《轉(zhuǎn)基因食品生物技術(shù)及安全性評價》課件9實驗轉(zhuǎn)基因食品9

1、實驗四 植物總RNA的提取和RT-PCR一、實驗?zāi)康模?、學(xué)習(xí)植物總RNA提取的原理及其操作過程。2、學(xué)習(xí) RT-PCR 的原理及其操作過程。 二、RNA提取的一般原理RNA是一類極易降解的分子，要得到完整的RNA，必須最大限度地抑制提取過程中內(nèi)源性及外源性核糖核酸酶對RNA的降解。高濃度強變性劑異硫氰酸胍，可溶解蛋白質(zhì)，破壞細胞結(jié)構(gòu)，使核蛋白與核酸分離，失活RNA酶，所以RNA從細胞中釋放出來時不被降解。細胞裂解后，除了RNA，還有DNA、蛋白質(zhì)和細胞碎片，通過酚、氯仿等有機溶劑處理得到純化、均一的總RNA。二、 RT-PCR一般原理 目前 PCR 技術(shù)只能擴增 DNA 模板，對 RNA 模

2、板不能直接擴增。mRNA 反轉(zhuǎn)錄生成的 cDNA 可作為 PCR 的模板進行擴增，這種在 mRNA 反轉(zhuǎn)錄后進行的 PCR 擴增稱為 RT-PCR 。 RT-PCR 比 Northern 雜交更靈敏，對 RNA 的質(zhì)量要求較低，操作簡便，它是在轉(zhuǎn)錄水平上檢測基因時空表達的常用方法。 三、材料 轉(zhuǎn)基因煙草的總 RNA 四、設(shè)備 移液器，冷凍高速離心機，低溫冰箱，臺式高速離心機，1.5ml離心管，PCR儀，Biozol總RNA 提取試劑，BioRT 逆轉(zhuǎn)錄擴增(RT-PCR)試劑盒。五、操作步驟（一)RNA 抽提 1勻漿處理 取100mg植物組織于液氮中研磨，時間要短，取適量材料放入滅菌EP管中，

3、加1ml的Biozol裂解液后勻漿。（組織樣品容積不能超過Bizol容積的10%）2將勻漿樣品劇烈震蕩混勻，在15 -30C條件下孵育5分鐘以使核蛋白體完全分解。 3. 每1ml Biozol 加0.2ml氯仿。蓋緊樣品管蓋，劇烈振蕩15秒并將其在室溫下孵育5分鐘。 4. 于412，000rpm 離心10分鐘，樣品會分成三層：下層有機相，中間層和上層無色的水相，RNA存在于水相中。取500l水相轉(zhuǎn)移到新管中，進行下一步操作。 5. 加入2倍體積冰冷無水乙醇，顛倒混勻-20C放置10分鐘。 612,000 rpm離心10分鐘，盡量除去上清液, 加入1ml70%的乙醇洗滌一次。 7.4 8,000

4、g離心5min，盡量棄上清，室溫放置5分鐘。 8加50l RNase free water溶解沉淀。 9. 測定的含量和純度用DEPC 處理的水(高壓滅菌)或TE緩沖液稀釋RNA樣品，用紫外分光光度計測定稀釋RNA樣品在260nm,280nm,230nm吸收值 A26040ug稀釋體積（ul) 含量(ug/ul) = 1000 （ul)取樣體積（ul) OD260 unit Notice: the range of Spec reading A260： 0.1OD2601.0純度Ratio=A260/A280(1.8-2.0)Ratio=A260/A230(2.0) 10 x RT-PCR B

5、uffer 2.5 ldNTP Mixture 4 lRNase inhibitor 1 lUpstream primer(10 M) 1 lDownstream primer(10 M) 1 lAMV reverse transcriptase 0.5 lTaq polymerase 0.5 l總RNA 1ug X lRNase free H2O 14.5-Xl總體積 25 lRT-PCR反應(yīng)體系50* 40min94 5min94 30s50-65* 30s 30-40cycles*72 1kb/min72 10min取5 l RT-PCR 產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳說明：* 對于有復(fù)雜二級結(jié)

6、構(gòu)的RNA 模板，反應(yīng)溫度可適當提高* 根據(jù)引物Tm 值調(diào)整，一般為Tm-5*如果RNA 量少，可適當增加循環(huán)數(shù)（45-50 循環(huán)）4. 電泳檢測實驗結(jié)果。RT-PCR反應(yīng)程序操作注意事項： 1.如果可能，實驗室應(yīng)辟出專門RNA操作區(qū)，離心機、移液槍、試劑等均應(yīng)專用。 2.操作過程中應(yīng)自始至終佩戴拋棄式橡膠或乳膠手套，并經(jīng)常更換，以避免將手、臂上的細菌和真菌以及人體自身分泌的RNA酶帶入試管或污染用具。3.盡量使用一次性槍頭、離心管等塑料制品，盡量避免與其它實驗共享器具，以防止交叉污染。4.配制溶液用的酒精，異丙醇、Tris等應(yīng)采用未開封的新品。溶液需用DEPC水配制（加0.01%(體積比)DEPC (diethyl pyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)至重蒸水或Mili Q級水中，處理過夜，滅菌即成DEPC水）。5.所有玻璃制品都必須在240烘烤4小時。所有舊塑料制品都必須用0.5