藥物分析 藥物含量測定

1、藥品的含量 藥品中有效成分（藥物）量的多少，是評價藥品質(zhì)量優(yōu)劣、保證藥品療效的重要手段，必須符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的限度要求。含量測定 對藥品中有效成分進(jìn)行定量分析，其結(jié)果表示有兩種形式：原料藥以百分含量表示，制劑以標(biāo)示量的百分含量表示。中國藥典中各種含量測定采用方法主要有容量分析法、光譜分析法和色譜分析法3種類型。 化學(xué)分析法 重量分析容量分析含量測定儀器分析法效價測定（生物學(xué)法）紫外高效液相色譜法氣相色譜法 第1節(jié)容量分析法（滴定法）1.滴定分析：是將一種已知準(zhǔn)確濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液滴加到被溶液中，直到化學(xué)反應(yīng)完全為止，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度和體積求得被測組份含量的一種方法。在進(jìn)行滴定分析時：一方面要會配制滴

2、定劑溶液并能準(zhǔn)確測定其濃度另一方面要準(zhǔn)確測量滴定過程中所消耗滴定劑的體積滴定：將滴定液從滴定管滴加到被測物質(zhì)溶液中的過程化學(xué)計量點 ：滴加的標(biāo)準(zhǔn)溶液與待測物質(zhì)按照一定的化學(xué)反應(yīng)式定量反應(yīng)完全之點 滴定終點 ：在滴定過程中，指示劑正好發(fā)生顏色變化的轉(zhuǎn)變點。指示劑：能夠指示終點變化的試劑。滴定誤差：滴定終點與化學(xué)計量點不一定恰好符合，它們之間存在著很小的差別，由此引起測定結(jié)果的誤差稱為滴定誤差。（6）標(biāo)準(zhǔn)溶液 已知準(zhǔn)確濃度的溶液（mol/L）2.滴定液的配制和標(biāo)定基準(zhǔn)物質(zhì)：能用來直接配制標(biāo)準(zhǔn)溶液的化學(xué)試劑滴定度：每毫升標(biāo)準(zhǔn)溶液相當(dāng)于被測物質(zhì)的質(zhì)量（g或mg），以符號T表示直接法（不需標(biāo)定）間接法（

3、標(biāo)定）：先將其配制成近似于所需濃度的溶液，然后利用基準(zhǔn)物質(zhì)或另一種標(biāo)準(zhǔn)溶液來確定其準(zhǔn)確濃度。標(biāo)定：用基準(zhǔn)物質(zhì)或標(biāo)準(zhǔn)溶液準(zhǔn)確測定滴定液濃度的過程。校正因子（F）：表示滴定液準(zhǔn)確濃度與標(biāo)示濃度的比值。其范圍應(yīng)在之間，超出該范圍應(yīng)加入適當(dāng)?shù)娜苜|(zhì)或溶劑予以調(diào)整，并重新標(biāo)定。標(biāo)定注意事項 ：a.操作中所用的天平、滴定管、容量瓶和移液管均應(yīng)校正合格的。b.標(biāo)定工作應(yīng)在室溫（1030）下進(jìn)行，并記錄標(biāo)定時的溫度。c.根據(jù)滴定液的消耗量選用適宜的滴定管，盛裝滴定液前，先用少量滴定液淋洗三次，盛裝滴定液后，應(yīng)用小燒杯蓋住管口。d.標(biāo)定中的空白試驗，是指在不加供試品或以等量溶劑代替供試液的情況下，按同法滴定所得的

4、結(jié)果。e.標(biāo)定工作應(yīng)由初標(biāo)者和復(fù)標(biāo)者在相同條件下各做3份平行試驗，3份平行試驗結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）不得大于0.1%；初標(biāo)者的平均值和復(fù)標(biāo)者的平均值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）也不得大于0.1%；最后結(jié)果按初、復(fù)標(biāo)二者的平均值計算，取4位有效數(shù)字。f.配制后的滴定液按藥典規(guī)定的貯藏條件儲存，并在瓶外貼上標(biāo)簽，注明滴定液名稱、標(biāo)示濃度、真實濃度或F值、配制和標(biāo)定日期、標(biāo)定時的溫度、配制者、標(biāo)定者、復(fù)標(biāo)者等。g.當(dāng)?shù)味ㄒ簶?biāo)定時間過長（一般不超過3個月）、或標(biāo)定與使用時的溫度超過10時，應(yīng)加溫度補償值或重新進(jìn)行標(biāo)定，。h.當(dāng)?shù)味ㄒ撼霈F(xiàn)渾濁或其他異常情況時，不得使用。倒出剩余的滴定液不得再倒回原瓶，

5、避免污染。3.滴定的分類按反應(yīng)方式分類：直接滴定法：滴定液與被測物質(zhì)直接反應(yīng)間接滴定法：包括剩余滴定和置換滴定 含量%=含量%=按反應(yīng)類型分：酸堿滴定：在水溶液中以酸堿中和反應(yīng)來測定物質(zhì)含量的方法配位（絡(luò)合）滴定法：以形成穩(wěn)定配合物的配位反應(yīng)為基礎(chǔ)的滴定分析法。 用于金屬離子的測定采用金屬指示劑（如鉻黑T），如EDTA（乙二胺四醋酸二鈉）氧化還原滴定法： 碘量法：如碘滴定液、硫代硫酸鈉滴定液、淀粉指示劑鈰量法：以硫酸鈰Ce（S04）2作為滴定液 、鄰二氮菲作指示劑 亞硝酸鈉滴定法：溴量法 ：Na2S2O3滴定液 、Br2滴定液 沉淀滴定法：以沉淀反應(yīng)為基礎(chǔ)，多以硝酸銀為滴定液，也稱銀量法。按所

6、用指示劑的不同分為鉻酸鉀指示劑法鐵銨礬指示劑法吸附指示劑法非水滴定法：在非水溶劑（有機溶劑與不含水的無機溶劑）中進(jìn)行滴定分析的方法。 非水堿量法：是以冰醋酸為溶劑，高氯酸為滴定液，甲紫微指示劑，測定弱堿性藥物及其鹽類 非水酸量法：是在堿性溶液中，以甲醇鈉為滴定液，麝香草酚藍(lán)為指示劑，二甲基甲酰胺等為溶劑，滴定弱酸性藥物 指用適當(dāng)?shù)姆椒▽⒈粶y組分與試樣中的其他組分分離，然后轉(zhuǎn)化為一定的稱量形式，以稱質(zhì)量計算該組分的含量的一種分析方法。優(yōu)點：準(zhǔn)確度高、精密度好缺點：操作繁雜時、樣品用量較多，有事專屬性較差因而，在藥物分析中一般盡量避免采用。二、 光譜分析法對照品比較法紫外-可見光光度法紅外分光光度

7、法原子吸收分光光度法熒光分析法火焰光度法以紫外-可見光光度法最常用 二、 光譜分析法分光光度法: 是通過測定被測物質(zhì)在特定波長處或一定波長范圍內(nèi)的吸光度或發(fā)光強度，對該物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的方法。光是電磁波,常用的波長范圍為：(1)200400nm-紫外光區(qū)；(2)400760nm-可見光區(qū)；(3)7602500nm（12800cm-14000cm-1）-近紅外光區(qū)（4）25m（按波數(shù)計為4000cm-1400cm-1）-紅外光區(qū)。 紫外-可見分光光度法 物質(zhì)吸收紫外和可見光區(qū)的電磁波產(chǎn)生的吸收光譜 進(jìn)行定性和定量分析的方法 基本原理：朗伯比耳定律 A為吸收度； T為透光率； L為液層厚度，

8、單位為cm ； E為吸收系數(shù)，常用的是百分吸收系數(shù)()，其物理意義為當(dāng)溶液濃度為1(g/ml)，液層厚度為1cm時的吸收度值； C為100ml溶液中所含被測物質(zhì)的量g（按干燥品或無水物計算） 儀器的基本結(jié)構(gòu)光源：200400nm為紫外光區(qū)（氘燈）、400850nm為可見光區(qū) （鎢燈） 儀器的校正和檢定（1）波長的準(zhǔn)確度 （2）吸收度的準(zhǔn)確度 （3）雜散光的檢查 光源單色器吸收池檢測器數(shù)據(jù)記錄處理4.吸光度的測定 中國藥典2010版對吸光度的測定做了以下要求：（1）溶劑： （2）空白試驗校正： （3）測定波長的檢查 （4）供試品溶液的濃度：應(yīng)考慮使吸光度在范圍內(nèi) （5）狹縫寬度的選擇 5.應(yīng)用（

9、1）鑒別和檢查：比較吸收光譜的特征參數(shù)、吸光度比值、吸收光譜的一致性（2）含量測定：a.對照品比較法： b.吸收系數(shù)法 ：含量%=c.比色法：供試品本身在紫外-可見區(qū)沒有強吸收，或在紫外區(qū)雖有吸收但為了避免干擾或提高靈敏度，可加入適當(dāng)?shù)娘@色劑顯色后，測定吸光度以計算其含量的方法 應(yīng)用比色法時，應(yīng)取數(shù)份梯度量的對照品溶液，用溶劑補充至同一體積，顯色后，以相應(yīng)試劑為空白，在各品種規(guī)定的波長處測定各份溶液的吸光度，然后以吸光度與相應(yīng)的濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)供試品的吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得其相應(yīng)的濃度，并求出其含量。 由于顯色時影響顯色深淺的因素很多，應(yīng)取供試品與對照品或標(biāo)準(zhǔn)品平行操作。原理：在兩個不

10、同的波長處測定吸光度，以兩波長處吸光度的差值作為定量的依據(jù)來測定含量的方法。 應(yīng)用本法可以不經(jīng)分離直接測定兩組份樣品的含量。6.注意事項（1）空白溶液與供試品溶液必須澄清，不得有渾濁。如有渾濁，應(yīng)預(yù)先過濾，并棄去初濾液。（2）測定時，除另有規(guī)定外，應(yīng)以配制供試品溶液的同瓶溶劑為空白對照，采用1cm的石英吸收池。（3）在測定時或改測其它檢品時，應(yīng)用待測溶液沖洗吸收池34次，用干凈綢布或擦鏡紙擦凈吸收池的透光面至不留斑痕（切忌把透光面磨損），放入樣品室每次方向應(yīng)一致。（4）取吸收池時，應(yīng)拿毛玻璃兩面，切忌用手拿捏透光面，以免粘上油污。使用完后及時用測定溶劑沖凈，再用純化水沖凈，用干凈綢布或擦鏡紙擦

11、干，晾干后，放入吸收池盒中，防塵保存。若吸收池內(nèi)外壁沾污，用脫脂棉纏在細(xì)玻璃棒上蘸上乙醇，輕輕擦試，再用純化水沖凈。（5）務(wù)必注意經(jīng)常保持硅膠的干燥，目的是保護(hù)光學(xué)元件和光電放大器系統(tǒng)不致受潮損壞而影響儀器的正常工作。（6）儀器經(jīng)過搬動請及時檢查并糾正波長精度，并應(yīng)經(jīng)常校準(zhǔn)波長精度。第3節(jié) 色譜分析法色譜法的分離過程：是被分離組分在互不相溶的兩相間分配平衡的過程，由于混合物中各組分的分配系數(shù)不同，或被吸附劑吸附能力的不同，則被流動相攜帶移動的速度也不同，達(dá)到分離的目的。液相色譜法：以液體為流動相氣相色譜法：以氣體為流動相一、高效液相色譜法高效液相色譜法：采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動相泵入裝有填充

12、劑的色譜柱將待測組分進(jìn)行分離測定的色譜方法。 化學(xué)鍵合相色譜：最廣泛的將固定相的官能團(tuán)鍵合在載體上，形成的固定相 ，一般屬于分配色譜法，不易流失 *（一）基本概念：1.色譜圖：信號-時間曲線2.基線：無樣品時，用流動相沖洗檢測出的流出曲線，一般平行于時間軸3.噪聲：基線信號的波動4.漂移：基線隨時間的變化5.色譜峰：6.拖尾因子：衡量色譜峰的對稱性，應(yīng)為7.峰寬：8.半峰寬9.標(biāo)準(zhǔn)偏差10.峰面積11.保留時間12.理論塔板數(shù)（柱效）：表示色譜柱的分離效率（二）基本原理 待分離物質(zhì)在兩相間進(jìn)行分配時，在固定相中溶解度較小的組分，在色譜柱中向前遷移速度較快；在固定相中溶解度較大的組分，在色譜柱中

13、向前遷移速度較慢，從而達(dá)到分離的目的。 依固定相與流動相極性的不同，分為正相色譜和反相色譜1.正相色譜法 流動相極性小于固定相一般用極性物質(zhì)作固定相，非極性溶劑(如苯、正己烷等)作流動相，主要用于分離極性化合物，極性小的組分先流出，極性大的組分后流出。2.反相色譜法 流動相極性大于固定相一般用非極性物質(zhì)作固定相，極性溶劑(如水、甲醇、己腈等)作流動相，主要用于分離非極性或弱極性化合物，極性大的組分先流出，極性小的組分后流出。（三）固定相和流動相1.固定相 常用化學(xué)鍵合相，分極性和非極性鍵合相，如十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18或ODS）和辛基硅烷鍵合硅膠（C8）為最常用的非極性鍵合相，用于反相色譜

14、法； 氨基和氰基硅烷鍵合相為常用的極性鍵合相，用于正相色譜法。2.流動相 有機溶劑+水混合一般為色譜純試劑，經(jīng)的微孔濾膜過濾，需脫氣處理 （四）儀器的基本結(jié)構(gòu) 日本島津液相色譜儀1.色譜柱柱管-不銹鋼，填充硅膠和化學(xué)鍵合固定相 內(nèi)徑長15cm、20cm和25cm的三種，如安捷倫色譜柱、迪馬色譜柱、迪馬鉆石柱等。 色譜柱的維護(hù)1.最好使用預(yù)柱保護(hù)分析柱；2.大多數(shù)反相色譜柱的pH穩(wěn)定范圍是2，盡量不超過該色譜柱的pH范圍；3.避免流動相組成及極性的劇烈變化；4.樣品要采用或濾膜過濾，流動相采用濾膜過濾并脫氣；5.每次做完分析，要進(jìn)行沖洗：分析用流動相中若無酸、堿、鹽類物質(zhì)，建議用90甲醇沖洗30

15、60min；如果使用極性或離子性的緩沖溶液作流動相，要先用10甲醇沖洗1小時左右，再梯度走到90甲醇沖洗3060min（若用多元泵）。若長時間不用該色譜柱，要沖洗好后，用純甲醇或乙腈封存；6.若流動相中用到離子對試劑，更應(yīng)該好好沖洗，且該色譜柱最好作為專用，不能再做其它物質(zhì)分析用；7.普通C18柱盡量避免在40以上的溫度下分析；8.壓力升高是需要更換預(yù)柱的信號。2.檢測器常用紫外檢測器其次有二極管陣列檢測器(DAD)熒光檢測器示差折光檢測器蒸發(fā)光散射檢側(cè)器電化學(xué)檢測器和質(zhì)譜檢測器等 （五） 系統(tǒng)適用性試驗定義：指用規(guī)定的對照品對色譜系統(tǒng)進(jìn)行試驗，應(yīng)符合要求。包括理論板數(shù)分離度重復(fù)性拖尾因子等1

16、.理論板數(shù)(N) ： 說明分離過程，色譜柱的塔板數(shù)越多，柱效越高 2.分離度(R)：應(yīng)大于1.5 3.重復(fù)性：相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0% 4.拖尾因子(T) ：符合規(guī)定 （六）在雜質(zhì)檢查和含量測定中的應(yīng)用 1.內(nèi)標(biāo)法2.外標(biāo)法 進(jìn)樣操作3.加校正因子的主成分自身對照法（測定雜質(zhì)含量）4.不加校正因子的主成分自身對照法（無雜質(zhì)對照品）5.面積歸一化法（只能用于粗略考察供試品中的雜質(zhì)含量 ）二、氣相色譜法 注入進(jìn)樣口的樣品經(jīng)加熱氣化后，被載氣帶入色譜柱，由于其分配系數(shù)的不同進(jìn)行分離，各組分先后進(jìn)入檢測器，信號記錄儀、積分儀和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄色譜信號。分配系數(shù)小的組分先流出，分配系數(shù)大的組分后流出

17、。2.色譜儀的基本結(jié)構(gòu)由載氣源、進(jìn)樣器、色譜柱、柱溫箱、檢測器和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成 1.載氣（流動相）： 如氦、氮和氫等 2.進(jìn)樣器 ：直接進(jìn)樣或頂空進(jìn)樣 微量注射器3. 固定相和載體 色譜柱為填充柱或毛細(xì)管柱 常用的固定液有甲基聚硅氧烷、不同比例組成的苯基甲基聚硅氧烷、聚乙二醇等。*新填充柱和毛細(xì)管柱在使用前需老化以除去殘留溶劑及低分子量的聚合物，色譜柱如長期未用，使用前應(yīng)老化處理，使基線穩(wěn)定。毛細(xì)管柱和填充柱4. 檢測器 火焰離子化檢測器（FID)、熱導(dǎo)檢測器(TCD)、氮磷檢測器（NPD)、火焰光度檢測器(FPD)、電子捕獲檢測器(ECD)、質(zhì)譜檢測器(MS) 有機溶劑的氣相分離圖譜 3.

18、色譜系統(tǒng)適用性試驗 同高效液相色譜法4.在雜質(zhì)檢查和含量測定中的應(yīng)用（1）內(nèi)標(biāo)法加校正因子測定供試品中某個雜質(zhì)或主成分含量 （2）外標(biāo)法測定供試品中某個雜質(zhì)或主成分含量（3）面積歸一化法上述13法的具體內(nèi)容均同高效液相色譜法 （4）標(biāo)準(zhǔn)溶液加入法藥物含量測定常用技術(shù)容量分析法：包括重量分析法、滴定法（直接、間接滴定法）光譜分析法：UV、IR、色譜分析法：HPLC、GC含量表示方法原料藥：百分含量（%），如未規(guī)定上限，系指不超過101.0% 制劑：標(biāo)示量的百分含量（%）,限量范圍比原料藥的寬如 阿司匹林: 不得少于99.5% 阿司匹林片105.0 %輔料對測定的干擾及排除（一）糖類的干擾和排除（二）硬脂酸鎂的干擾和排除（三）滑石粉的干擾和排除 提取分離溶解過濾改變條件改變方法掩