BD破膜劑試劑手冊中文

1、破膜劑 試劑手冊BD Cytofix / Cytoperm 固定/滲透試劑盒手冊（目錄號554714）BD Cytofix / Cytoperm Plus固定/滲透試劑盒（BD GolgiStop含有莫能菌素的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運抑制劑）（目錄號554715）BD Cytofix / Cytoperm Plus固定/滲透試劑盒（含布雷菲德菌素A的BDGolgiPlug蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運抑制劑）（目錄號555028）Ficoll是Amersham Biosciences AB的注冊商標。 Hypaque是Amersham Health AS的注冊商標。 BD流式細胞儀是1流激光產(chǎn)品。 僅供研究使用。 不用于診斷或

2、治療程序。 2016年Becton，Dickinson和公司。 版權所有。 本出版物的任何部分不得以電子，機械，磁性，光學，化學，手冊或其他方式以任何形式或通過任何方式復制，傳播，轉(zhuǎn)錄，存儲在檢索系統(tǒng)中或翻譯成任何語言或計算機語言， 未經(jīng)BD Biosciences事先書面許可。 購買不包括或攜帶任何權利轉(zhuǎn)售或轉(zhuǎn)讓本產(chǎn)品作為獨立產(chǎn)品或另一產(chǎn)品的組成部分。 未經(jīng)Becton，Dickinson和Company明確書面許可，嚴禁使用本產(chǎn)品以外的許可使用。2016BD，BD徽標和所有其他商標均為Becton，Dickinson和Company的產(chǎn)權。目錄BD Cytofix / Cytoperm固定

3、/滲透試劑盒BD Cytofix / Cytoperm Plus固定/滲透試劑盒（BD GolgiStop蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運抑制劑）BD Cytofix / Cytoperm Plus固定/滲透試劑盒（BD GolgiPlug蛋白質(zhì)運輸抑制劑）警告和注意事項一般程序 A.刺激細胞1.使用BD GolgiStop的程序 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運抑制劑（含有莫能菌素）2。 使用BD GolgiPlug 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運抑制劑的程序（含布雷菲德菌素A）B.方案：細胞表面抗原和細胞內(nèi)細胞因子的多色染色1收集細胞2.阻止Fc受體3.細胞表面抗原染色4.固定和滲透細胞5.備選固定和滲透方案6細胞內(nèi)細胞因子染色C.流式細胞分析。D.

4、染色控制陽性染色控制2. 陰性染色控制 a. 同種型對照b.配體阻斷控制。c. 未標記的抗體阻斷控制。解決方案樣品數(shù)據(jù)備選方案全血活化和細胞內(nèi)染色。預期結(jié)果解決方案參考文獻 BD Biosciences提供三個試劑盒，以簡化細胞的固定和透化，用于細胞質(zhì)內(nèi)細胞因子的免疫熒光染色。 BD Cytofix / Cytoperm 固定/滲透試劑盒提供固定/透化溶液和滲透/洗滌溶液。 BD Cytofix / Cytoperm Plus Fixation / Permeabilization Kit（含有BD GolgiStop蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運抑制劑）提供了這兩種溶液加上含有莫能菌素的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運抑制劑，用于處

5、理新鮮移植或培養(yǎng)的細胞，以促進胞質(zhì)內(nèi)細胞因子的積累。 BD Cytofix / Cytoperm Plus固定/滲透試劑盒（含有BD GolgiPlug蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運抑制劑）提供了兩種溶液，另外還有一種含有布非司定A的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運抑制劑。這些試劑盒提供足夠的兩種染色200個細胞樣品的溶液。BD Cytofix / Cytoperm 固定/滲透試劑盒（目錄號554714）該試劑盒能夠使細胞固定和透化，其是用熒光染料共軛熒光標記的抗細胞因子抗體染色細胞內(nèi)細胞因子所必需的。 該試劑盒提供兩種試劑，固定/滲透溶液和BD Perm / Wash 緩沖液。 細胞固定和透化后，用BD Perm / Wash 緩沖

6、液洗滌細胞并稀釋抗細胞因子抗體進行染色。注意：用BD Perm / Wash 緩沖液稀釋抗細胞因子抗體很重要，而不是用標準染色緩沖液，以保持細胞內(nèi)染色的細胞處于透化狀態(tài)。試劑盒成分： 固定/滲透溶液（125mL） BD Perm / Wash 緩沖液，10X濃縮物含有胎牛血清（FBS）*和皂角苷（使用前在蒸餾水中稀釋1:10）（100mL）注1：雖然固定/滲透溶液和BD Perm / Wash 緩沖液含有防止污染的成分，建議使用無菌移液器除去溶液，使用后立即關閉瓶子。注2：BD Perm / Wash 緩沖液作為包含F(xiàn)BS *的10 *儲備溶液。 該產(chǎn)品的顏色可能因批次而異，并且可能含有可見的

7、沉淀物。 顏色變化和/或沉淀物不影響產(chǎn)品性能。 BD Cytofix / Cytoperm Plus固定/滲透試劑盒（BD GolgiStop蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運抑制劑）（目錄號554715）除了固定/滲透溶液和BD Perm / Wash BD Cytofix / Cytoperm中包含的緩沖液固定/滲透試劑盒，BD Cytofix / Cytoperm Plus固定/滲透試劑盒提供含有莫能菌素的BD GolgiStop蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑。BD GolgiStop離體添加到體外或體內(nèi)刺激的細胞阻斷其細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運過程。這導致大多數(shù)細胞因子蛋白在高爾基復合體中的積累，從而增強細胞因子染色信號（見圖2-4）。BD

8、 GolgiStop試劑，至少能處理1升細胞密度高達210 6個細胞/ mL的培養(yǎng)細胞。試劑盒成分：固定/滲透溶液（125 mL）BD Perm / Wash緩沖液，10 X濃縮液含有FBS *和皂角苷（使用前在蒸餾水中稀釋1:10）（100mL）BD GolgiStop蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑含有莫能菌素（也作為單獨組分出售;目錄號554724）（0.7mL）注意：BD Perm / Wash緩沖液是包含F(xiàn)BS的10 X儲備溶液。該產(chǎn)品的顏色可能因批次而異，并且可能含有可見的沉淀物。顏色變化和/或沉淀物不影響產(chǎn)品性能。 *所有血清蛋白的來源均來自美國農(nóng)業(yè)部檢查的位于美國的屠宰場BD Cytofix /

9、 Cytoperm Plus固定/滲透試劑盒（BD GolgiPlug蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運抑制劑）（目錄號555028）除了固定/滲透溶液和BD Perm / Wash BD Cytofix / Cytoperm中包含的緩沖液固定/滲透試劑盒，該試劑盒提供了另一種蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運抑制劑BD GolgiPlug，含有brefeldin A.參見圖2-4。BD GolgiPlug試劑，至少能處理1升細胞密度高達210 6個細胞/ mL的培養(yǎng)細胞。試劑盒成分：固定/滲透溶液（125 mL）1.BD Perm / Wash緩沖液，10 X濃縮物含有FBS *和皂苷（稀釋1:10在蒸餾水中使用前）（100mL）BD G

10、olgiPlug蛋白質(zhì)運輸抑制劑含有布雷菲德菌素A（也作為單獨成分出售;目錄號555029）（1mL）注意：BD Perm / Wash緩沖液是含F(xiàn)BS *的10 *儲備溶液。該產(chǎn)品的顏色可能因批次而異，并且可能含有可見的沉淀物。顏色變化和/或沉淀物不影響產(chǎn)品性能。 警告和注意事項危險BD Cytofix / CytopermTM緩沖液（固定和滲透溶液;組分51-2090KZ）含有4.2甲醛（w / w）。危險說明吸入有害。造成皮膚刺激。造成嚴重的眼睛損傷?？赡軐е缕つw過敏反應。懷疑造成遺傳缺陷?？赡軐е掳┌Y。接觸途徑：吸入?？赡芤鸷粑来碳?。防范說明穿防護服/眼睛防護。戴防護手套。不要吸入

11、霧/蒸氣/噴霧。如進入眼睛：用水小心沖洗數(shù)分鐘。去除隱形眼鏡，如果存在并且容易做到。繼續(xù)沖洗皮膚刺激或皮疹發(fā)生：求醫(yī)/咨詢。Danger BD GolgiStopTM蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運抑制劑（組分51-2092KZ）含有99.61乙醇（w / w）和0.26莫能菌素，mononatriumsalz（w / w）。危險性說明高度易燃的液體和蒸氣。造成嚴重眼刺激。防范說明：遠離熱源/火花/明火/熱表面。禁止抽煙。戴防護手套/防護眼睛。穿防護服。如果在皮膚（或頭發(fā)）上：立即脫掉所有受污染的衣服。用水淋浴沖洗皮膚。如進入眼睛：用水小心沖洗數(shù)分鐘。去除隱形眼鏡，如果存在并且容易做到。繼續(xù)沖洗按照地方/地區(qū)/國家

12、/國際規(guī)定處置內(nèi)裝物/容器。 一般程序細胞刺激已經(jīng)報道了用于刺激產(chǎn)生細胞因子的細胞的各種體外方法.1-6多克隆激活劑可用于誘導和表征細胞因子產(chǎn)生細胞。這些包括以下內(nèi)容：佛波酯和鈣離子載體或離子霉素，植物血凝素，葡萄球菌腸毒素B和針對TCR / CD3復合物亞單位的單克隆抗體（有或沒有針對共刺激受體如CD28的抗體）。注意：據(jù)報道，單獨使用PMA的細胞活化導致小鼠T細胞表面的CD4的表達瞬時喪失。據(jù)報道，用PMA和鈣離子載體一起活化細胞引起CD4表達的更大和持續(xù)的降低，（Cell activation with PMA and calcium ionophore together has bee

13、n reported to cause a greater and more sustained decrease in CD4 expression）以及小鼠胸腺細胞和小鼠和人外周T淋巴細胞中CD8表達的降低.使用BD GolgiStop蛋白質(zhì)運輸抑制劑（含有莫能菌素）的程序。每6 mL細胞加入4ulBD BD GolgiStop并徹底混勻。建議BD GolgiStop不要在細胞培養(yǎng)中保持超過12小時。注意：建議進行動力學研究測定每個實驗系統(tǒng)的最佳孵育時間。使用BD GolgiPlug蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運抑制劑（含布雷菲德菌素A）的程序BD GolgiPlug含有在4下為固體的DMSO。使用前請務必在

14、室溫下解凍。每1 mL細胞培養(yǎng)物加入1uL BD GolgiPlug，并徹底混勻。建議BD GolgiPlug不要在細胞培養(yǎng)中保持超過12小時。注意：建議進行動力學研究以測定每個實驗系統(tǒng)的最佳孵育時間。B. 方案：細胞表面抗原和細胞內(nèi)細胞因子的多色染色收細胞活細胞群體可以從體內(nèi)刺激的組織或用蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運抑制劑處理的體外刺激培養(yǎng)物制備。細胞應該從含有BD GolgiStop或BD GolgiPlug的培養(yǎng)基中脫出來，然后重新懸浮在染色培養(yǎng)基中，計數(shù)并轉(zhuǎn)移到塑料管或微孔板中進行免疫熒光染色。在染色和存儲過程中細胞應避光保護。嵌合Fc受體阻斷Fc受體的試劑可用于減少非特異性免疫熒光染色在小鼠系統(tǒng)中，對

15、于FcII/ III受體（BD Fc Block？;目錄號553142）特異的純化的2.4G2抗體可用于阻斷由Fc受體介導的熒光染料共軛熒光標記的抗體的非特異性染色。用Fc Block阻斷小鼠Fc受體，在100l染色緩沖液中用1gBD Fc Block / 106細胞預培養(yǎng)細胞懸液，在4下15分鐘。然后可以將細胞洗滌并用特異于感興趣的細胞表面抗原的熒光染料共軛熒光標記的抗體染色，該抗體應該在染色緩沖液中適當稀釋?？梢詫碜韵嗤锓N的10正常人血清或過量的不相關純化Ig的細胞和用同型作為免疫熒光染色的抗體來預先阻斷人細胞上的Fc受體。3.細胞表面抗原染色a.在50L染色緩沖液中用適量的針對細胞表

16、面抗原如CD3，CD4，CD8，CD14或CD19（30分鐘，4）特異性的熒光染料共軛熒光標記的的單克隆抗體。 注意：此時可以進行不同細胞表面抗原的多色染色，適當調(diào)節(jié)補償最亮熒光信號。識別細胞表面標記的一些抗體可能不結(jié)合固定/變性抗原.因此，建議染色細胞表面抗原時細胞是活的，未固定的細胞進行固定/透化和染色細胞內(nèi)細胞因子。改變細胞在染色細胞表面抗原之前固定的程序需要經(jīng)驗地鑒定合適的抗體克隆。 b.用染色緩沖液（例如，250L/微孔板洗滌，每管用1mL洗滌）洗滌細胞2次，并通過離心（250 * g）沉淀。4.固化和滲透細胞a.徹底重懸細胞，每孔（或250L管）加入100L固定/滲透溶液，4下，2

17、0分鐘。 注意：在添加固定/滲透溶液之前可以通過渦旋來避免細胞聚集。b.在1X BD Perm / Wash緩沖液中洗滌細胞兩次（例如，用于在管中染色的1mL /孔洗滌緩沖液和微孔板中染色的洗滌終體積250L）和沉淀。注意：在洗滌過程中，必須保持BD Perm / Wash緩沖液中，以保持細胞透化。5.備選固定和滲透方案 1. 為后續(xù)細胞內(nèi)染色，固定和儲存細胞。 a.細胞的固定和儲存 1.在4下用4多聚甲醛溶液重懸100L細胞，10-20分鐘（或1mL / 107細胞進行本體固定）。 2.在染色緩沖液中洗滌細胞2次。 3.將細胞懸浮在染色緩沖液中，在4下可儲存細胞72小時；或在90FCS /

18、10DMSO中儲存細胞，在-80下儲存更長時間。 b.滲透固定細胞 1.對于冷凍細胞，洗2 次除去DMSO。對于4的細胞，沉淀并除去染色緩沖液。 2.在BD Perm / Wash緩沖液中重懸細胞15分鐘。 3.通過離心沉淀。 4.細胞內(nèi)細胞因子染色。細胞內(nèi)細胞因子染色 a.在50含有預定的最佳濃度的熒光染料共軛熒光標記的抗細胞因子抗體或適當?shù)年幮詫φ盏腖BD Perm / Wash緩沖液中徹底重懸固/透化細胞。在黑暗中4孵育30分鐘。b.用1X BD Perm / Wash緩沖液洗滌細胞2次（每次用1mL洗滌染色管子和在微孔板中每孔終體積250L），并在流式細胞術分析前重懸于染色緩沖液中。C

19、.流式細胞分析用細胞表面染色做對照，設置PMT電壓和補償?；谕突蜃钄鄬φ蘸臀慈旧毎O置象限標記。注意：來源于人PBMC的活化的細胞因子產(chǎn)生細胞的頻率可以針對取決于供體的特定細胞因子而廣泛變化。來自一個供體的冷凍保存細胞可用于縱向研究。 對于正確的流式細胞分析，通過該方法染色的細胞應通過光學顯微鏡和/或流光散射圖檢查，以確認其分散良好。為了群體頻率測量有統(tǒng)計學意義，在流式細胞術分析過程中應該獲得足夠大的樣本量。可以在數(shù)據(jù)再分析時產(chǎn)生雙變量點圖或概率輪廓圖，以顯示各個細胞的細胞表面抗原和細胞內(nèi)細胞因子蛋白質(zhì)的共表達水平的頻率和模式。D.染色控制陽性染色控制 BD Biosciences熒光染

20、料共軛標記的抗細胞因子抗體的技術數(shù)據(jù)表提供了體外培養(yǎng)系統(tǒng)的具體實例，可檢測在特定時間點誘導細胞產(chǎn)生細胞因子的頻率。通過這些方法刺激的細胞可用作實驗系統(tǒng)的陽性對照。細胞活化方案的特別重要的參數(shù)包括蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運抑制劑的使用和多個時間點的檢查。免疫組織化學染色的發(fā)表報告和ELISPOT分析也可以提供關于產(chǎn)生細胞因子的細胞的不同實驗方案的有用信息。陰性染色控制 建議使用以下三種對照中的至少一種來區(qū)別特異性染色與人工染色。未染色細胞和同種型對照或阻斷控制的組合是最佳的?？蒲腥藛T可以選擇最適合其研究需要的染色控制。細胞內(nèi)細胞因子染色技術和阻斷對照的使用由C.Prussin和D.Metcalf.6詳細描述。a

21、.同型對照用匹配的沒有相關特異性的同型對照染色。1.將細胞沉淀重懸于50L含有與抗細胞因子抗體相當?shù)耐N型對照抗體濃度的BD Perm / Wash緩沖液2.在4下孵育30分鐘。3.使用上述程序洗滌細胞進行細胞內(nèi)染色。b.配體阻斷控制用重組細胞因子預阻斷抗細胞因子抗體。1.用至少50L 4的BD Perm / Wash緩沖液將含有細胞因子的熒光染料標記的抗體稀釋至適當濃度，30分鐘。2.在50l預封閉標記的抗細胞因子抗體中重懸固定/透化細胞（在BD Perm / Wash緩沖液中），并在4下孵育30分鐘。3.使用上述程序洗滌細胞進行細胞內(nèi)染色。C.未標記的抗體阻斷對照用未標記的抗體預孵育細胞。

22、1.BD Perm / Wash緩沖液含有未標記的抗細胞因子抗體，在25L該液中固定/透化細胞，稀釋至適當?shù)臐舛?，并?下孵育30分鐘。2.孵育后，在25L BD Perm / Wash緩沖液中以最優(yōu)濃度添加熒光染料標記的抗細胞因子抗體，（最終體積50L），并在4溫育30分鐘。3.使用上述程序洗滌細胞進行細胞內(nèi)染色。方案：染色緩沖液不含Mg2 +或Ca2 +的Dulbeccos PBS（DPBS）1熱滅活FCS0.09（w / v）疊氮化鈉將緩沖液pH調(diào)至7.4-7.6，過濾（0.2微米孔隙膜），并在4下儲存樣品數(shù)據(jù)圖1. BD Cytofix / Cytoperm溶液對細胞光散射特性、細胞表

23、面抗原染色和細胞內(nèi)細胞因子染色的影響。圖A和B分別顯示新鮮未經(jīng)處理的小鼠脾細胞和Ficoll分離的人外周血單核細胞的向前光散射和側(cè)光散射圖。圖C和D顯示了用固定/滲透溶液處理后的相同細胞（在圖A和B中）的向前光散射和側(cè)光散射圖。圖E和F分別是用抗CD4和抗CD8染色的小鼠和人細胞的實例，隨后用固定/滲透溶液孵育。圖G和H分別是在BD GolgiStop蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運抑制劑的存在下在培養(yǎng)物中被激活的小鼠和人細胞的實例。用PE-anti-CD4或PE-Cy5anti-CD3染色，然后用固定/滲透溶液孵育。然后用于細胞內(nèi)IL-2（小鼠）和IFN-（人）染色。圖2.蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運抑制劑對細胞內(nèi)細胞因子染色信號

24、的影響。在有（右圖）或沒有（左圖）2M莫能菌素（又名BDGolgiStop蛋白運輸抑制劑）的情況下，用PMA（50ng / mL）和鈣離子載體A23187（250ng / mL）刺激PMBC 6小時。收集細胞，用PE-Cy5抗人CD3（目錄號555334）染色，固定，透化，隨后用PE抗人IL-2（目錄號554566;頂圖），PE抗 - 人類TNF（目錄號554513;中圖）或FITC抗人IFN-（目錄號554551;底圖）。圖3. 比較BD GolgiPlug和BD GolgiStop對活化的小鼠脾細胞內(nèi)細胞因子積累的影響。通過給該小鼠細胞內(nèi)細胞因子染色來評估IL-2和TNF的產(chǎn)生，在有蛋白質(zhì)

25、運輸抑制劑BD GolgiPlug或BD GolgiStop條件下，用固定的抗CD3（25g/ ml）+可溶性抗CD28（2g/ ml）活化該小鼠脾細胞4小時，在這種情況下，BD GolgiPlug和BD GolgiStop在誘導IL-2和TNF積累方面相當有效。圖4. 比較BD GolgiPlug和BD GolgiStop對再活化的純化小鼠CD4 +細胞對細胞內(nèi)細胞因子積累的影響。在BD GolgiPlug或BD GolgiStop存在下，將活化的小鼠CD4 +細胞用PMA（10ng / mL）加離子霉素（250ng / mL）再刺激5小時，并對所列細胞內(nèi)細胞因子染色。在這種情況下，BD G

26、olgiPlug更有效地誘導TNF積聚，而BD GolgiStop更有效地誘導IL-4和IL-10的積累。Ficol-hypaque分離液純化人類PBMC vs 全血圖5.相同供體中，活化的PBMC或活化的全血染色時，可檢測到產(chǎn)生細胞因子的細胞頻率是相當?shù)膶碜匀齻€供體中每一個純化的人PBMC（左圖）和全血（右圖），在2M BD GolgiStop的存在下，用PMA（50ng / mL）和離子載體A23187（1g/ mL）活化5小時，固定，透化并用PE-抗人IL-4（目錄號554485; 0.06g）和FITC-抗人IFN-（目錄號554700;0.25g）染色，根據(jù)BD Bioscienc

27、es細胞內(nèi)細胞因子染色方案（標準或全血法）。備選方案激活和全血細胞內(nèi)染色1.用IMDM稀釋全血1：1。混合好2.將細胞活化劑或絲裂原加入稀釋的血液（例如，50ng / mL PMA Sigma，目錄號P-8139 +1g/ mL鈣離子載體A23187 Sigma，Cat.No.C-7522或PMA +1M離子霉素Sigma，目錄號I-0634 - 終濃度）。添加蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運抑制劑：BD GolgiPlug 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運抑制劑（目錄號555029）1L溶液/ 1mL稀釋血液（又名布雷菲德菌素A，1.0g/ mL終濃度）或BD GolgiStop蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運抑制劑（目錄號554724）0.7L溶液/ 1

28、mL稀釋血液（又名莫能菌素，2.0M終濃度）。渦旋混合。等分成12 X75 mm塑料管，200L /管。在37的5CO 2中孵育4-6小時。必須研究最佳孵育時間，孵育時間不應超過24小時。5.加2 mL 1 X BD PharmLyse （目錄號555899），渦旋，在室溫下在黑暗中孵育10分鐘。6.旋轉(zhuǎn)5分鐘，500 X g。7.吸出上清。用染色緩沖液洗1 X。以500 g旋轉(zhuǎn)5分鐘。吸出上清。8.在100L染色緩沖液中重懸細胞沉淀，該緩沖液中含有最佳濃度的細胞表面抗原特異性的熒光染料共軛標記抗體（如FITC-，PE-，PE-Cy5-抗CD3，CD4，CD8，CD14等）的。在黑暗中室溫孵育

29、15分鐘。在染色緩沖液中洗1 X。旋轉(zhuǎn)5分鐘，500 g。吸出上清。9.加500L固定/滲透溶液固定和滲透細胞。在黑暗中和在室溫條件下渦旋和孵育20分鐘。旋轉(zhuǎn)5分鐘，500 g。吸出上清。10.加入2 mL BD Perm / Wash緩沖液洗滌細胞。在黑暗中和在室溫條件下孵育10分鐘。旋轉(zhuǎn)5分鐘，500g。吸出上清。11.在100L BD Perm / Wash緩沖液中重懸細胞沉淀，該緩沖液中含有最佳濃度的熒光染共軛標記的抗細胞因子抗體，該抗體用于細胞內(nèi)染色，（例如0.25g/試驗）。請參閱技術數(shù)據(jù)表，了解抗體特異性推薦濃度。在黑暗中和室溫下染色30分鐘。12.加2 mL BD Perm /

30、 Wash緩沖液洗滌細胞。旋轉(zhuǎn)5分鐘，500g。吸出上清13.將細胞沉淀重懸于500L PBS / 2多聚甲醛溶液（渦旋，同時加入PBS / PFA）。14.流式細胞儀分析。預期結(jié)果 用PMA /離子霉素激活正常人血液 5小時，通?？蓹z測到產(chǎn)生的IL-2，IL-4，IFN-和TNF表達細胞的頻率（淋巴細胞門）。 用LPS激活正常人血液6小時，通?？蓹z測到產(chǎn)生IL-1，IL-6，IL-8和MIP-1表達細胞的頻率（單核細胞門）。注意：不同供體之間典型的細胞因子 - 生產(chǎn)細胞頻率有差異。解決方案染色緩沖液不含Mg2 +或Ca2 +的Dulbeccos PBS（DPBS）1熱滅活FCS0.09（w

31、/ v）疊氮化鈉調(diào)緩沖液pH至7.4-7.6，過濾（0.2微米孔隙膜），并在4下儲存IMDM（BioWhittaker-目錄號12-726Q）是有利于維持培養(yǎng)中全血細胞活力的細胞培養(yǎng)基。 參考文獻 1.Assenmacher，M.，J. Schmitz和A. Radbruch。 1994.流式細胞術測定活化的鼠T輔助淋巴細胞中的細胞因子：干擾素-和白細胞介素-4表達細胞中白細胞介素-10的表達。歐元。 J.Immunol。 24：1097年至1101年。2. Elson，L.H.，T.B.Hampman，D.D.Metcalfe和C.Prussin。細胞因子產(chǎn)生的流式細胞術分析鑒定人CD4 + CD27-淋巴細胞亞群內(nèi)的Th1，Th2和Th0細胞。 J.Immunol。 154：4294-4301。3. Sander，B.，J. Andersson和U. Andersson。 1991.通過免疫熒光和多聚甲醛皂苷程序評估細胞因子。免疫。 Rev. 119：65-93。4. Vikingson，A.，K. Pederson和D. Muller。 1994.通過流式細胞術計數(shù)產(chǎn)生IFN-的淋巴細胞，并與IFN-的定量測量相關。 J.Immunol。冰毒。 173：219-228。5. Jung，T.，U. S