《分子生物學(xué)》實驗指導(dǎo)說課材料

1、Good is good, but better carries it.精益求精，善益求善。分子生物學(xué)實驗指導(dǎo)-分子生物學(xué)實驗指導(dǎo)實驗1植物總DNA的提取生物總DNA的提取是分子生物學(xué)實驗的一個重要內(nèi)容。由于不同的生物材料細胞壁的結(jié)構(gòu)和組成不同，而細胞壁結(jié)構(gòu)的破壞是提取總DNA的關(guān)鍵步驟。同時細胞內(nèi)的物質(zhì)也根據(jù)生物種類的不同而有差異，因此不同生物采用的提取方法也不同，一般要根據(jù)具體的情況來設(shè)計實驗方法。本實驗介紹采用CTAB法提取植物總DNA的技術(shù)。實驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)和掌握學(xué)習(xí)CTAB法提取植物總DNA的基本原理和實驗技術(shù)。學(xué)習(xí)和掌握紫外光吸收法鑒定DNA的純度和濃度。實驗原理植物葉片經(jīng)液氮研磨，可

2、使細胞壁破裂，加入去污劑（如CTAB），可使核蛋白體解析，然后使蛋白和多糖雜質(zhì)沉淀，DNA進入水相，再用酚、氯仿抽提純化。本實驗采用CTAB法，其主要作用是破膜。CTAB是一種非離子去污劑，能溶解膜蛋白與脂肪，也可解聚核蛋白。植物材料在CTAB的處理下，結(jié)合65水浴使細胞裂解、蛋白質(zhì)變性、DNA被釋放出來。CTAB與核酸形成復(fù)合物，此復(fù)合物在高鹽（0.7mM）濃度下可溶，并穩(wěn)定存在，但在低鹽濃度（0.1-0.5mMNaCl）下CTAB-核酸復(fù)合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白質(zhì)及多糖等仍溶解于溶液中。經(jīng)過氯仿/異戊醇(24:1)抽提去除蛋白質(zhì)、多糖、色素等來純化DNA，最后經(jīng)異丙醇或乙醇

3、等沉淀劑將DNA沉淀分離出來。由于核酸、蛋白質(zhì)、多糖在特定的紫外波長都有特征吸收。核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。純的DNA樣品A260/2801.8，純的RNA樣品A260/2802.0，并且1g/mlDNA溶液A260=0.020。實驗器材1、高壓滅菌鍋2、冰箱3、恒溫水浴鍋4、高速冷凍離心機5、紫外分光光度計6、剪刀7、陶瓷研缽和杵子8、磨口錐形瓶（50ml）9、滴管10、細玻棒11、小燒杯（50ml）12、離心管（50ml）13、植物材料實驗試劑1、3CTABbuffer（pH8.0）100mMTris25mMEDTA1.5MNaCl3%CTAB2%-巰基乙醇2、TE緩沖液（

4、pH8.0）10mmol/LTrisHCl1mmol/LEDTA3、氯仿-異戊醇混合液（24：1，V/V）4、95乙醇5、液氮實驗步驟1、稱取2g新鮮的植物葉片，用蒸餾水沖洗葉面，濾紙吸干水分。2、將葉片剪成1cm長，置預(yù)冷的研缽中，倒入液氮，盡快研磨成粉末。3、待液氮蒸發(fā)完后，加入15mL預(yù)熱（60）的CTAB提取緩沖液，轉(zhuǎn)入一磨口錐形瓶中，置于65水浴保溫0.5h，不時地輕輕搖動混勻。4、加等體積的氯仿/異戊醇，蓋上瓶塞，溫和搖動，使成乳狀液。5、將錐形瓶中的液體倒入50ml離心管中，在4下8000rpm離心10min。6、離心管中出現(xiàn)3層，用滴管小心地將上層清液吸入另一干凈的離心管中，棄

5、去中間層的細胞碎片和變性蛋白以及下層的氯仿。（根據(jù)需要，上清液可用氯仿/異戊醇反復(fù)提取多次。）7、收集上層清液，并將其倒入小燒杯。沿?zé)诼尤?倍體積預(yù)冷的95乙醇。邊加邊用細玻棒沿同一方向攪動，可看到纖維狀的沉淀（主要為DNA）迅速纏繞在玻棒上。8、小心取下這些纖維狀沉淀，加12mL70%乙醇沖洗沉淀，輕搖幾分鐘，除去乙醇，即為DNA粗制品。9、將粗制品溶于TE緩沖液。10、在分光光度計上測定該溶液在260nm/280nm紫外光波長下的光密度值。實驗結(jié)果第一組：得到純化的DNA，經(jīng)紫外分光光度計檢測，樣品DNA溶液A260=0.022，A280=0.012，A260/2801.83第二組

6、：得到純化的DNA，經(jīng)紫外分光光度計檢測，樣品DNA溶液A260=0.020，A280=0.011，A260/2801.81第三組：得到純化的DNA，經(jīng)紫外分光光度計檢測，樣品DNA溶液A260=0.024，A280=0.013，A260/2801.84注意事項1、液氮研磨時，小心操作，以免凍傷。2、所有操作均需溫和，避免劇烈震蕩。思考題CTAB、EDTA、巰基乙醇的作用分別是什么？液氮研磨的原理是什么？實驗二瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA瓊脂糖是從瓊脂中分離制備的鏈狀多糖，其結(jié)構(gòu)單元是D-半乳糖-3,6-L半乳糖。許多瓊脂糖分子依靠氫鍵及其他力的作用使其互相盤繞形成繩狀瓊脂糖束，構(gòu)成大網(wǎng)孔型凝膠。

7、該物質(zhì)對尿素和鹽酸胍等破壞氫鍵的試劑有較強的抵抗力。在pH4.0-9.0的緩沖液中穩(wěn)定。由于其分子上無帶電基團，在緩沖液離子強度大于0.05時，對蛋白質(zhì)無吸附作用，也無電滲現(xiàn)象，因而分辨率和重現(xiàn)性均較好，是一種優(yōu)良的電泳材料。在一定濃度的瓊脂糖凝膠介質(zhì)中，如DNA分子的電泳遷移率與其分子量、分子構(gòu)型和所用緩沖液對遷移率相關(guān)。實驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)和掌握瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的實驗技術(shù)和原理，以及溴化乙錠染色檢測核酸的實驗技術(shù)。實驗原理DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。DNA分子的高于等電點的pH溶液中帶負電荷，在電場中向正極移動。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈D

8、NA幾乎具有等量的靜電荷，因此它們能以同樣的速度向正極方向移動。在一定的電場強度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即DNA分子本身的大小和構(gòu)型。具有不同的相對分子質(zhì)量的DNA片段泳動速度不一樣，可進行分離。DNA分子的遷移速度與相對分子質(zhì)量的對數(shù)值成反比關(guān)系。凝膠電泳不僅可分離不同相對分子質(zhì)量的DNA，也可以分離相對分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的DNA分子，如pUC19質(zhì)粒，有3種構(gòu)型：超螺旋的共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA（covalentlyclosedcircularDNA,簡稱cccDNA），開環(huán)質(zhì)粒DNA，即共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA1條鏈斷裂（opencircularDNA,簡稱OCDNA

9、），線狀質(zhì)粒DNA，即共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA2條鏈發(fā)生斷裂（linearDNA,簡稱LDNA）。這3種構(gòu)型的質(zhì)粒DNA分子在凝膠電泳中的遷移速度不同。因此電泳后呈3條帶，超螺旋質(zhì)粒DNA泳動最快，其次為線狀DNA，最慢的為開環(huán)質(zhì)粒DNA。溴化乙錠可以嵌入核酸分子，并且在紫外燈下產(chǎn)生熒光，可用于檢測核酸物質(zhì)。實驗器材1、瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)2、凝膠成像系統(tǒng)3、DNAmarker4、檢測樣品5、瓊脂糖實驗試劑1、5TBE（5倍體積的TBE貯存液）配1000ml5TBE：Tris54g硼酸27.5g0.5mol/lEDTA20ml（pH8.0）2、凝膠加樣緩沖液（6）溴酚藍0.25%蔗糖40%3、溴化

10、乙錠溶液（EB）0.5g/ml實驗步驟（一）制備瓊脂糖凝膠1、按照被分離DNA的大小，決定凝膠中瓊脂糖的百分含量。可參照下表：瓊脂糖凝膠濃度/%線性DNA的有效分離范圍/kb0.35-600.61-200.70.8-100.90.5-71.20.4-61.50.2-42.00.1-32、稱取0.3g瓊脂糖，放入錐形瓶中，加入30ml0.5TBE緩沖液，置微波爐或水浴加熱至完全溶化，取出搖勻，則為1%瓊脂糖凝膠液。（二）膠板的制備1、取有機玻璃內(nèi)槽，洗凈，晾干，用橡皮膏將有機玻璃內(nèi)槽的兩端邊緣封好（一定封嚴(yán)，不能留縫隙）。2、有機玻璃內(nèi)槽放置于一水平位置，并放好樣品梳子。3、將冷到60左右的瓊脂

11、糖凝膠液，緩緩倒入有機玻璃內(nèi)槽，直至有機玻璃板上形成一層均勻的膠面（注意不要形成氣泡）。4、待膠凝固后，取出梳子，取下橡皮膏，放在電泳槽內(nèi)。5、加入電泳緩沖液至電泳槽中，讓緩沖液蓋過凝膠。（三）加樣用移液槍將將上樣緩沖液與DNA樣品按1:5比例混合，加入加樣孔中（記錄點樣順序及點樣量）。（四）電泳1、接通電泳槽與電泳儀的電源（注意正負極，DNA片段從負極向正極移動）。DNA的遷移速度與電壓成正比，最高電壓不超過5V/cm。2、當(dāng)溴酚藍染料移動到距凝膠前沿12cm處，停止電泳。3、將凝膠小心放入溴化乙錠溶液中，染色30min。4、將染色后的凝膠放入凝膠成像儀中拍照。實驗結(jié)果觀察到較為明顯的條帶，

12、分子量大的條帶落后。注意事項因為EB是強致癌物質(zhì)，因此染色操作中應(yīng)注意安全不要接觸，并且保持環(huán)境的潔凈。參考文獻精編分子生物學(xué)實驗指南（第四版）美FM奧斯伯，RE金斯頓等主編科學(xué)出版社2005實驗三PCR基因擴增PCR技術(shù)是在1985年由美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis等發(fā)明的聚合酶鏈反應(yīng)。這一技術(shù)具有劃時代意義的。其原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制，只是在試管中給DNA的體外合成提供以致一種合適的條件-摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合適的緩沖體系，DNA變性、復(fù)性及延伸的溫度與時間。實驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)和掌握PCR反應(yīng)的基本原理與實驗技術(shù)。實驗原理多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polyme

13、rasechainreaction,PCR）的原理類似于DNA的天然復(fù)制過程。在待擴增的DNA片段兩側(cè)和與其兩側(cè)互補的兩個寡核苷酸引物，經(jīng)變性、退火和延伸若干個循環(huán)后，DNA擴增2n倍。1、變性：加熱使模板DNA在高溫下（94）變性，雙鏈間的氫鍵斷裂而形成兩條單鏈，即變性階段。2、退火：使溶液溫度降至5060，模板DNA與引物按堿基配對原則互補結(jié)合，即退火階段。3、延伸：溶液反應(yīng)溫度升至72，耐熱DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，在引物的引導(dǎo)下，利用反應(yīng)混合物中的4種脫氧核苷三磷酸（dNTP），按53方向復(fù)制出互補DNA，即引物的延伸階段。上述3步為一個循環(huán)，即高溫變性、低溫退火、中溫延伸3個階

14、段。從理論上講，每經(jīng)過一個循環(huán)，樣本中的DNA量應(yīng)該增加一倍，新形成的鏈又可成為新一輪循環(huán)的模板，經(jīng)過2530個循環(huán)后DNA可擴增106109倍。典型的PCR反應(yīng)體系由如下組分組成：DNA模板、反應(yīng)緩沖液、dNTP、MgCl2、兩個合成的DNA引物、耐熱Taq聚合酶。實驗器材1、PCR熱循環(huán)儀2、tip頭、冰盒3、PCR管4、超純水5、DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物6、移液槍實驗試劑1、10緩沖液500mmol/lKCl100mmol/lTrisHCl(pH8.3,室溫)15mmol/lMgCl20.1%明膠2、4dNTP1mmol/ldATP1mmol/ldCTP1mmol/ldGTP1mmol/

15、ldTTP3、Taq酶5U/L4、DNA模板1ng/L5、引物1、引物2引物溶液濃度10pmol/l實驗步驟1、在PCR管內(nèi)配制20L反應(yīng)體系：反應(yīng)物體積/L10buffer2.0dNTP1.0引物11.0引物21.0Taq酶0.5Template1ddH2O13.5總體積202、按下列程序進行擴增：、95預(yù)變性5min、95變性1min、55退火1min、72延伸1min、重復(fù)步驟30次；、72延伸10min3、瓊脂糖凝膠電泳分析PCR結(jié)果配制0.7%瓊脂糖凝膠，取10L擴增產(chǎn)物電泳。保持電流40mA。電泳結(jié)束后，紫外燈下觀察結(jié)果。實驗結(jié)果紫外燈下能明顯看到條帶。注意事項1、PCR加樣時，盡

16、量保持低溫操作，避免酶失活和模板、引物降解。2、取樣時注意不要污染藥品。思考題1、什么是引物二聚體？出現(xiàn)引物二聚體的原因是什么？2、PCR儀的熱蓋設(shè)置有什么優(yōu)點？參考文獻1、PCR技術(shù)操作和應(yīng)用指南主編林萬明人民軍醫(yī)出版社1995年2、PCR技術(shù)實驗指南美C.W.迪芬巴赫G.S.德維克斯勒科學(xué)出版社2003年實驗四目的基因片段與克隆載體質(zhì)粒的連接儀器設(shè)備：低溫水浴鍋、冰箱、T4連接酶、外源DNA與酶切的載體等。實驗?zāi)康模褐亟MDNA連接及鑒定重組子的方法?；疽螅簩W(xué)會按一定比例用T4噬菌體DNA連接酶進行連接反應(yīng)。實驗原理及步驟：外源DNA與載體分子的連接就是DNA重組，這種重新組合的DNA叫

17、做重組子。重新組合的DNA分子是在連接酶的作用下進行連接的。DNA連接酶有兩種：T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶。連接反應(yīng)總體積為10L，體系組成如下：回收純化的PCR擴增目的基因片段7.0L10Ligationbuffer1.0LT載體（10ng/L）1.0LT4DNAligase1.0L共10.0ul混均后，4連接18-24小時，連接所得克隆載體命名為TA-VP4-STI。轉(zhuǎn)化操作方法1）取一管-80保存的感受態(tài)細胞，置冰上融化；一次轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞的建議用量為50-100ul,應(yīng)注意所用DNA體積不要超過感受態(tài)細胞懸液體積的十分之一。以100ul為例：2）加入連接物（50ul的

18、感受態(tài)細胞能夠被1ng超螺旋質(zhì)粒DNA所飽和），輕輕旋轉(zhuǎn)離心管以混勻內(nèi)容物，冰浴30min；3）將離心管置于42熱擊60-90秒，然后迅速置冰浴2-3分鐘，該過程不要搖動離心管；4）向每個離心管中加入500ul液體LB培養(yǎng)基（不含抗生素），混勻后置于37搖床振蕩培養(yǎng)45分鐘（150轉(zhuǎn)/分鐘）；目的是使質(zhì)粒上相關(guān)的抗性標(biāo)記基因表達，使菌體復(fù)蘇。5）將離心管內(nèi)容物混勻，吸取100ul已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞加到含相應(yīng)抗生素的LB固體瓊脂培養(yǎng)基上（含50ug/ml氨芐青霉素），用無菌的彎頭玻棒輕輕將細胞均勻涂開。將平板置于室溫直至液體被吸收，倒置平板，37培養(yǎng)12-16小時。至紅、白斑區(qū)分明顯為止。涂布用

19、量可根據(jù)具體試驗來調(diào)整：如轉(zhuǎn)化的DNA總量較多，可取更少量轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布平板；反之，如轉(zhuǎn)化的DNA總量較少，可取200-300ul轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布平板。如果預(yù)計的克隆較少，可通過離心（4000rpm,2min）后析除部分培養(yǎng)液，懸浮菌體后將其涂布于一個平板中。（涂布剩余的菌液可置于4保存，如果次日的轉(zhuǎn)化菌落數(shù)過少可以將剩下的菌液再涂布新的培養(yǎng)板）實驗結(jié)果培養(yǎng)板上有已轉(zhuǎn)化的菌斑生成。注意事項：1、感受態(tài)細胞應(yīng)保存在-70，不可多次凍融和放置時間過長，以免降低感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化效率。2、進行轉(zhuǎn)化操作時，應(yīng)根據(jù)相應(yīng)溫度及無菌條件的要求進行。3、為防止轉(zhuǎn)化試驗不成功，可以保留部分連接反應(yīng)液，以重新轉(zhuǎn)化，將損失

20、降到最低。4、氨芐青霉素(Amp)：使用前用無菌純水配制母液，濃度為50mg/mL。實驗五大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備及轉(zhuǎn)化在自然條件下,很多質(zhì)粒都可通過細菌接合作用轉(zhuǎn)移到新的宿主內(nèi),但在人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體中，一般缺乏此種轉(zhuǎn)移所必需的mob基因，因此不能自行完成從一個細胞到另一個細胞的接合轉(zhuǎn)移。如需將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移進受體細菌，需誘導(dǎo)受體細菌產(chǎn)生一種短暫的感受態(tài)以攝取外源DNA。轉(zhuǎn)化過程所用的受體細胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變體(R，M)，它可以容忍外源DNA分子進入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。實驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)和掌握CaCl2法制備大腸桿菌感受態(tài)細胞的實驗技術(shù)及熱激轉(zhuǎn)化

21、的實驗技術(shù)。實驗原理細菌處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)叫感受態(tài)。轉(zhuǎn)化是指質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入細菌的過程。其原理是細菌處于0，CaCl2低滲溶液中，菌細胞膨脹成球形。轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復(fù)合物粘附于細胞表面，經(jīng)42短時間熱擊處理，促進細胞吸收DNA復(fù)合物。將細菌放置在非選擇性培養(yǎng)基中保溫一段時間，促使在轉(zhuǎn)化過程中獲得的新的表型（如Ampr等）得到表達，然后將此細菌培養(yǎng)物涂在含有氨芐青霉素的選擇性培養(yǎng)基上。實驗器材1、超凈工作臺2、低溫離心機3、恒溫搖床4、恒溫箱5、恒溫水浴器6、ppendorf管、Tip頭7、轉(zhuǎn)化的目的質(zhì)粒8、大腸桿菌菌株DH59、試

22、管、培養(yǎng)皿、錐形瓶實驗試劑1、1mol/lCaCl2溶液（高壓滅菌）2、LB液體培養(yǎng)基配制每升培養(yǎng)基，應(yīng)在950ml去離子水中加入：胰蛋白胨（bacto-typtone）10g酵母提取液（bacto-yeastextract）5gNaCl10g搖動容器直至溶質(zhì)完全溶解，用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，加入去離子水至總體積1L，121濕熱滅菌20min。3、LB固體培養(yǎng)基1000ml加15g瓊脂。4、氨芐青霉素（Amp），用無菌水配制成100mg/ml溶液，置-20冰箱保存。實驗步驟1、從大腸桿菌DH5平板上挑取一個單菌落接于2mLLB液體培養(yǎng)基的試管中，37振蕩培養(yǎng)過夜。2、取0.5ml菌液轉(zhuǎn)接到

23、一個含有50mlLB液體培養(yǎng)基錐形瓶中，37振蕩培養(yǎng)23h。（此時，OD6000.40.5，細胞數(shù)務(wù)必108/ml，此為實驗成功的關(guān)鍵）。3、吸菌液1ml加入Eppendorf管，10,000rpm離心15sec回收細胞。4、用冰預(yù)冷的0.1mol/lCaCl2500L懸浮沉淀。5、再離心15sec（10000rpm），回收細胞。6、再用冰預(yù)冷的0.1mol/lCaCl260L重懸沉淀。7、在-4下可保存2周（24d時，轉(zhuǎn)化效率最高）。此細胞為感受態(tài)細胞。8、同時做兩個對照管：受體菌對照：60L感受態(tài)細胞+2L無菌水質(zhì)粒對照：60L0.1mol/LCaCl2溶液+2L質(zhì)粒DNA溶液9、將管放到

24、42循環(huán)水浴12min。10、冰浴2min。11、每管加800LLB液體培養(yǎng)基，37培養(yǎng)1h（慢搖）。12、將適當(dāng)體積（200L）已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞，涂在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)皿中。13、倒置平皿37培養(yǎng)1216h，觀察細菌生長情況。實驗結(jié)果在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)皿中有菌斑生成注意事項1、超凈上無菌操作注意安全。2、實驗過程中盡量避免雜菌污染。思考題1、CaCl2制備感受態(tài)的可能原因是什么？2、如果平板培養(yǎng)后出現(xiàn)衛(wèi)星斑的可能原因是什么？3、如何提高轉(zhuǎn)化的效率？參考文獻精編分子生物學(xué)實驗指南（第四版）美FM奧斯伯，RE金斯頓等主編科學(xué)出版社2005部分試劑配法：配制1MTris-HCl（中文名：三

25、羥甲基氨基甲烷，氨基丁三醇，緩血酸銨）,pH8.5，500ml，配法是：60.55gTris+400mlH2O+約20ml濃HCl，pH調(diào)至8.5，定容至500ml.EDTA標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制與標(biāo)定1.EDTA標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制（約0.02molL-1）稱取2.0g乙二胺四乙酸二鈉（Na2H2Y2H2O）溶于250mL蒸餾水中，轉(zhuǎn)入HYPERLINK/view/887003.htmt_blank聚乙烯塑料瓶中保存。2.EDTA標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的標(biāo)定用20mL移液管移取Mg2+標(biāo)準(zhǔn)溶液于250mL錐形瓶中，加入10mL氨性緩沖溶液和34滴EBT指示劑，用0.02molL-1EDTA標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，至溶液由紫紅色變?yōu)樗{色即為終點。平行標(biāo)定3次。1）2CTAB提取液（PH8.0）：2%CTAB，1.4MNacl，0.02MEDTA，0.1MTris-cl，0.2%巰基乙醇。即稱取CT