藥物的含量測定與分析方法的驗(yàn)證學(xué)習(xí)培訓(xùn)課件

1、第四章藥物的含量測定與分析方法的驗(yàn)證基本內(nèi)容一、定量分析方法的分類二、藥物分析方法的驗(yàn)證三、分析樣品的制備第一節(jié) 定量分析方法分類與特點(diǎn)一、容量分析法 （一）容量分析法的特點(diǎn) 幾個(gè)概念：容量分析法、滴定終點(diǎn)、滴定誤差 操作簡單、快速； 比較準(zhǔn)確（相對(duì)誤差0.2%）； 儀器普通易得 常用于測定高含量或中含量組分，原料藥含量測定首選（二）容量分析法的計(jì)算 2.滴定度的計(jì)算 aA（待測物） + bB（滴定液） cC + dD a b T/M 1cT = ca/bMc：滴定液濃度 (mol/L)M：被測物分子量1.滴定度（T）： 每1ml規(guī)定濃度的滴定液相當(dāng)于被測物質(zhì)的質(zhì)量(mg)用溴酸鉀法測定異煙肼

2、M(C6H7N3O)137.14的含量時(shí)，溴酸鉀滴定液的摩爾濃度為0.02mol/L（以KBrO3為單元），化學(xué)反應(yīng)式如下：計(jì)算滴定度3C6H7N3O2KBrO33C6H5NO2+3N2+KBr+3H2O3.百分含量的計(jì)算 W：供試品取樣量 設(shè)至終點(diǎn)時(shí)，消耗滴定液體積為V ml則藥物理論質(zhì)量為VT濃度校正因數(shù)（1）直接滴定法（2）間接滴定法1）生成物滴定法 藥物 + A B 滴定滴定劑 2）剩余滴定法（回滴法） 藥物 + A（定、過量） 剩余的 A + B （回滴）V 空白試驗(yàn)V0往待測物或待測物溶液中準(zhǔn)確地入過量的標(biāo)準(zhǔn)溶液I，使之與待測物進(jìn)行反應(yīng)，待反應(yīng)完成后，再用另一種標(biāo)準(zhǔn)溶液II滴定剩余

3、的標(biāo)準(zhǔn)溶液I，該方法又稱為返滴定法。 （1）反應(yīng)慢：如 HCl 固體CaCO3 （2）沒有合適的指示劑：Ag+ Cl- 先加過量的Ag+，使Cl-完全沉淀，再用SCN-滴定剩余的Ag+ 滴定反應(yīng)：NH4SCN + Ag+ AgSCN（白色）+ NH4+ 指示劑反應(yīng)：Fe3+ + SCN- Fe(SCN)2+ (紅色）W司可巴比妥鈉=0.1022g，cBr2=0.05mol/L，cNa2S2O30.1mol/L；V1=15.73ml，V0=23.21ml；MC12H17N2NaO3=260.27，F(xiàn)Na2S2O31.038。司可巴比妥鈉的含量測定1.計(jì)算滴定度；2.計(jì)算百分含量。光譜分析法 紫外

4、可見分光光度法 UVVis 原子吸收分光光度法 AAS 熒光分析法 二、光譜分析法（一）紫外-可見分光光度法 靈敏度高，可達(dá)10-4g/ml 10-7g/ml 1. 特點(diǎn) 準(zhǔn)確度高，RSD（%）為2% 5% 儀器價(jià)格低廉，操作簡單，易普及，應(yīng)用廣泛 2. 朗伯-比耳定律 A = ECL 吸收系數(shù)：摩爾吸收系數(shù) 研究分子結(jié)構(gòu) 百分吸收系數(shù) 含量測定吸收光譜范圍：紫外：200400nm 可見：400760nm 3.儀器的校正和檢定 吸收度準(zhǔn)確性的檢定：重鉻酸鉀的硫酸溶液，規(guī)定波 長處測定 ，應(yīng)符合P160表1中規(guī)定 波長的校正：汞燈中的幾根較強(qiáng)的譜線或用儀器自身 所帶的氘燈的特定譜線為參照進(jìn)行校正

5、雜散光的檢查：一定濃度的碘化鈉和亞硝酸鈉溶液， 規(guī)定波長處測定透光率，應(yīng)符合P160表2 中規(guī)定4. 對(duì)溶劑的要求: 含雜原子的有機(jī)溶劑通常具有很強(qiáng)的末端吸收它們的使用范圍均不能小于截止使用波長 石英吸收池、空氣為空白 (nm) 溶劑 + 吸收池A 220240 0.40 241250 0.20 251300 0.10 300以上 0.055. 測定方法確定波長 要求供試品溶液的A應(yīng)在0.30.7 狹縫調(diào)整 供試品溶液的吸光度對(duì)照品溶液的吸光度供試品溶液的濃度對(duì)照品溶液的濃度5. 測定方法1）對(duì)照品比較法：條件：A. 待測物與對(duì)照品在相同條件下測定B. 待測物與對(duì)照品濃度相近制劑：原料藥：稀釋

6、體積取樣量平均片重片粉量2）吸收系數(shù)法吸光度百分吸收系數(shù)液層厚度，cm，如無特別注明，L=1cm可在手冊或文獻(xiàn)中查到鹽酸氯丙嗪（規(guī)格2ml:50mg)的含量測定（Ch.P2015）：精密量取本品適量（50mg），置200ml量瓶中，用鹽酸溶液（91000）稀釋至刻度，搖勻；精密量取2ml，置100ml量瓶中，用鹽酸溶液（91000）稀釋至刻度，搖勻，在254nm波長處測定吸光度,按C17H19ClN2SHCl的吸收系數(shù)（ ）為915計(jì)算。計(jì)算其標(biāo)示量。4）比色法 加入顯色劑后，按照對(duì)照品比較法測定。 影響顯色因素很多，故需注意平行操作。 空白溶劑：溶劑+顯色劑，同法處理三、色譜分析法 特點(diǎn)：高

7、靈敏度、 高效能、高速度、應(yīng)用廣泛 按分離原理：吸附；分配；離子交換；排阻色譜分類 按分離方法：PC；TLC；柱色譜；GC；HPLC 根據(jù)混合物中各組分的色譜行為差異，先行分離后再在線或離線對(duì)各組分逐一進(jìn)行分析的方法，是分離分析混合物的最有力手段。 1. 對(duì)儀器一般要求 固定相種類、流動(dòng)相組分、檢測器類型不得任意改變 其他均可適當(dāng)改變 色譜圖20分鐘內(nèi)記錄完畢 2. 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱的理論板數(shù)：n = 5.54(tR /Wh/2)2 分離度：R = 2（tR2 tR1)/(W1 + W2); 應(yīng)大于1.5 重復(fù)性：對(duì)照液連續(xù)進(jìn)樣5次，峰面積RSD2.0 拖尾因子：T = W0.05h/2

8、d1 應(yīng)在0.95 1.05 （一）HPLC法（1）內(nèi)標(biāo)法加校正因子測定供試品中主成分含量對(duì)照品+內(nèi)標(biāo)物對(duì)照溶液，進(jìn)樣，測定，計(jì)算校正因子 3. 在含量測定中的應(yīng)用供試品+內(nèi)標(biāo)供試品溶液，進(jìn)樣，測定供試品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高，計(jì)算含量 （2）外標(biāo)法測定供試品主成分含量供試品供試品溶液對(duì)照品對(duì)照品溶液進(jìn)樣，測定，計(jì)算含量 缺點(diǎn)：不易準(zhǔn)確控制進(jìn)樣量，宜用定量環(huán)進(jìn)樣1. 對(duì)GC儀器一般要求 載 氣：氮?dú)?色譜柱：填充柱或毛細(xì)管柱 填充柱：內(nèi)徑24mm，長110m，內(nèi)裝吸附劑 高分子多孔小球或涂漬固定液的載體 毛細(xì)管柱：內(nèi)徑0.20.5mm，長10100m，一 般為空心柱，內(nèi)壁或載體經(jīng)涂漬或交聯(lián)

9、固定液檢測器：氫火焰離子化檢測器色譜圖：30分鐘內(nèi)記錄完畢 （二）GC法色譜適用性實(shí)驗(yàn)、測定法：同HPLC第二節(jié) 藥物分析方法驗(yàn)證均需對(duì)分析方法進(jìn)行驗(yàn)證驗(yàn)證內(nèi)容：準(zhǔn)確度、精密度、專屬性、檢測限、定量限、線性、范圍和耐用性目的：證明采用的方法適合于相應(yīng)檢測要求。起草藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)工藝變更制劑組分改變原分析方法修訂一、準(zhǔn)確度是指用該方法測定結(jié)果與真實(shí)值接近的程度，用回收率表示（一）含量測定方法的準(zhǔn)確度 1. 原料藥：可用已知純度對(duì)照品或供試品進(jìn)行測定；或與已知準(zhǔn)確度的另一方法測定的結(jié)果進(jìn)行比較2. 制劑：考察其他組分和輔料對(duì)回收率的影響用含已知量被測物的制劑各組分混合物（包括制劑輔料）進(jìn)行測定，

10、回收率計(jì)算同原料藥向制劑中加入已知量的被測物進(jìn)行測定與已知準(zhǔn)確度的另一方法測定的結(jié)果進(jìn)行比較（二）具體做法：測定高、中、低三個(gè)濃度，n=3, 共9個(gè)數(shù)據(jù)來評(píng)價(jià)回收率；用UV和HPLC法時(shí)，一般回收率可達(dá)98.0%108.0%回收率試驗(yàn)精密稱取鹽酸小檗堿約40mg ，按處方比例加入其它組分和輔料，用適量沸騰的 0. 05mol/L H2SO4 溶解。放冷置室溫，定量轉(zhuǎn)移至250ml 量瓶中，并稀釋至刻度。過濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液 5.00ml 于100ml 量瓶中并稀釋至刻度，按所選定的方法計(jì)算回收率。測定結(jié)果見下表。分光光度法測定連蒲雙清片中鹽酸小檗堿的含量 回收率試驗(yàn)取連蒲雙清片粉適量（約

11、相當(dāng)于鹽酸小檗堿40mg)，精密稱取，精密加入鹽酸小檗堿約40mg ，用0.05mol/L H2SO4 溶解。放冷置室溫，定量轉(zhuǎn)移至250ml 量瓶中，并稀釋至刻度。過濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液 5.00ml 于100ml 量瓶中定容，按所選定的方法計(jì)算回收率。測定結(jié)果見下表。分光光度法測定連蒲雙清片中鹽酸小檗堿的含量 2. 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD) 1. 標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD或S） 二、精密度（一）精密度表示方法（二）驗(yàn)證內(nèi)容 1. 重復(fù)性 在相同條件下,由一個(gè)分析人員測定所得結(jié)果的精密度. 2. 中間精密度 在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)室，不同時(shí)間由不同分析 人員用不同設(shè)備測定結(jié)果的精密度。 3. 重現(xiàn)性 在不同實(shí)

12、驗(yàn)室由不同分析人員測定結(jié)果的精密度。（三）數(shù)據(jù)要求均應(yīng)報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)偏差、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和可信限三、專屬性指在其他成分(如雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、輔料等)可能存在下，采用的方法能準(zhǔn)確測定出被測物的特性 鑒別、雜質(zhì)檢查、含量測定方法，均應(yīng)考察其專屬性 （一）鑒別試驗(yàn) 應(yīng)能與其它共存的物質(zhì)或相似化合物區(qū)分，不含被測組分的樣品均應(yīng)呈現(xiàn)負(fù)反應(yīng)。（二）含量測定和雜質(zhì)測定 色譜法和其他分離法，應(yīng)附代表性的圖譜，以說明專屬性。 圖中應(yīng)注明各組分的位置，色譜法中分離度應(yīng)符合要求。 在能獲得雜質(zhì)的情況下，可加到試樣中，考察對(duì)結(jié)果的干擾。 在雜質(zhì)和降解物不能獲得的情況下，可用已驗(yàn)證方法或藥典方法進(jìn)行對(duì)照；也可用對(duì)試樣加速破壞的方

13、法，比較兩種方法。 四、檢測限（LOD) 是指試樣中被測物能被檢測出的最低濃度或量，是限度檢驗(yàn)指標(biāo)。它無需準(zhǔn)確定量，只要指出高于或低于該規(guī)定的濃度或量即可。1.目視法 用含已知濃度被測物的試樣進(jìn)行分析，目視確定能被可靠地檢測出的被測物的最低濃度或量，常用于顯色鑒別法，TLC 2.當(dāng)用GC和HPLC法時(shí)，一般以S/N2或3時(shí)的相應(yīng)濃度來確定檢測限。 五、定量限（LOQ) 是指樣品中被測物能被定量測定的最低量，其測定結(jié)果應(yīng)具一定準(zhǔn)確度和精密度。 雜質(zhì)和降解產(chǎn)物進(jìn)行定量測定時(shí)，要求LOQ。常用信噪比法確定定量限，一般以S/N=10時(shí)相應(yīng)的濃度進(jìn)行測定。 六、線性是指在設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)，測試結(jié)果與試樣中被

14、測物濃度或量直接呈正比關(guān)系的程度。 回歸方程的相關(guān)系數(shù)（r）越接近1，表明線性越好 可用一貯備液經(jīng)精密稀釋，或分別精密稱樣，制備一系列（至少5份）供試液進(jìn)行測定，以響應(yīng)值對(duì)濃度作圖，建立回歸方程，求出r。 如UV：制備一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)系列，濃度點(diǎn)n =5 A=0.3-0.7 建立回歸方程C = aA + b， r0.9999七、范圍 如原料藥和制劑含量測定：應(yīng)為測試濃度的80%120%制劑含量均勻度檢查：應(yīng)為測試濃度的70%130%。溶出度或釋放度中的溶出量測定：應(yīng)為限度的20%。是指達(dá)到一定精密度、準(zhǔn)確度和線性、測試方法適用的高低限度或量的區(qū)間。 八、耐用性是指在測定條件有小的變動(dòng)時(shí)，測定結(jié)果不受影

15、響的承受程度。典型的變動(dòng)因素有：被測溶液的穩(wěn)定性、樣品提取次數(shù)、時(shí)間等。HPLC變動(dòng)因素有：流動(dòng)相組成與pH，色譜柱，柱溫，流速等。GC變動(dòng)因素有：色譜柱，固定相，擔(dān)體、柱溫、進(jìn)樣口和檢測器溫度等。 分析方法效能指標(biāo)的具體應(yīng)用：1. 用于鑒別試驗(yàn)：只要求專屬性、耐用性和檢測限2. 用于原料藥中雜質(zhì)測定和制劑中降解產(chǎn)物測定的方法： 用于定量：除檢測限不要求外，其余指標(biāo)均要求。 限度檢查：只要求檢測限、專屬性、耐用性3. 原料、制劑的含量測定及溶出度測定：不要求檢測限和 定量限，其余均要求。藥物分析中常用的分析方法經(jīng)有機(jī)破壞的分析方法不經(jīng)有機(jī)破壞的分析方法 第三節(jié) 分析樣品的制備 終點(diǎn)： 鄰二氮菲

16、(+Fe3+)溶于熱稀礦酸Fe2+鈰量法Ce4+Fe3+指示劑:鄰二氮菲(+Fe2+)紅色淡藍(lán)色（一）直接溶解法 例如：富馬酸亞鐵的含量測定（二）經(jīng)水解后測定法 CCl3-C(CH3)2-OH + 4NaOH (CH3)2CO +3NaCl + HCOONa +2H2O NaCl + AgNO3 AgCl + NaNO3 AgNO3 + NH4SCN AgSCN + NH4NO3 Mg(C17H35COO)2 + H2SO4 MgSO4 + 2C17H35COOH H2SO4 + 2NaOH Na2SO4 + 2H2O 1. 堿水解后測定法適用于X與脂肪鏈相連的鹵代烷烴例如：三氯叔丁醇的含量測

17、定 2. 酸水解后測定法 例如：硬脂酸鎂的含量測定 （三）經(jīng)還原分解后測定法 適用于Ar-I的藥物 例如：碘他拉酸的含量測定 經(jīng)有機(jī)破壞的分析方法凱氏定氮法 金屬原子、鹵素等與C結(jié)合牢固者，必須有機(jī)破壞藥物分析中常用的有機(jī)破壞的方法有 干法破壞濕法破壞 (一)濕法破壞H2SO4-HNO3法H2SO4-HClO4法H2SO4-硫酸鹽法H2SO4-H2O2,HNO3-KMnO4法等（二）干法破壞 2.氧瓶燃燒法適用于含鹵素、S、P等有機(jī)藥物分析的前處理，也用于某些藥物中Se及砷鹽的檢查1. 高溫?zé)胱品?加無水Na2CO3、硝酸鎂、氫氧化鈣或ZnO以助灰化 1） 儀器裝置 500ml, 1000ml, 2000ml, 磨口、硬質(zhì) 玻璃錐形瓶 2）稱樣 固體樣；液體樣；軟膏類樣品要求3） 燃燒分解操作法 4） 吸收液的選擇 用于X、S、Se等的鑒別、檢查、含量測定時(shí)多數(shù)是H2O或H2O-NaOH；少數(shù)為H2O-NaOH-H2O2.練習(xí)與思考1相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示的應(yīng)是A準(zhǔn)確度 B回收率 C精密度 D純凈度 E限度2表示兩變量指標(biāo)A與C之間線性相關(guān)程度常用A相關(guān)規(guī)律 B比例常數(shù) C相