藥物分析第十六章抗生素類藥物分析課件

1、第十六章抗生素類藥物的分析藥物分析教研室1Contents概 述1-內(nèi)酰胺類2氨基糖苷類3四環(huán)素類4高分子雜質(zhì)檢查52第一節(jié) 概述在低微濃度下即可對(duì)某些生物（病原微生物）的生命活動(dòng)有特異抑制作用的化學(xué)物質(zhì)的總稱抗生素（antibiotics）定義3來源生物合成（發(fā)酵） 化學(xué)合成或半合成特點(diǎn)化學(xué)純度較低-同系物、異構(gòu)體及降解物多活性組分易發(fā)生變異-微生物菌株或者發(fā)酵條件的改變都會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量發(fā)生變化穩(wěn)定性差-活性中心往往是活潑基團(tuán)，不穩(wěn)定4按化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)分類-內(nèi)酰胺類（-lactam）含有-內(nèi)酰胺類結(jié)構(gòu)的抗生素，如青霉素、頭孢菌素、碳青霉素烯類等等；四環(huán)素類：含有四并苯的木考核，如四環(huán)素、土霉

2、素、金霉素等；氨基糖苷類：結(jié)構(gòu)中含有氨基糖苷和氨基環(huán)醇，如鏈霉素、慶大霉素等大環(huán)內(nèi)酯類：含有大環(huán)內(nèi)酯作為配糖體，如紅霉素，螺旋霉素等；多肽類：抗菌肽，萬古霉素、多粘菌素B等；抗腫瘤類：絲裂霉素、平陽霉素等；其他類抗生素藥物的分類5按照生物來源分類細(xì)菌產(chǎn)生的抗生素 如多粘菌素和桿菌肽。真菌產(chǎn)生的抗生素 如青霉素及頭孢菌素，現(xiàn)在多用其半合成產(chǎn)物。放線菌產(chǎn)生的抗生素 放線菌是生產(chǎn)抗生素的主要來源。其中鏈霉菌和小單孢菌產(chǎn)生的抗生素最多。常見的抗生素包括鏈霉素、卡那霉素、四環(huán)素、紅霉素、兩性霉素B等。6抗菌藥物的作用機(jī)制 根據(jù)對(duì)病原菌的作用靶位，將抗生素的作用機(jī)制分為四類抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成影響胞漿膜通透

3、性（多粘菌素）抑制蛋白質(zhì)合成（大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖甙類）抑制核酸代謝：葉酸代謝；核酸合成（喹諾酮、磺胺類）7抗菌藥物的主要作用部位喹諾酮類林可霉素類氨基糖苷類酮康唑環(huán)絲氨酸利福平紅霉素制霉菌素桿菌肽甲氧芐胺嘧啶四環(huán)素類兩性霉素B萬古霉素磺胺藥氯霉素多粘菌素類-內(nèi)酰胺類核酸合成細(xì)胞蛋白合成細(xì)胞膜滲透性細(xì)胞壁8耐藥分類(一)固有耐藥（intrinsic resistance）固有耐藥性指細(xì)菌對(duì)某些抗菌藥物的天然不敏感。固有耐藥性細(xì)菌稱為天然耐藥性細(xì)菌，其耐藥基因來自親代，由細(xì)菌染色體基因決定而代代相傳的耐藥性，存在于其染色體上，具有種屬特異性。如腸道桿菌對(duì)青霉素的耐藥，固有耐藥性始終如一并可預(yù)測(cè)。（

4、二）獲得耐藥（acquired resistance）在原先對(duì)藥物敏感的細(xì)菌群體中出現(xiàn)了對(duì)抗菌藥物的耐藥性，這是獲得耐藥性與固有耐藥性的重要區(qū)別。細(xì)菌的耐藥機(jī)制9細(xì)菌的耐藥機(jī)制產(chǎn)生鈍化酶使抗菌藥物失效藥物作用靶位的結(jié)構(gòu)和數(shù)量改變抗菌藥不易與細(xì)菌結(jié)合主動(dòng)外排機(jī)制藥物被泵出菌體外10產(chǎn)品穩(wěn)定性差分子結(jié)構(gòu)大多不穩(wěn)定，降解后療效下降、失效或增加毒副作用發(fā)酵過程不易控制易受污染生產(chǎn)工藝復(fù)雜發(fā)酵液中雜質(zhì) 無機(jī)鹽、脂肪、各種蛋白質(zhì)、各種降解產(chǎn)物、色素、熱原、毒性物質(zhì) 抗生素質(zhì)量的復(fù)雜性 11抗生素質(zhì)量分析生物學(xué)法、物理化學(xué)法 鑒別：理化方法(主要方法)、微生物法官能團(tuán)的顯色反應(yīng)，如：-內(nèi)酰胺環(huán)的羥肟酸鐵反應(yīng)

5、；鏈霉素的麥芽酚反應(yīng)、坂口反應(yīng)；光譜法：紅外光譜及紫外吸收光譜的鑒別。色譜法：HPLC和TLC法，采用標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照品對(duì)照法；生物學(xué)法：比較抑菌能力，現(xiàn)已少用?？股刭|(zhì)量分析12 檢查：影響產(chǎn)品穩(wěn)定性的檢查項(xiàng)目：結(jié)晶性、酸堿度、水分或者干燥失重等控制有機(jī)和無機(jī)雜質(zhì)的項(xiàng)目：溶液澄清度與顏色、有關(guān)物質(zhì)、殘留溶劑、熾灼殘?jiān)⒅亟饘俚?；與臨床安全性有關(guān)的檢查項(xiàng)目：異常毒性、熱源或細(xì)菌內(nèi)毒素、降壓物質(zhì)、無菌等13 效價(jià)：每毫升或每毫克中含有某種抗生素的有效成分的多少。由單位（u）或微克（g）表示。 各種抗生素的效價(jià)基準(zhǔn)是人們?yōu)榱松a(chǎn)科研方便而規(guī)定的。 1mg青霉素鈉定為1670單位；1mg慶大霉素定為590

6、單位。 相應(yīng)的鹽可以通過分子量與標(biāo)準(zhǔn)鹽類進(jìn)行換算。抗生素活性表示方法14含量/效價(jià)測(cè)定： 微生物法：與臨床療效吻合,靈敏度高，結(jié)果直觀，適用范圍廣；但操作復(fù)雜費(fèi)時(shí)，誤差大 理化方法：準(zhǔn)確度與專屬性較高, 且操作簡(jiǎn)便；但與臨床療效有偏差15第二節(jié) 內(nèi)酰胺類6-aminopenicillanic acid簡(jiǎn)稱6-APA青霉素類7-aminocephalosporanic acid,簡(jiǎn)稱7-ACA頭孢菌素類氫化噻唑環(huán)氫化噻嗪環(huán)16第二節(jié) 內(nèi)酰胺類 青霉素(芐青霉素) (penicillins)氨芐西林阿莫西林17第二節(jié) 內(nèi)酰胺類頭孢氨芐頭孢拉定頭孢羥氨芐頭孢噻吩鈉18第二節(jié) 內(nèi)酰胺類一、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)1

7、.酸性（羧基） pKa 2.5-2.8，酸性較強(qiáng)。堿金屬鹽水溶性好，有機(jī)堿鹽難溶于水。2.手性C （旋光性）19第二節(jié) 內(nèi)酰胺類3.UV青霉素類：苯環(huán)取代基頭孢菌素類：母核有共軛結(jié)構(gòu)260nm204. 內(nèi)酰胺環(huán)(四元環(huán)張力+酰胺鍵 ) 第二節(jié) 內(nèi)酰胺類干燥條件較穩(wěn)定，溶液不穩(wěn)定某些氧化劑、金屬離子、溫度21第二節(jié) 內(nèi)酰胺類二、鑒別試驗(yàn)(一)色譜法HPLC (tR)TLC (Rf)(二)光譜法IR UVNMR22第二節(jié) 內(nèi)酰胺類23第二節(jié) 內(nèi)酰胺類(三)呈色反應(yīng)1）羥肟酸鐵反應(yīng)內(nèi)酰胺環(huán)內(nèi)酰胺類NH2OHHClNaOH羥肟酸 Fe3+ H+顯色（紅、棕、褐）2）類似肽鍵（-CONH-）a.茚三酮反

8、應(yīng)-氨基 24第二節(jié) 內(nèi)酰胺類b.雙縮脲反應(yīng)內(nèi)酰胺類 堿性酒石酸銅紫色25第二節(jié) 內(nèi)酰胺類3）其他呈色反應(yīng)（偶合）青霉素鉀和青霉素鈉呈紅棕色(四)各種鹽的反應(yīng)焰色反應(yīng)K+、Na+26第二節(jié) 內(nèi)酰胺類(聚合物、有關(guān)物質(zhì)、異構(gòu)體等)1.聚合物頭孢他啶中聚合物測(cè)定分子排阻色譜凝膠色譜分子篩機(jī)制 主成分自身對(duì)照法 面積歸一化法 限量法 自身對(duì)照外標(biāo)法 萄聚糖凝膠立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)圖三、雜質(zhì)檢查27第二節(jié) 內(nèi)酰胺類2.有關(guān)物質(zhì)與異構(gòu)體頭孢呋辛酯中有關(guān)物質(zhì)和異構(gòu)體的檢查 取本品適量，精密稱定，加流動(dòng)相制成約含0.25mg/ml的溶液，作為供試品溶液；精密量取適量，加流動(dòng)相制成2.5 g/ml的溶液，作為對(duì)照溶液

9、。取對(duì)照溶液20l注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)儀器靈敏度，使主成分峰高約為記錄儀滿量程的10%，再取供試品溶液和對(duì)照品溶液各20l，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖至主峰保留時(shí)間的3.5倍，供試品溶液如顯雜質(zhì)峰，量取各雜質(zhì)峰面積的和，其中E異構(gòu)體峰面積不得大于對(duì)照溶液主峰面積之和(1.0%)，3-異構(gòu)體峰面積不得大于1.5倍(1.5%)，其余單個(gè)雜質(zhì)峰面積的和不得大于3倍(3.0%)。(供試品溶液中任何小于對(duì)照品溶液主峰面積之和0.05倍的峰可忽略不計(jì))28青霉素鈉(鉀)的吸光度檢查：本品加水制成每1mL含有1.80mg的溶液，照UV-Vis法，在280nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，不得大于0.10；在264n

10、m波長(zhǎng)處有最大吸收，吸光度應(yīng)為0.80-0.88.該法264nm處吸收值用來控制青霉素鈉(鉀)的含量，280nm處吸收值用來控制雜質(zhì)的含量。3.UV第二節(jié) 內(nèi)酰胺類29第二節(jié) 內(nèi)酰胺類4.有機(jī)溶劑：用GC法或者HPLC法5.結(jié)晶性第一法(偏光顯微鏡法)第二法(X射線粉末衍射法)30四、含量測(cè)定 碘量法 汞量法 酸堿滴定法 羥肟酸比色法 HPLC法第二節(jié) 內(nèi)酰胺類31阿莫西林克拉維酸鉀片色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以磷酸鹽緩沖液(取磷酸二氫鈉7.8g，加水900 ml溶解，用磷酸或10mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至4.40.1，加水稀釋至1000ml)-甲醇(9

11、5:5)為流動(dòng)相；流速為0.7ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm。阿莫西林峰與克拉維酸峰的分離度應(yīng)大于3.5 測(cè)定法 取本品10片，置1000ml量瓶中，加水適量，振搖使溶解，加水稀釋至刻度，搖勻，精密量取10ml，置50ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液10l注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取阿莫西林對(duì)照品與克拉維酸對(duì)照品各適量，加水溶解，制成每1ml中含阿莫西林0.5mg和克拉維酸0.25mg的混合溶液，同法測(cè)定。按外標(biāo)法以峰面積分別計(jì)算供試品中C16H19N3O5S和C8H9NO5的含量。第二節(jié) 內(nèi)酰胺類32第三節(jié) 氨基糖苷類 堿性環(huán)己多元醇+氨基糖苷鏈霉素(Streptom

12、ycin)33巴龍霉素(paromomycin)D-葡萄糖胺脫氧鏈霉胺巴龍胺D核糖巴龍霉糖巴龍二糖胺第三節(jié) 氨基糖苷類34慶大霉素(Gentamycin)35一、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)1）溶解度（氨基、羥基）：水溶性2）堿性（氨基）：臨床應(yīng)用其硫酸鹽；溶于水，但不溶于有機(jī)溶劑；3）旋光性（糖）：多個(gè)手性碳4）穩(wěn)定性（苷）：強(qiáng)酸、堿條件均可水解；臨床使用時(shí)對(duì)pH值有很高的要求；5）紫外吸收光譜第三節(jié) 氨基糖苷類361.茚三酮反應(yīng)羥基胺類,-氨基酸二、鑒別反應(yīng)第三節(jié) 氨基糖苷類372. Molisch 試驗(yàn) 五碳糖或六碳糖結(jié)構(gòu)紅紫色羥甲基糠醛(含六碳糖結(jié)構(gòu)氨基糖苷類酸性水解產(chǎn)物)a.-萘酚b.萘酮藍(lán)紫色第三節(jié)

13、 氨基糖苷類383. N-甲基葡萄糖胺反應(yīng)（Elson-Morgan反應(yīng)）乙酰丙酮OH-吡咯衍生物對(duì)二甲氨基苯甲醛H+紅色第三節(jié) 氨基糖苷類394.麥芽酚反應(yīng)鏈霉糖特有反應(yīng)H+第三節(jié) 氨基糖苷類40紫紅麥芽酚415.坂口反應(yīng)鏈霉胍特有反應(yīng)（或-萘酚）42坂口反應(yīng)麥芽酚反應(yīng)N-甲基葡萄糖胺反應(yīng)第三節(jié) 氨基糖苷類436.硫酸鹽反應(yīng)7.色譜法：TLC和HPLC法8.光譜法：IR、UV第三節(jié) 氨基糖苷類44三、雜質(zhì)檢查1.鏈霉素中鏈霉素B（甘露糖鏈霉素）的檢查來源：發(fā)酵中產(chǎn)生方法：TLC中的對(duì)照品法2.硫酸奈替米星中西索米星的檢查(TLC)3.慶大霉素C組分的測(cè)定第三節(jié) 氨基糖苷類45四、含量測(cè)定微生

14、物檢定法平行反應(yīng)，檢測(cè)同等量下供試品和對(duì)照品對(duì)微生物的抑制作用；管碟法：利用抗生素在瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)的擴(kuò)散作用，比較標(biāo)準(zhǔn)品和供試品對(duì)菌群產(chǎn)生的抑菌圈大??；濁度法：通過抗生素在液體培養(yǎng)基中對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制作用，通過測(cè)定培養(yǎng)后細(xì)菌濁度值的大小，比較標(biāo)準(zhǔn)品和供試品抑菌程度，測(cè)定供試品效價(jià)；-該法優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高、量少、直觀；與臨床要求一直；使用范圍廣；是效價(jià)測(cè)定的最基本方法；目前分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜、多組分抗生素，首選該法測(cè)效價(jià)。-該法缺陷：操作步驟多，時(shí)間長(zhǎng)，誤差大。第三節(jié) 氨基糖苷類46HPLC法有紫外吸收紫外、熒光檢測(cè)器無紫外吸收衍生化； 電化學(xué)檢測(cè)器或蒸發(fā)光散射法第三節(jié) 氨基糖苷類47第四節(jié) 四環(huán)素類AB

15、CD123456789101112四個(gè)并苯或萘并萘48一、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)1）兩性： -OH酸性 N(CH3)2堿性 Ca2+、Mg2+生成不溶性鹽；Fe3+形成紅色配合物； Al3+形成黃色配合物 ；pH3 7.5 多價(jià)陽離子與酚二酮熒光 與酸、堿均可成鹽； 臨床多用鹽酸鹽； 強(qiáng)酸或強(qiáng)堿中溶解度 2）旋光性3）與金屬離子絡(luò)合(酚羥基、烯醇基)第四節(jié) 四環(huán)素類494）UV和熒光 鹽酸土霉素 經(jīng)酸或堿降解，呈綠色熒光，加熱轉(zhuǎn)為藍(lán)色； 鹽酸金霉素 經(jīng)堿降解，呈藍(lán)色熒光；鹽酸四環(huán)素 經(jīng)堿降解，呈黃色熒光。可區(qū)別不同四環(huán)素類抗生素50弱酸性（pH2-6） A環(huán)C-4異構(gòu)化 差向四環(huán)素酸性（pH 2） C環(huán)脫

16、水 脫水四環(huán)素堿性 C環(huán)開環(huán)，形成內(nèi)酯 異四環(huán)素5）不穩(wěn)定性A.差向異構(gòu)化藍(lán)色熒光淡黃黑第四節(jié) 四環(huán)素類51AApH2.06.0（氫鍵，土霉素、多西環(huán)素不易差向異構(gòu)化）第四節(jié) 四環(huán)素類52B.酸性脫水降解max = 445nmmax = 435nmDDDCBBCBC第四節(jié) 四環(huán)素類53C.堿性脫水降解OH-第四節(jié) 四環(huán)素類54二、鑒別試驗(yàn)1、HPLC2、TLC (正相分配薄層色譜)薄層板中加入EDTA克服痕量金屬造成的拖尾現(xiàn)象3、IR4、UV：最大吸收波長(zhǎng)和制定濃度下的吸光度；5、顯色法濃硫酸三氯化鐵第四節(jié) 四環(huán)素類5556三、雜質(zhì)檢查1.有關(guān)物質(zhì)HPLC2.雜質(zhì)吸光度UV淡黃色黑色脫水四環(huán)素 橙紅色差向脫水四環(huán)素 磚紅色第四節(jié) 四環(huán)素類57第五節(jié) 高分子雜質(zhì)的檢查高分子雜質(zhì)：藥物中分子量大于藥物本身的雜質(zhì)的總稱，10005000Da。與過敏反應(yīng)有關(guān)。生產(chǎn)過程貯存過程使用不當(dāng)高分子雜質(zhì)內(nèi)源性(藥物自身聚合物 )外源性(蛋白、多肽、多糖及其與藥物的結(jié)合物 )發(fā)酵過程控制重點(diǎn)來源581.基本結(jié)構(gòu)青霉素族多肽（青霉素噻唑多肽）聚合物母核參于反應(yīng)側(cè)鏈參于反應(yīng)頭孢菌素族與母核有關(guān)的N型聚合反應(yīng)側(cè)鏈參與反應(yīng)的L