶解后用超純水定容至200ml），55C水浴10min，取上清液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測后保存于-20C冰箱。1.2.5 1

30、6SrDNA擴(kuò)增和序列分析PCR擴(kuò)增引物為16SrDNA的基因通用引物對20P1(5-CGGGATCCAGAGTTTGATCCTGGCTCAGA ACGAACGCT-3)和P6(5-CGGGATCCTACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3)，引物由深圳華大基因公司合成。 PCR擴(kuò)增體系21(50L)：Reaction Buffer (10) 5.0 L；dNTPs (10mM) 1.0 L；P1 (10M) 1.0 L；P6 (10M) 1.0 L；Taq聚合酶(5U/L) 0.5 L；模板DNA(50 ng) 1.0 L；ddH2O 40.5 L。（PCR擴(kuò)增試劑均購置于

31、上海生工生物技術(shù)有限公司）PCR擴(kuò)增程序22：94預(yù)變性5min，94變性1min，56退火1min，72延伸1.5min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，72延伸10min。PCR產(chǎn)物用含EB的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并將陽性PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序（華大基因，深圳）。16SrDNA基因序列在GenBank數(shù)據(jù)庫里進(jìn)行BLAST分析23，獲得16SrDNA基因的序列相似性及同源基因。然后，用MEGA5.0軟件采用鄰接法（Neighbour-Joining）對根瘤菌的16SrDNA構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹24。1.2.6根瘤菌的回接實(shí)驗(yàn)根瘤菌回接試驗(yàn)采用改進(jìn)的Leonard Jar裝置25來進(jìn)行種植，即：稱取一定量的蛭石裝

32、入啤酒瓶中，用無氮營養(yǎng)液潤濕基質(zhì)，并在下方的塑料底瓶中加滿無氮營養(yǎng)液，用透氣封口膜密封瓶口上方，在滅菌鍋內(nèi)1105 Pa121滅菌30 min。將紫云英、苜蓿、三葉草和大豆四種豆科植物的種子按照上述1.2.1的方法滅菌催芽，在無菌操作臺里將表面滅菌催芽的紫云英、苜蓿、三葉草和大豆種子播種在已滅菌并冷卻后的啤酒瓶的蛭石內(nèi)，并密封瓶口，置于溫室中培養(yǎng)；待植物長出土表2-3cm后，接種根瘤菌菌懸液（108個(gè)細(xì)胞）1ml于植物根圍，并在表面鋪上已滅菌并干燥石英砂防止雜菌進(jìn)入裝置。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，并以不接菌的處理作為對照，在光照室（25光照 17h和17黑暗 7h）中培養(yǎng)35天后調(diào)查植株結(jié)瘤情況。2

33、結(jié)果與分析2.1 盆栽捕獲實(shí)驗(yàn)和菌株的分離純化紫云英在兩個(gè)土壤樣品（SR2和SR25）中結(jié)瘤，苜蓿在6個(gè)土壤樣品（SR14，SR19，SR22，SR27，SR29和SR31）中結(jié)瘤，三葉草在6個(gè)土壤樣品（SR3，SR6，SR12，SR13，SR23和SR28）中結(jié)瘤。挑選每個(gè)結(jié)瘤植株根系較大的3顆根瘤進(jìn)行表面滅菌后破瘤，將根瘤漿液在剛果紅YMA平板上進(jìn)行劃線分離培養(yǎng)3-12天后，平板上面長出均勻的乳白色鼻涕狀單菌落。每個(gè)樣品挑取2-3個(gè)單菌落進(jìn)行純化鏡檢，并選擇革蘭氏染色為陰性的短桿狀細(xì)菌，最后獲得35株菌株。2.2 菌株的生理生化鑒定 3-酮基乳糖反應(yīng)實(shí)驗(yàn)表明， 這35個(gè)分離純化的菌株中有1

34、9株菌株菌落不能在3-酮基乳糖培養(yǎng)基上形成黃褐色沉淀，從而排除這19株菌株是土壤桿菌的可能性；進(jìn)而對這19株菌株進(jìn)行牛肉膏蛋白胨反應(yīng)，結(jié)果只有14株菌株（表1）不能在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中生長，推測其為根瘤菌；其中，紫云英根瘤菌2株（HR1和HR2），苜蓿根瘤菌6株（HR3，HR4，HR5，HR6，HR7和HR8），三葉草根瘤菌6株（HR9，HR10，HR11，HR12，HR13和HR14）。2.3 根瘤菌16SrDNA基因的序列相似性分析將這14株菌株的16SrDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，其擴(kuò)增條帶均（約1400bp）與根瘤菌16SrDNA序列大小一致，且進(jìn)行PCR產(chǎn)物測序。并

35、對14株菌株的16SrDNA基因序列在GenBank數(shù)據(jù)庫BLAST比對分析，其與GenBank數(shù)據(jù)庫內(nèi)根瘤菌屬（Rhizobium）的16SrDNA相似度達(dá)到99-100% （表2）。因此，推測這14株根瘤菌菌株均屬于根瘤菌屬。提交這14個(gè)根瘤菌的16SrDNA基因序列到GenBank數(shù)據(jù)庫獲得相應(yīng)的序列編號（KM276556 - KM276569）（表2）。2.4 根瘤菌16SrDNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹利用軟件MEGA5.0的鄰接法（Neighbour-Joining）對14株捕獲的根瘤菌和根瘤菌屬（Rhizobium）中的69個(gè)不同種的標(biāo)準(zhǔn)菌株的16SrDNA構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。結(jié)果表

36、面，這14株根瘤菌在16SrDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹上被聚為三個(gè)大類，分處于不同的進(jìn)化位置上，與標(biāo)準(zhǔn)菌株的相似度各不相同。其中，來自苜蓿的6株菌株（HR3，HR4，HR5，HR6，HR7，HR8）和來自三葉草的2株菌株（HR13和HR14）在系統(tǒng)發(fā)育樹上同處于一個(gè)分支上面，且與R. pusense和R. larrymoorei遺傳距離最近；而來自三葉草的另外4株菌株（RH9，RH10，RH11和RH12）和R. nepotum和R.radiobacter被聚類在同一個(gè)大的分支上面，說明他們的遺傳距離最近，而Rhizobium sp. HR11和HR10處于一個(gè)獨(dú)立的小分支上面，說明他們與另外兩株菌株

37、的16SrDNA還有不同之處；紫云英捕獲的兩株根瘤菌（RH1和RH2）與R.phaseoli，R.trifolii，R. pisi，R.leguminosarum，R.laguerreae和R.fabae同處與一個(gè)分支上，說明他們的相似度最高，遺傳距離最近。表 2 根瘤菌的16S rDNA基因序列信息及相似性分析Table 2 The 16srDNA gene sequence information and similarity analysis of rhizobia isolates菌株編號寄主植物序列編號(GenBank)長度(bp)16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹類群16S rDNA同源序

38、列序列編號(GenBank)同源性屬種名HR1紫云英KM2765561345EF549398100%Rhizobium sp.HR2紫云英KM2765571350KC462456100%Rhizobium sp. HR3苜 蓿KM2765581363KF00822699%Rhizobium sp.HR4苜 蓿KM2765591276KF00822599%Rhizobium sp.HR5苜 蓿KM2765601300KF542923100%Rhizobium sp.HR6苜 蓿KM2765611361KF00822699%Rhizobium sp.HR7苜 蓿KM2765621354KF5429

39、2399%Rhizobium sp.HR8苜 蓿KM2765631240KF542923100%Rhizobium sp.HR9三葉草KM2765641316KF170820100%Rhizobium sp.HR10三葉草KM2765651206KF46596499%Rhizobium sp.HR11三葉草KM2765661153AB80937899%Rhizobium sp.HR12三葉草KM2765671254KF170820100%Rhizobium sp.HR13三葉草KM2765681241KF54292399%Rhizobium sp.HR14三葉草KM2765691322KF54

40、292399%Rhizobium sp.2.5 根瘤菌的回接實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步驗(yàn)證根瘤菌的寄主范圍，將盆栽捕獲的14株根瘤菌分別接種到紫云英、苜蓿、三葉草和大豆根際。結(jié)果表明，這14株根瘤菌只能與來源寄主豆科植物共生結(jié)瘤，而對其他的寄主豆科植物不能結(jié)瘤；結(jié)瘤率為100%，根瘤顏色為紅色，結(jié)瘤植株長勢高大，葉片為深綠色；未接根瘤菌對照豆科植物和其他非來源寄主豆科植物都不能共生根瘤，植株長勢相對較為矮小，且葉片出現(xiàn)黃化現(xiàn)象。圖1 根瘤菌16S rDNA基因序列的鄰接系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 1 Neighbour-Joining phylogenetic tree of 16S rDNA gene seq

41、uence for rhizobia isolates3 討論與結(jié)論大豆是四川地區(qū)的主要糧食作物之一，至2011年大豆年種植面積達(dá)630萬畝，且播種面積還在逐年擴(kuò)大。近年來，四川地區(qū)大面積推廣“玉/豆”和“玉/豆+苕”的種植模式26。本研究采集的31份大豆根際土壤來自于“玉/豆套種”、“玉/豆+苕套種”、“花生/豆套種”、“苕/豆套種”、“大豆獨(dú)種”的種植模式，包括了四川地區(qū)大豆的主要種植模式，且土壤樣品采集范圍廣。因此，土壤樣品的來源和環(huán)境條件各不相同。據(jù)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，四川大部分地區(qū)種植的大豆都能與土著根瘤菌共生結(jié)瘤，這說明四川地區(qū)土壤中含有豐富的大豆根瘤菌；而作為牧草和飼料的三葉草在四川地區(qū)種

42、植較為普遍，紫云英在四川盆地的部分地區(qū)有少量種植，而苜蓿是近年新引進(jìn)西南地區(qū)的豆科牧草。目前，我們還不清楚四川盆地土壤是否像大豆一樣含有豐富的三葉草、苜蓿和紫云英根瘤菌。為了確保土壤中含有根瘤菌且土壤環(huán)境適合根瘤菌生長，以及探索大豆與其他豆科植物的輪作模式的可行性，本研究主要采集了四川盆地結(jié)瘤大豆根際土壤來進(jìn)行盆栽捕獲實(shí)驗(yàn)，分析四川盆地結(jié)瘤大豆根際土壤中是否也含有豐富的紫云英、苜蓿和三葉草根瘤菌，這將為這三種豆科植物在四川的確的推廣種植以及其與大豆的輪作種植提供理論依據(jù)。盆栽捕獲實(shí)驗(yàn)結(jié)果為紫云英、苜蓿和三葉草只能在31個(gè)大豆根際土壤樣品中的14個(gè)土壤樣品中結(jié)瘤，這說明含有豐富大豆根瘤菌土壤中的

43、紫云英、苜蓿和三葉草根瘤菌較少；苜蓿和三葉草在6個(gè)不同土壤樣品中結(jié)瘤來，紫云英只在2個(gè)土壤樣品中結(jié)瘤，說明紫云英根瘤菌不及苜蓿根瘤菌和三葉草根瘤菌資源豐富。據(jù)報(bào)道，豆科植物能與一種根瘤菌或一種根瘤菌的幾個(gè)菌株共生結(jié)瘤，而不能與其他根瘤菌共生結(jié)瘤，且一種根瘤菌只能侵染一定范圍的豆科植物，產(chǎn)生有效根瘤，這表明豆科植物-根瘤菌共生體系的建立具有選擇性和寄主專一性27。本研究中的14個(gè)結(jié)瘤樣品中并沒有出現(xiàn)兩種以上豆科植物在同一土壤樣品中結(jié)瘤，也表明了豆科植物的根瘤菌具有寄主專一性。陳文新28等通過對中國多個(gè)地區(qū)的大量根瘤菌的研究發(fā)現(xiàn)根瘤菌與豆科植物共生體系的建立不只是細(xì)菌與植物間的兩者之間的關(guān)系決定的

44、，而是根瘤菌、植物及環(huán)境三方相互作用的結(jié)果，豆科植物只有與適應(yīng)環(huán)境條件下的根瘤菌才能夠建立共生體系。本研究中的盆栽實(shí)驗(yàn)是在溫室大棚模擬自然環(huán)境來完成的，與自然條件下農(nóng)田種植環(huán)境存在著一定的差異。因此，紫云英、苜蓿和三葉草只在少數(shù)幾個(gè)土壤樣品結(jié)瘤有可能受到外界環(huán)境的影響。然而，這14個(gè)結(jié)瘤樣品又證明了盆栽實(shí)驗(yàn)條件是可行的，且溫室盆栽種植保障了實(shí)驗(yàn)條件的一致性和匹配性，因此，豆科植物的盆栽捕獲實(shí)驗(yàn)結(jié)果是可靠的。16SrDNA由于基因序列的保守性已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌分類鑒定，主要包括16SrDNA的相似性分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。本研究捕獲的14株根瘤菌的16SrDNA基因序列與根瘤菌屬（Rhizob

45、ium）高度同源（99-100%），這說明了他們都屬于瘤菌屬菌株（Rhizobium sp.）。雖然只分析16SrDNA基因序列不能十分準(zhǔn)確地揭示出根瘤菌的分類地位，但還是能初步確定這些根瘤菌在分類學(xué)中屬的位置，對比很多確定菌株種屬的方法，16S rRNA序列測定分析更合適確定屬及屬以上分類單位的親緣關(guān)系29。從16SrDNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹上看，根瘤菌屬（Rhizobium）中所有種的根瘤菌被分為了6大類，其中12株苜蓿和三葉草根瘤菌屬于I類，2株紫云英根瘤菌屬于II類，但這14株根瘤菌在系統(tǒng)發(fā)育樹的進(jìn)化地位是不同的。其中，2個(gè)紫云英根瘤菌與三葉草根瘤菌（R. trifolii）、豌豆根瘤菌（

46、R. leguminosarum）和蠶豆根瘤菌（R. fabae）等遺傳距離最近；苜蓿捕獲不同土壤中的6個(gè)根瘤菌和三葉草捕獲的2個(gè)根瘤菌（RH13和RH14）同處于一個(gè)分支上面，與來自鷹嘴豆根際的根瘤菌（R. pusense）遺傳距離最近；另外四株三葉草根瘤菌（RH9，RH10，RH11和RH12）與放射根瘤菌（R. radiobacter）遺傳距離最近；6個(gè)三葉草根瘤菌在系統(tǒng)發(fā)育樹上處于3個(gè)不同的分支上面，說明它們雖然相似度很高，都集中于I類大分支上面，但是他們還是有所不同，這可能與來源和環(huán)境不同有關(guān)。 盆栽捕獲的14株根瘤菌對紫云英、苜蓿、三葉草和大豆四種植物的回接實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示其只能與來源

47、寄主豆科植物共生結(jié)瘤，而對其他的寄主豆科植物不能結(jié)瘤，這說明了根瘤菌的寄主專一性。大豆根際土著根瘤菌不一定與其他豆科植物結(jié)瘤固氮，也說明了大豆根瘤菌的寄主范圍較窄以及寄主的專一性30。陳文新31等在研究江西、湖北、安徽、四川和浙江等5省的67株待測菌株發(fā)現(xiàn)三葉草根瘤菌主要分屬于快生根瘤菌屬（Fast-growing rhizobium），中華根瘤菌屬(Sinorhizobium)、中慢生根瘤菌屬（Mesorhizobium）和慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）；呂飛11等研究新疆、陜西三葉草根瘤菌主要屬于三葉草根瘤菌（Rhizobium trifolii），豌豆根瘤菌（R.1egum

48、inosarum）；這說明了不同屬種的根瘤菌存在地區(qū)分布上的局限性和專一性。本研究從四川地區(qū)捕獲的三葉草根瘤菌都屬于根瘤菌屬(Rhizobium )也揭示了四川地區(qū)三葉草根瘤菌的局限性。馮春生32對西北地區(qū)天藍(lán)苜蓿的67株根瘤菌進(jìn)行16SrDNA RFLP分析發(fā)現(xiàn)苜蓿根瘤菌菌株分別歸屬于中華根瘤菌屬(Sinorhizobium)、根瘤菌屬的盧根瘤菌(R.Gallicum）、豌豆根瘤菌屬（R.1eguminosarum)、內(nèi)蒙古根瘤菌屬(R.mongolense)和土壤桿菌屬(Agrobacterium）。管風(fēng)貞13利用16SrDNA進(jìn)行序列分析確定紫云英根瘤菌的系統(tǒng)發(fā)育地位分屬于中慢生根瘤菌屬

49、（Mesorhizobiu），黃單孢菌屬（Xanthomonas)，土壤桿菌屬（Agrobacterium），根瘤菌屬（Rhizobium)等。本研究捕獲到14株根瘤菌都屬于根瘤菌屬（Rhizobium），其與前人報(bào)道的紫云英、苜蓿和三葉草根瘤菌都包含有根瘤菌屬（Rhizobium）菌株是一致的，說明四川地區(qū)耕作土壤中根瘤菌屬（Rhizobium）菌株資源相對較為豐富。回接實(shí)驗(yàn)中結(jié)瘤的豆科植物長勢好，葉片發(fā)綠，結(jié)瘤的顏色為紅色，其比未接根瘤菌對照豆科植物和其他非來源寄主豆科植物長勢較好。由胡玉嘉33等人的研究發(fā)現(xiàn)，有效瘤的顏色為肉色，是由于根瘤中含有與固氮作用密切相關(guān)的紅色的豆血紅蛋白，是固氮

50、的先決條件。因此，回接實(shí)驗(yàn)中結(jié)瘤豆科植物的紅色根瘤是有效瘤，其可以幫助豆科植物進(jìn)行生物固氮提供氮素營養(yǎng)。 紫云英、苜蓿和三葉草可作為肥料或飼料，且苜蓿還可作為水土保持植物，防止水土流失，改善生態(tài)環(huán)境，因此應(yīng)用價(jià)值的潛力較大，值得進(jìn)行大面積的推廣種植。本研究結(jié)果說明四川地區(qū)耕作土壤中紫云英、苜蓿和三葉草根瘤菌較少，因此要在四川地區(qū)種植作為飼料或肥料原材料的豆科植物（紫云英、苜蓿和三葉草）還需補(bǔ)充氮素營養(yǎng)，而僅僅利用土著根瘤菌來供給生長氮素營養(yǎng)所需是完全不可靠的；本研究捕獲的根瘤菌菌株資源可以被開發(fā)成為共生固氮豆科植物的生物菌肥，以在種植過程中增施到植物根際，為其生長發(fā)育提供氮營養(yǎng)，并可逐漸改善土

51、壤中這些根瘤菌資源缺乏的問題。同時(shí)，由于四川地區(qū)土壤中大豆根瘤菌十分豐富，而苜蓿、三葉草和紫云英根瘤菌比較少，因此可推廣大豆與這三種植物的輪作，其可以使紫云英、苜蓿和三葉草間接的利用大豆與土著根瘤菌共生固氮補(bǔ)給土壤中的氮素營養(yǎng)，從而減少它們在種植過程中工業(yè)氮肥的施用量；其還可以充分利用大豆種植前后的土地閑置期來合理地輪作大豆、紫云英苜蓿和三葉草等，達(dá)到充分利用土地資源的目的。參考文獻(xiàn) References1 趙宇樞,段玉璽,王媛媛,陳立杰,尹麗娜. 遼寧省大豆根瘤菌資源抗逆性及生防潛力研究J.大豆科學(xué),2009,28(1):113-117 ZHAO QS,DUAN YQ,WANG YY,CHE

52、N LJ,YI LN.Stress Resistance and Biocontrol Potential of Soybean Rhizobia Resourses Isolated From LiaoningProvinceJ.Soybean Science,2009,28(1):113-1172 雷霞,陳文華,隋新華,陳文新.根瘤菌多相分類的研究進(jìn)展J.微生物雜志,2007,27(6):77-80 LEI X,CHEN XH, SUI XH,CHEN WX.The research progress of polyphasic taxonomy of rhizobia resumptiv

53、elyJ.Journal Of Microbiology,2007,27(6):77-803 陳文新,汪恩濤.中國根瘤菌M.北京:科學(xué)出版社,2011,66-71 CHEN WX,WANG ET.Chinese rhizobia M.Beijing:Science Press,2011,66-71 4 馮瑞華.慢生型大豆根瘤菌的遺傳多樣性研究J.應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào), 2000, 6(2):176-181 FENG RH,Stugy on genetic diversity of slow-growing rhizobia of glycine maxJ.Chin J Appl Environ

54、Biol ,2000, 6(2):176-1815 何慶元,玉永雄,吳萍,王松華,何華奇,周燕.安徽地區(qū)大豆根瘤菌遺傳多樣性研究J.激光生物學(xué)報(bào),2008,17(4):514-518 HE QY,WANG YX,WU P,WANG SH,HE HQ,ZHOU Y, Stugy on genetic diversity of Soybean rhizobia Isloate Anhui AreasJ.ACTA Laser Biology S inica ,2008,17(4):514-5186 張明榮,吳海英.四川間套作大豆生產(chǎn)現(xiàn)狀與發(fā)展分析N.中國種業(yè),2009,10:16-18 ZHANG

55、MR,WU HY.Sichuan intercropping soybean production present situation and the development analysis N.China Seed Industry ,2009,10:16-187 HYPERLINK /search?author1=HAROLD+H.+KEYSER&sortspec=date&submit=Submit HaroldH.Keyser, HYPERLINK /search?author1=B.+BEN+BOHLOOL&sortspec=date&submit=Submit B.BenBohl

56、ool, HYPERLINK /search?author1=T.+S.+Hu&sortspec=date&submit=Submit T.S.Hu, HYPERLINK /search?author1=DEANE+F.+WEBER&sortspec=date&submit=Submit DeaneF.Weber.Fast-growing rhizobia isolated from root nodules of soybeanJ.SCIENCE ,1982,215 (4540):1631-16328 梁紹芬,姜瑞波,關(guān)妙姬.快生型大豆根瘤菌(Rhizobium fredii)與我國栽培大豆

57、共生有效性研究J.中國農(nóng)業(yè)科學(xué),1995,28(5):14-21 LIANG SF,JIANG RB,GUAN MJ.Studies on symbotic effects betweenRhizobium fredii srains &Chinese soybesn cultivarsJ.Scientia Agricuitua Sinica ,1995,28(5): 14-219 張學(xué)賢,李阜棣,曹燕珍,陳華癸.紫云英根瘤菌分子遺傳學(xué)研究進(jìn)展J.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)報(bào),2003,22(1):77-83 ZHANG XX,LI PL,CAO YZ,CHEN HG.Molecular Genetics

58、of Astragalus sincus RhizobiaJ.Journal of Huazhong Agricultural University ,2003,22(1):77-8310 曾昭海,隋新華,胡躍高,陳文新,陳丹明,郜瑞路.紫花苜蓿根瘤菌高效共生體篩選及田間作用效果J.草業(yè)科學(xué),2004,13(5):95-100 ZENG ZH,SUI XH,HU YG,CHEN WX,CHEN DM,HU RL.Screening of highly-effective Sinorhizobium meliloti strains forMedicago sativa cultivars an

59、d their field inoculationJ.HYPERLINK ./././liyanmei/AppData/Local/Yodao/DeskDict/frame/20140811194502/javascript:void(0);prataculturalHYPERLINK ./././liyanmei/AppData/Local/Yodao/DeskDict/frame/20140811194502/javascript:void(0);science，2004,13(5):95-100 11 呂飛,蔣欣,徐佳潔,朱博,韋革宏.新疆和陜西三葉草屬根瘤菌16SrDNA多生態(tài)及系統(tǒng)發(fā)

60、育研究J.草業(yè)學(xué)報(bào),2009,5(17):304-309 LV F,JIANG X,XU JJ,WEI GH.16SrDNA Polymorphism and Phylogeny of Rhizobia Isolated from Trif olium in Xinjiang Uygur Autonomous Region and Shaanxi ProvinceJ.Acta Prataculturae Sinica，2009,5(17):304-309 12 黃懷瓊,曾玉霞,龍碧華,周冬冬,周岷江.四川紫色土壤中土著大豆根瘤菌的資源分布J西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào).2000,13(3):39-44 HUA