《基因組學(xué)》課件第10章 RNAi技術(shù)-2015

1、第十章RNAi技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展一、RNAi的發(fā)現(xiàn)基因共抑制現(xiàn)象一、RNAi的發(fā)現(xiàn)線蟲的RNAi現(xiàn)象一、RNAi的發(fā)現(xiàn)線蟲的RNAi現(xiàn)象RNAi 研究史 20多年前，在對矮牽?；ǎ╬etunias）進(jìn)行的研究中發(fā)現(xiàn)協(xié)同抑制現(xiàn)象cosuppression，導(dǎo)入的基因和其相似的內(nèi)源基因同時都被抑制。 96年前后，研究發(fā)現(xiàn) 注入反義RNA及正義鏈RNA都能抑制線蟲par-1 基因的表達(dá)；三年后，首次將雙鏈RNA注入到線蟲中,結(jié)果表現(xiàn)出比單獨注射正義鏈或者反義鏈都要強(qiáng)得多的基因沉默效果，這種技術(shù)的成熟使得大規(guī)模篩選線蟲RNAi誘導(dǎo)的功能缺失突變體成為可能，并引發(fā)后繼的大量針對這種模式生物基因敲除的研究

2、。 在果蠅的研究中同樣發(fā)現(xiàn)RNAi。通過顯微注射或者通過基因槍將dsRNA注入果蠅胚胎中能夠引發(fā)基因沉默。在過去的幾年中RNAi技術(shù)在果蠅的研究中成為一種反向遺傳工具，用于鑒定功能缺失表型。 2001年Elbashir等 Nature上首次報道通過21個核苷酸的siRNA成功地在哺乳動物培養(yǎng)細(xì)胞中誘導(dǎo)特異性基因沉默。隨后，在小鼠等多種細(xì)胞中也取得了成功。 RNAi廣泛發(fā)現(xiàn)于錐蟲、擬南芥、水螅、渦蟲、真菌、斑馬魚、果蠅、昆蟲、蛙類、鳥類、大鼠、小鼠、猴一直到人類的所有真核生物中。 在小鼠早期胚胎和大腸桿菌中也存在RNAi現(xiàn)象。在果蠅和線蟲體內(nèi)，RNAi可以達(dá)到基因敲除的效果一、RNAi的發(fā)現(xiàn) R

3、NA 干擾(RNA interference, RNAi) 是指雙鏈RNA (dsRNA) 分子引起的序列特異性的靶基因mRNA降解, 阻止mRNA翻譯，從而導(dǎo)致內(nèi)源或外源靶基因沉默的一種機(jī)制。RNA 干擾 ( RNAi )一、RNAi的發(fā)現(xiàn)二、RNAi的發(fā)生機(jī)制 目前RNAi 的作用機(jī)制主要是在線蟲和果蠅生物體內(nèi)被闡明的，后來研究發(fā)現(xiàn)它和植物的共抑制（cosuppression）、菌類的靜息(quelling)作用有著共同的作用機(jī)理，都是由同源轉(zhuǎn)基因、RNA病毒和雙鏈RNA 等誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種特定序列的RNA降解機(jī)制，其過程都由起始、效應(yīng)和倍增三個階段組成。二、RNAi的發(fā)生機(jī)制起始階段效應(yīng)階

4、段 生物體由于RNA 病毒入侵、轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄、基因組中反向重復(fù)序列轉(zhuǎn)錄以及外源基因?qū)氲仍虍a(chǎn)生了dsRNA 分子。這些dsRNA 在細(xì)胞內(nèi)首先由一種類似RNA 酶(RNase)的酶Dicer切割為21-25 nt的小分子雙鏈，正是這些小分子dsRNA 直接誘導(dǎo)RNAi的發(fā)生，這種dsRNA 分子被稱為小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）。起始階段二、RNAi的發(fā)生機(jī)制 Dicer 是一種ATP依賴性內(nèi)切酶，在基因Rde-1 編碼的蛋白的幫助下dsRNA 與Dicer 結(jié)合，形成酶-dsRNA 復(fù)合體，在ATP 作用下，Dicer先將dsRNA 解旋，接著將其切

5、割成 有2個突出的單核苷酸的21-23個核苷酸小片段。起始階段二、RNAi的發(fā)生機(jī)制 siRNA與RNAi 特異酶結(jié)合，形成一種能夠特異降解與siRNA 同源的靶mRNA 的復(fù)合物，稱之為RISC（RNA-induced silencing complex）。 siRNA 變性，雙鏈解開， RISC 激活，RISC具有結(jié)合和切割mRNA的作用。siRNA的反義鏈通過堿基配對定位到同源mRNA上，RISC具有核酸酶的功能，在結(jié)合部位切割mRNA，切割位點即是與siRNA中反義鏈互補(bǔ)結(jié)合的兩端。-在距siRNA 3端12 個堿基的位置將靶mRNA 切斷，從而使目標(biāo)mRNA 降解。效應(yīng)階段二、RNA

6、i的發(fā)生機(jī)制效應(yīng)階段二、RNAi的發(fā)生機(jī)制 切斷后的mRNA 或者被核酸外切酶所降解，或者可能成為異常RNA，在RNA 依賴性RNA多聚酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）的作用下形成新的dsRNA，再次被Dicer 識別并切斷，形成新的siRNA 進(jìn)一步作用于另外的靶mRNA， siRNA 通過這種方式大量擴(kuò)增，從而使靶mRNA 漸進(jìn)性減少，導(dǎo)致目的基因沉默，呈現(xiàn)RNAi 現(xiàn)象。倍增階段二、RNAi的發(fā)生機(jī)制倍增階段二、RNAi的發(fā)生機(jī)制RNAi作用過程用到兩個關(guān)鍵的酶和復(fù)合體：DicerRISC二、RNAi的發(fā)生機(jī)制RNAi能夠在多重水平上介導(dǎo)基因沉默。

7、轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默內(nèi)源性基因沉默二、RNAi的發(fā)生機(jī)制二、RNAi的發(fā)生機(jī)制高特異性 只降解與之序列相對應(yīng)的mRNA，而其他mRNA的表達(dá)則不受影響三、RNAi的作用特點高效率與反義RNA技術(shù)相比，RNAi技術(shù)在低于反義核酸幾個數(shù)量級的濃度下，就能使目標(biāo)基因的表達(dá)降到極低水平甚至完全抑制可控性 研究基因功能時，與T-DNA和轉(zhuǎn)座子技術(shù)相比，RNAi技術(shù)可以與細(xì)胞特異性啟動子和可誘導(dǎo)系統(tǒng)結(jié)合使用，其抑制基因表達(dá)的時間可以隨意控制在發(fā)育的不同時期或不同器官中，有選擇地進(jìn)行?？蓚鬟f性RNAi抑制基因表達(dá)的效應(yīng)可以穿過細(xì)胞界限,在不同細(xì)胞間長距離傳遞和維持,在某些生物中RNAi還可

8、以傳遞到后代中去。三、RNAi的作用特點 RNAi技術(shù)不僅可以特異性的抑制一個目的基因的表達(dá)，還可以同時沉默同一基因家族的多個基因，這是利用傳統(tǒng)的基因突變的方法無法實現(xiàn)的。四、RNAi研究的流程和方法四、RNAi研究的技術(shù)方法1. siRNA序列設(shè)計siRNA （small interfering RNAs ），即小分子干擾RNA（21-25bp），是指為能夠以同源互補(bǔ)序列的mRNA為靶目標(biāo)并將其降解而介導(dǎo)RNA干擾途徑的短片段雙鏈RNA分子。根據(jù)所選的siRNA序列的不同，可分為 編碼區(qū)RNAi技術(shù) 啟動子區(qū)RNAi技術(shù)各自優(yōu)缺點四、RNAi研究的技術(shù)方法1. siRNA序列設(shè)計編碼區(qū)siR

9、NA序列設(shè)計遵循以下原則:從mRNA 的AUG起始密碼開始尋找“AA”二連序列，并記下其3端的19個堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點。GC含量在30%50%左右。將潛在的序列和相應(yīng)的基因組數(shù)據(jù)庫（人，或者小鼠，大鼠等等）進(jìn)行比較，排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列。例如使用BLAST.選出合適的目標(biāo)序列進(jìn)行合成。設(shè)置適當(dāng)?shù)膕iRNA對照: 1) 與靶定siRNA有相同的堿基組成，但排列完全不同，且不與其它基因有同源性 AGCCTTAGCTTAAGTCCTAG SN(G4,C5,A5,T6) ATTCGTGCTCAATGCAATCG NSN(G4,C5,A5,T6) 2) 1-2堿基錯

10、配的 siRNA對照 (1-2nt) AGCCTTAGCTTAAGTCCTAG AGCCTTAGTTTAAATCCTAG T 和 A錯配四、RNAi研究的技術(shù)方法1. siRNA序列設(shè)計四、RNAi研究的技術(shù)方法1. siRNA序列設(shè)計NCBI的RefSeq數(shù)據(jù)庫中已有大鼠、小鼠和人類的全部基因的siRNA序列。使用在線工具設(shè)計siRNA序列。已經(jīng)證實有效的siRNA序列也可以在網(wǎng)頁中找到。四、RNAi研究的技術(shù)方法2. siRNA的制備方法化學(xué)合成法體外轉(zhuǎn)錄法RNase降解長片段dsRNAsiRNA表達(dá)載體siRNA表達(dá)框架四、RNAi研究的技術(shù)方法2. siRNA的制備方法-化學(xué)合成法方便

11、。價格高。由于價格比其他方法高，為一個基因合成34對siRNAs 的成本就更高了，比較常見的做法是用其他方法篩選出最有效的序列再進(jìn)行化學(xué)合成。最適用于：已經(jīng)找到最有效的siRNA的情況下，需要大量siRNA進(jìn)行研究；不適用于：篩選siRNA等長時間的研究，主要原因是價格因素體外轉(zhuǎn)錄法四、RNAi研究的技術(shù)方法2. siRNA的制備方法-體外轉(zhuǎn)錄法四、RNAi研究的技術(shù)方法2. siRNA的制備方法-體外轉(zhuǎn)錄法快，性價比高。不足之處：實驗的規(guī)模受到限制，雖然一次體外轉(zhuǎn)錄合成能提供足夠做數(shù)百次轉(zhuǎn)染的siRNAs，但是反應(yīng)規(guī)模和量始終有一定的限制。最適用于：篩選siRNAs，特別是需要制備多種siR

12、NAs，化學(xué)合成的價格成為障礙時。不適用于：實驗需要大量的、一個特定的siRNA。長期研究。 四、RNAi研究的技術(shù)方法2. siRNA的制備方法 -RNase降解長片段dsRNA通常選擇2001000堿基的靶mRNA模板，用體外轉(zhuǎn)錄的方法制備長片段雙鏈RNA，然后用RNase (or Dicer) 在體外消化，得到含有多種siRNAs的“混合雞尾酒”。由于siRNA混合物中有許多不同的siRNAs，通常能夠保證目的基因被有效地抑制。 四、RNAi研究的技術(shù)方法2. siRNA的制備方法 -RNase降解長片段dsRNA其他制備siRNA的方法的缺陷是需要設(shè)計和檢驗多個siRNA序列以便找到一

13、個有效的siRNA。這種方法就可以避免這個缺陷。缺點也很明顯，就是有可能引發(fā)非特異的基因沉默，特別是同源或者是密切相關(guān)的基因。最適用于：快速而經(jīng)濟(jì)地研究某個基因功能缺失的表型不適用于：需要一個特定的siRNA進(jìn)行研究，特別是基因治療 四、RNAi研究的技術(shù)方法2. siRNA的制備方法-siRNA表達(dá)載體使用這類載體，需要2段編碼短發(fā)夾RNA序列的DNA單鏈，退火，克隆到相應(yīng)載體的 pol 啟動子下游。由于涉及到克隆，這個過程需要幾天的時間，同時也需要經(jīng)過測序以保證克隆的序列是正確的。不過幸好載體容易大量擴(kuò)增，這個優(yōu)點足以彌補(bǔ)所有缺陷，特別是當(dāng)載體在實驗中確實有效的時候。四、RNAi研究的技術(shù)

14、方法2. siRNA的制備方法-siRNA表達(dá)載體優(yōu)點在于這是眾多方法中唯一可以進(jìn)行長期研究的方法載體可以在細(xì)胞中持續(xù)抑制靶基因的表達(dá)。最適用于：已知一個有效的siRNA序列，需要維持較長時間的基因沉默，或者需要用抗生素篩選能表達(dá)siRNA的細(xì)胞。長期研究。不適用于：篩選siRNA序列（其實主要是指需要多個克隆和測序等較為費時、繁瑣的工作） 四、RNAi研究的技術(shù)方法2. siRNA的制備方法-siRNA表達(dá)框架 siRNA表達(dá)框架(siRNA expression cassettes，SECs)是一種由PCR得到的siRNA表達(dá)模版，能夠直接導(dǎo)入細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)而無需事前克隆到載體中。siRNA

15、表達(dá)框架包括一個RNA pol 啟動子，一段發(fā)夾結(jié)構(gòu)siRNA，一個RNA pol 終止位點。SECs為篩選siRNA的最有效工具。四、RNAi研究的技術(shù)方法如果在PCR兩端添加酶切位點，那么通過SECs篩選出的最有效的siRNA后，可以直接克隆到載體中構(gòu)建siRNA表達(dá)載體。構(gòu)建好的載體可以用于穩(wěn)定表達(dá)siRNA和長效抑制的研究。 最適用于：篩選siRNA序列，在克隆到載體前篩選最佳啟動子；不適用于：長期抑制研究。（如果克隆到載體后就可以了） 。 2. siRNA的制備方法-siRNA表達(dá)框架四、RNAi研究的技術(shù)方法四、RNAi研究的技術(shù)方法四、RNAi研究的技術(shù)方法3. siRNA的導(dǎo)入

16、磷酸鈣共沉淀電穿孔法葡聚糖法機(jī)械法脂質(zhì)體介導(dǎo)法五、RNA干擾效果的檢測可從mRNA和蛋白質(zhì)兩方面進(jìn)行。 mRNA：RT-PCR；定量PCR；Northern 雜交等。 蛋白質(zhì)：Western雜交；ELISA；免疫熒光等。細(xì)胞的代謝過程，生理生化系數(shù)等表型參數(shù)的變化是RNAi效果最終和最大的體現(xiàn)。六、RNAi的應(yīng)用1.在功能基因組中的應(yīng)用2.在基因治療中的應(yīng)用 六、RNAi的應(yīng)用1. 在功能基因組中的應(yīng)用由于RNAi具有高度的序列專一性，可以特異地使特定基因沉默，獲得功能喪失或降低突變，因此RNAi可以作為一種研究基因功能的強(qiáng)有力工具，用于功能基因組的研究。將功能未知的基因的編碼區(qū)（外顯子）或啟

17、動子區(qū)，以反向重復(fù)的方式由同一啟動子控制表達(dá)。這樣在轉(zhuǎn)基因個體內(nèi)轉(zhuǎn)錄出的RNA可形成dsRNA，產(chǎn)生RNA干擾，使目的基因沉默，進(jìn)一步研究目的基因的功能。研究基因功能的新工具。 目前開發(fā)的濕性老年黃斑變性病的治療藥物“貝伐西尼（Bevasiranib)”為一種siRNA，其可選擇性地作用于血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，誘導(dǎo)新血管形成以抑制VEGF的表達(dá)，并通過了三期臨床試驗。此外，目前正在研發(fā)含有靶向多種基因的siRNA的治療藥物。六、RNAi的應(yīng)用2.在基因治療中的應(yīng)用 六、RNAi的應(yīng)用2.在基因治療中的應(yīng)用 六、RNAi的應(yīng)用六、RNAi的應(yīng)用2.在基因治療中的應(yīng)用 治療HIV 感染針對

18、HIV病毒研究有Jacque等設(shè)計的抑制HIV 1長末端重復(fù)序列、附件基因vif和nef表達(dá)的siRNA，Lee等針對rev轉(zhuǎn)錄子設(shè)計的siRNA及Novina等針對HIV病毒gag基因設(shè)計的siRNA，其基本策略都是選擇HIV病毒或宿主細(xì)胞基因為靶點。六、RNAi的應(yīng)用2.在基因治療中的應(yīng)用 治療病毒感染合成靶向HBV基因組不同部分的2種siRNA并分別與表達(dá)載體連接后導(dǎo)入感染HBV的小鼠。結(jié)果發(fā)現(xiàn)治療組小鼠體內(nèi)肝炎病毒RNA的數(shù)量與對照組相比減少了92%。治療組小鼠沒有發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重的副作用。將合成的針對HCV基因組的siRNA導(dǎo)入人肝腫瘤細(xì)胞系中，使病毒特異性蛋白表達(dá)和RNA合成降低90%，RNAi效應(yīng)持續(xù)超過72小時。使用RNAi載體可使RNAi效