TaKaRa MutanBest 定點突變試劑盒說明書

1、研究用TaKaRaTaKaRaMutanBESTKit說明書1Spl500plISO|Jl50pl25pl150pl4.保存：-20C試劑盒原理試劑盒莊理乩圖I,全套操作的需爐卜吋,簡單說明如下a1.設計一對5-端鄰接，a端方向相反的引物用以導入變異點*Z進行PER擴增使用高保夏DNA累合酶PyfubestDNAPolymerasebPUR片段的耒端平滑北及日苯端瞬酸化反應（在同一反應際內(nèi)進行.反應只需10牙鐘口身連接反應（梗用本試劑盒中的DNA高效連接液Li躺OonSolutionI,連接反應只需30分鐘-1小時b反質(zhì)粒DMA轉(zhuǎn)化，桃選變異體團1.TaKaRaMutanBESTKU原理圖t導

2、A孌畀SB布InsertVsGlorPGRBlunbngKinalK3nS.Krg購on:目卑連護耳入吏舁iS亠克異厚扎引愉嘆對應引常制品色期本制品是利用PCR技術進行定點突變掃作西試劑盒。具原理杲利用導入變昇點的引物進行PCR反應后,對PCR產(chǎn)物港行末端平滑化及E債酸P）化處理.再用髙效連接試劑LigationSolutionI進疔自身連接環(huán)化反血）.然后轉(zhuǎn)化，捉取突變悴DNAn本試劑盒的原理十分簡單，但陽潘在卩E尺過程中的錯配率限制了這一技術的應用*現(xiàn)在，Tka巫的PyfrybestDNAPolymeraseUiA技術得到了酗大程度的左揮PyrobestNAPolymerase不僅旦左超豈

3、的煤真性（Fidelity人丼且和滄艙陽為彳具有同祥的擴増效率匸與基他突蠻試劑盤相比7本試劑盤的最大特點是捉作方便、價舉,只需一天時間便可完覇整牛操作,并且平曼載也宿主菌的限制-制咼內(nèi)容(20雙量)Pyroi?fsiUNAPolynnenase(5U/jjI)IGxFyoiestBufferII(JNTPMixture(N5mMeach)IQxBIuintingKnaUonBufferBluiiflnyKnadonEnzytneMixLigationSolutionI操作方法I)PCR反應1設計合成變異導入Primer和對應的PCRfflPrimBro對應PCR用Primer的印端晴基的2補誦

4、基必探和變異導入Primer的5端破基相鄰接f見圖12配制下列組成的PCR反應綾，全量50訓匚試劑名稱使用量FyTubesfDNAPolymerase(5U/jjI)L25pl1OxPyrobsst0ufferII5pldNTPMlxturs(各)斗UPrimer1(20pM1PlPrimer2(20pM)1PlTemplate001-1ng滅菌蒸網(wǎng)水upto50pl按下列反應條杵進行PCR反應。94aC:30secj550.30sec卜30Cydes72QCf5mlnJ對PCR反應液進行1%Agarose凝膠電泳切膠回收日的DN4片段(DNAFragmentII)BluntingKinati

5、on反應在徹量離心管中配制F列反應液。試劑名稱使用量DNAFragment約1pmollOBIuntingKinationBuffer2plBluntingKnationEnzymeMix1plddH；Oupto20pl37C反應10分鐘。70C反應10分鐘。III)Ligation反應取約0.25pmol(5pI)上記3.的溶液于新的微量離心管中。加入5pI的LigationSolutionI,均勻混合。16C反應1小時。反應液全量轉(zhuǎn)化至100pI的感受態(tài)細胞中。*用電穿孔法轉(zhuǎn)化時,先用乙醇沉淀等方法置換連接液后再進行轉(zhuǎn)化。IV結果在piUCI怡載休中插入罰2,000bp的DNA片隈在DNA片段的大均中間部位對3個聯(lián)基進行突變實驗結杲如下,便用的JM109ConnpetentCell的轉(zhuǎn)化效率為了叮0嘰嚇UC11久InsertDNA皓辰bp)白色Colony數(shù)fpgDNA突變比率（%r2,0009.8x1Q49S白世菌落數(shù)中舍有突變UNA片段的比率。注盍爭項當茸悴與捕人的DNA片段的總疋度小于5kb時，使用本試劑盒戦為合適；如果敦體與捕入DNA片段長廈丸低時.不推琴使用本試劑盒。PCR反血齋的DNA片段應理行切膠回收純化，然庁再講行自牙連接反應這樣可取提高突變成