代謝工程-周奕騰改+試卷

1、紅色為11級(jí)真題試卷1代謝工程:利用基因工程技術(shù),有目的地對(duì)細(xì)胞代謝途徑進(jìn)行精確的修飾、改造或擴(kuò)展、構(gòu)建新的代謝途徑,以改變生物體原有代謝特性，并與基因調(diào)控、代謝調(diào)控及生化工程相結(jié)合,提高目的代謝產(chǎn)物活性或產(chǎn)量、或合成新的代謝產(chǎn)物的工程技術(shù)科學(xué)。2代謝工程的四大助手：1.組學(xué)技術(shù)，計(jì)算系統(tǒng)生物學(xué)，這兩種技術(shù)有助于代謝工程的分析方面2蛋白質(zhì)工程，合成生物學(xué)，有助于代謝工程的基因操作方面.3三大代謝途徑：糖酵解（EMP）、三羧酸循環(huán)（TCA）、磷酸戊糖途徑（HMP）或稱(chēng)PPP4.兩個(gè)應(yīng)用實(shí)例：A、添加物導(dǎo)致代謝途徑酶活加強(qiáng)：加維生素增強(qiáng)了磷酸果糖激酶活性和乳酸脫氫酶活性，增強(qiáng)了乳酸的生產(chǎn)B、加入葡

2、萄糖酸鈣能促進(jìn)高6一磷酸葡萄糖脫氫酶和葡萄糖激酶的酶活力，促進(jìn)了肌苷的合成4、酶調(diào)節(jié)方式、反饋調(diào)節(jié)方式：微生物代謝調(diào)節(jié)成節(jié)合調(diào)酶的性節(jié)活調(diào)酶的廠誘導(dǎo)r產(chǎn)物阻遏反饋?zhàn)瓒?、阻蝌I分解代謝物阻遏衰減作用r共價(jià)修飾（級(jí)聯(lián)系統(tǒng)與信號(hào)傳導(dǎo)）變構(gòu)控制反饋抑制丿其它調(diào)節(jié)方式反痛節(jié)5、操縱子：指啟動(dòng)基因、操縱基因和一系列緊密連鎖的結(jié)構(gòu)基因的總稱(chēng)。轉(zhuǎn)錄的功能單位。很多功能上相關(guān)的基因前后相連成串，由一個(gè)共同的控制區(qū)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的控制，包括結(jié)構(gòu)基因以及調(diào)節(jié)基因的整個(gè)DNA序列。主要見(jiàn)于原核生物的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，如乳糖操縱子、阿拉伯糖操縱子、組氨酸操縱子、色氨酸操縱子等6、分支代謝調(diào)節(jié)途徑：同功酶調(diào)節(jié)：催化相同反應(yīng)，但酶分子結(jié)

3、構(gòu)有差異；協(xié)同反饋抑制：一個(gè)不能少；累積反饋抑制：按比例累加，無(wú)協(xié)同效應(yīng)，無(wú)拮抗作用；增效反饋抑制：1+12（末端產(chǎn)物Y和Z單獨(dú)過(guò)量時(shí)，各自對(duì)途徑中第一個(gè)酶E1僅產(chǎn)生較小的抑制作用，一種末端產(chǎn)物過(guò)量并不影響其他末端產(chǎn)物的形成。只有當(dāng)Y和Z同時(shí)過(guò)量，才能對(duì)E1產(chǎn)生較大的抑制作用。）順序反饋抑制：按ff順序逐步抑制；聯(lián)合激活或抑制調(diào)節(jié)：途徑產(chǎn)物各自調(diào)節(jié)，同一中間產(chǎn)物；7、會(huì)計(jì)算累積反饋抑制（試卷時(shí)60%,20%,68%）如30%和40%：30%*（100%-40%）+40%=58%8、不同谷氨酸生產(chǎn)菌的兩大特征：a-酮戊二酸脫氫酶的缺乏;對(duì)生物素的需要（生物素缺陷型）9、代謝流（物流/通量）（fl

4、ux）指流入代謝物經(jīng)該途徑轉(zhuǎn)變?yōu)榱鞒鑫锏乃俾省?0、代謝流分析（metabolicfluxanalysis）：又稱(chēng)代謝通量分析，一種計(jì)算流經(jīng)各種途徑的通量的技術(shù)，用于描述不同途徑的相互作用和圍繞支點(diǎn)的物流分布。11、代謝設(shè)計(jì)原理：提高通向目標(biāo)產(chǎn)物的代謝流；擴(kuò)展代謝途徑；構(gòu)建新的代謝途徑12、代謝工程研究的基本程序：改良靶點(diǎn)的確定；基因操作；效果分析13、基因操作：基因過(guò)量表達(dá)，基因敲除，異源基因?qū)?4、四大組學(xué)：基因組學(xué)與比較基因組學(xué)；轉(zhuǎn)錄組學(xué)；蛋白質(zhì)組學(xué)；代謝組學(xué)15、英文簡(jiǎn)稱(chēng)：LC：液相色譜；GC：氣相色譜；GC-MS:氣質(zhì)聯(lián)用儀；NMR：核磁共振；HPLC:高效液相色譜;CE：毛細(xì)管電

5、泳；2-DE：雙向凝膠電泳；DIMS:直接注射質(zhì)譜；FT-IR:傅立葉轉(zhuǎn)換紅外色譜；IEF：等電聚焦；ESIMS:電噴霧質(zhì)譜；RI：示差折光檢測(cè)法；UV：紫外檢測(cè)法；15、比較基因組學(xué):在基因組圖譜和序列分析的基礎(chǔ)上，對(duì)已知基因和基因的結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較,了解基因的功能、表達(dá)調(diào)控機(jī)制和物種講化過(guò)程的學(xué)科。16、代謝工程+的基本研究思路I遺傳修可=羸效主嚴(yán)菌株設(shè)計(jì)策略|代謝廿析圖1代謝丁程循壞其中設(shè)計(jì)策略是基礎(chǔ)，遺傳修飾是關(guān)鍵，代謝分析則決定是否需要進(jìn)行新一輪的代謝工程循環(huán)。17、代謝通量分析：代謝通量的概念、胞內(nèi)通量的確定方法以及通過(guò)代謝通量的系統(tǒng)研究所得到的結(jié)論，統(tǒng)稱(chēng)為代謝通量分析18、代謝通量計(jì)

6、算（入為+，出為一）18、AX（t）=0如果方程數(shù)小于反應(yīng)速率數(shù)目（代謝通量），方程有無(wú)數(shù)解或不確定解，稱(chēng)為不定系統(tǒng)。如果方程數(shù)大于反應(yīng)速率數(shù)目，稱(chēng)為超定系統(tǒng)。19、載流途徑：是代謝網(wǎng)絡(luò)中的一部分途徑首尾相銜接形成的一條從原料化合物到目的產(chǎn)物的途徑。20、設(shè)計(jì)育種以及發(fā)酵工藝控制的的五字策略：“進(jìn)、通、節(jié)、堵、出”進(jìn)，促進(jìn)細(xì)胞對(duì)碳源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收；通，使來(lái)自上游和各個(gè)注入分支的碳架物質(zhì)能暢通地流向目的產(chǎn)物；節(jié)，阻塞與目的產(chǎn)物的形成無(wú)關(guān)或關(guān)系不大的代謝支流，使碳架物質(zhì)相對(duì)集中地流向目的產(chǎn)物；堵，消除或削弱目的產(chǎn)物進(jìn)一步代謝的途徑；出，促進(jìn)目的產(chǎn)物向胞外空間分泌。21、節(jié)點(diǎn)：即代謝網(wǎng)絡(luò)的分支點(diǎn)，是

7、代謝網(wǎng)絡(luò)中一個(gè)反應(yīng)序列分叉成兩條或更多條不同途徑的一些點(diǎn)（代謝物）。主節(jié)點(diǎn)：雖然一個(gè)代謝網(wǎng)絡(luò)由大量的節(jié)點(diǎn)組成，一般相信在相當(dāng)少的節(jié)點(diǎn)處的分配比實(shí)際上影響著終產(chǎn)物的得率，這些節(jié)點(diǎn)稱(chēng)為主節(jié)點(diǎn)。節(jié)點(diǎn)的分配比：節(jié)點(diǎn)輸出途徑的代謝流的比值。22、柔性節(jié)點(diǎn)：若流入每一分支的流量容易改變以滿足需求，這樣的節(jié)點(diǎn)稱(chēng)為柔性節(jié)點(diǎn)(flexiblenode)。剛性節(jié)點(diǎn)：若一個(gè)節(jié)點(diǎn)的一個(gè)或多個(gè)分支的分配率被嚴(yán)密控制，則稱(chēng)該節(jié)點(diǎn)是強(qiáng)剛性的。半柔性(弱剛性)節(jié)點(diǎn)：若在一個(gè)節(jié)點(diǎn)的流量分配，由它的一個(gè)分支的動(dòng)力學(xué)占優(yōu)勢(shì)，則稱(chēng)該節(jié)點(diǎn)是半柔性(弱剛性)節(jié)點(diǎn)。23、會(huì)判斷(柔性節(jié)點(diǎn)，分配比可變，總量相同。剛性節(jié)點(diǎn)分配比不變，比例相同

8、)(B)(B)獨(dú)立網(wǎng)絡(luò)S-I-IIP或BiB2若節(jié)點(diǎn)1柔性，節(jié)點(diǎn)2剛性，削弱到B1或B2的代謝通量，對(duì)產(chǎn)物P的代謝通量會(huì)有什么影響？若節(jié)點(diǎn)1剛性、節(jié)點(diǎn)2柔性，結(jié)果又會(huì)怎么樣？節(jié)點(diǎn)1柔性節(jié)點(diǎn)2剛性：削弱B1的代謝通量，1增大，P變大削弱B2的代謝通量，P變小節(jié)點(diǎn)1剛性節(jié)點(diǎn)2柔性：削弱B1的代謝通量，1減小，P變小削弱B2的代謝通量,P增加(A)相依網(wǎng)絡(luò)S-I若節(jié)點(diǎn)1或節(jié)點(diǎn)2剛性，結(jié)果又會(huì)怎么樣？若節(jié)點(diǎn)1或節(jié)點(diǎn)2為剛性時(shí)，B1增大，P1增大，P2減小。分3種情況1增加的減少的，P增大2增加的V減少的，P減小3增加的減少的，P不變24、13CMFA原理與方法：利用同位素標(biāo)記底物及NMR或GC-MS（

9、氣相色譜-質(zhì)譜儀）分析胞內(nèi)代謝物的標(biāo)記模式，可對(duì)單一碳原子建立碳平衡方程，從而將輔助因子的平衡方程排除在外。此外，由于有許多單一碳原子平衡方程可供利用，常得到一個(gè)超定系統(tǒng)。這種方程冗余能更加準(zhǔn)確地估算未知通量1）（擬）穩(wěn)態(tài)假設(shè)是MFA的重要前提。代謝穩(wěn)態(tài)和同位素平衡狀態(tài)2）標(biāo)記底物的選擇必須慎重考慮。要合理設(shè)計(jì)標(biāo)記底物組合方式以獲得最大通量信息。3）為降低實(shí)驗(yàn)中底物用量方面的花費(fèi)，生物反應(yīng)器容積應(yīng)盡量小。但反應(yīng)器容積太小系統(tǒng)的穩(wěn)定條件便很難達(dá)到。因此目前使用的生物反應(yīng)器容積通常在300-1000mL。4）在樣品處理方面，對(duì)不同代謝物應(yīng)選擇合適的樣品處理方法以保證化合物結(jié)構(gòu)不被破壞。25、作為運(yùn)

10、載體必須具備哪些條件？1）能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存。2）具多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接。3）具有某些標(biāo)記基因，便于進(jìn)行篩選。如抗菌素的抗性基因、產(chǎn)物具有顏色反應(yīng)的基因等。26、基因操作的基本步驟：1、目的基因的獲取；2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建；3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞；4、目的基因的檢測(cè)與鑒定27、獲取目的基因的常用方法有哪些？（1）從基因文庫(kù)中獲?。?）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增（3）人工合成。目的基因主要是指編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因28、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因概念：PCR全稱(chēng)為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。原理：DNA復(fù)制條件：已知基因的核苷酸序列、

11、四種脫氧核苷酸、一對(duì)引物（做啟動(dòng)子）、DNA聚合酶.前提條件：方式：以指數(shù)方式擴(kuò)增，即2“n（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）結(jié)果：使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬(wàn)倍地?cái)U(kuò)增。29、PCR反應(yīng)的過(guò)程：（高溫）變性、（低溫）退火、（適溫）延伸30、同源重組（英語(yǔ)：Homologousrecombination）是遺傳重組的一種類(lèi)型，指兩股具有相似序列的DNA的重新排列，使遺傳物質(zhì)發(fā)生交換?？砂l(fā)生于自然界中，或應(yīng)用于人工的分子生物學(xué)技術(shù)。31、非同源重組又包括位點(diǎn)專(zhuān)一重組和非常規(guī)重組。32、通過(guò)非基因定向改變的方法包括：定向生物合成、雜交生物合成、突變生物合成，以及生物轉(zhuǎn)化與組合生物轉(zhuǎn)化。論述題1、以大腸桿菌為

12、宿主構(gòu)建乙醇代謝工程生產(chǎn)菌和以釀酒酵母為宿主構(gòu)建乙醇代謝工程生產(chǎn)菌各有什么優(yōu)缺點(diǎn)？大腸桿菌優(yōu)點(diǎn)：（1）底物譜寬，可以在廉價(jià)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，含有木糖代謝基因，可以利用木糖；（2）適合高密度培養(yǎng)，生長(zhǎng)速率快；（3）大腸桿菌的生理和遺傳背景清楚，有利于復(fù)雜遺傳操作。（4）在好氧和無(wú)氧條件下均能產(chǎn)生乙醇。缺點(diǎn)：(1)代謝副產(chǎn)物復(fù)雜，比如產(chǎn)生乙酸等副產(chǎn)物對(duì)產(chǎn)物乙醇的耐受能力低，不利于積累高濃度乙醇。酵母優(yōu)點(diǎn)：厭氧生產(chǎn)乙醇時(shí)，代謝副產(chǎn)物少，對(duì)乙醇的耐受能力高，有利于積累高濃度乙醇。適合高密度培養(yǎng)。缺點(diǎn)：底物譜不夠?qū)挘Ｓ玫尼劸平湍敢约Z食為原料，高產(chǎn)乙醇但是不能利用木糖，也就不能利用自然界中大量存在的木質(zhì)纖維

13、素。即使能發(fā)酵木糖也會(huì)產(chǎn)生副產(chǎn)物。遺傳改造有一定困難：把其它菌的木糖異構(gòu)酶基因?qū)氲结劸平湍福热鏓.coli和B.subtilis的木糖異構(gòu)酶基因，但都沒(méi)有成功，有一定難度。2、已知谷氨酸棒桿菌中色氨酸的生物合成途徑和代謝調(diào)節(jié)機(jī)制如圖3所示。試述色氨酸工程菌株的代謝設(shè)計(jì)策略。DABP莽草酸|L-色氨酸|禺F甲卞靈1.DAHP合成Si2.分支i4.預(yù)苯磁水st對(duì)畫(huà)苯丙酮酸”苯丙酮霞L-廳1酸7L譯內(nèi)孰酸鄰氨基苯甲酸合成st右鄰氨基萃甲孵磁瞬換st工色氨酸合成st反饋抑制|反饋?zhàn)瓒?激活部分蜩圖3谷氨酸棒桿菌中色氨酸生物合成途徑及其代謝調(diào)節(jié)機(jī)制答：(代謝途徑描述：色氨酸屬于芳香族氨基酸，在生物體

14、內(nèi)存在嚴(yán)格的調(diào)控機(jī)制。谷氨酸棒桿菌中色氨酸的生物合成途徑和代謝調(diào)節(jié)機(jī)制如圖所示。在谷氨酸棒桿菌中，葡萄糖經(jīng)EMP途徑和HMP途徑分別生成磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和4-磷酸赤蘚糖(EP),兩者在DAHP合成酶(DS)的催化下生成3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)。DAHP經(jīng)三步酶促反應(yīng)生成莽草酸，莽草酸經(jīng)三步酶促反應(yīng)生成分支酸。由分支酸產(chǎn)生兩個(gè)分支：一方面，在鄰氨基苯甲酸合成酶(AS)催化下合成鄰氨基苯甲酸，鄰氨基苯甲酸在鄰氨基苯甲酸磷酸核糖移換酶(PRT)、色氨酸合成酶(TS)的催化下合成色氨酸；另一方面，分支酸在分支酸變位酶(CM)的催化下生成預(yù)苯酸(PPA)。由預(yù)苯酸又產(chǎn)

15、生兩個(gè)分支：在預(yù)苯酸脫氫酶(PD)的作用下生成對(duì)羥基苯丙酮酸，再生成酪氨酸；在預(yù)苯酸脫水酶(PT)的作用下生成苯丙酮酸，最后合成苯丙氨酸。在分支酸處，傾向于優(yōu)先合成鄰氨基苯甲酸;在預(yù)苯酸處，傾向于優(yōu)先合成對(duì)羥基苯丙酮酸。)(1)加速限速反應(yīng)為了積累更多的色氨酸，必須更多地增加前體物，其中包括減少PEP和EP的支路代謝，解除苯丙氨酸和酪氨酸對(duì)DS的反饋調(diào)節(jié)，增加分支酸的濃度等方法。為了積累更多的PEP，防止丙酮酸生成更多的草酰乙酸，可以選育磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和丙酮酸激酶活力低的菌株或者選育硫辛酸和硫胺素(分別為丙酮酸脫羧酶系和丙酮酸羧化酶系的輔酶)雙重缺陷突變株。將編碼限速酶的基因通過(guò)基因擴(kuò)

16、增，增加拷貝數(shù)并在宿主中表達(dá)以實(shí)現(xiàn)目的產(chǎn)物產(chǎn)率的提高。首先，必須確定代謝途徑中的限速反應(yīng)及其關(guān)鍵酶。然后，將編碼限速酶的基因通過(guò)酶切等手段，制得特定片段，連接在高拷貝數(shù)的載體上再導(dǎo)入宿主中去表達(dá)。編碼色氨酸生物合成途徑中的限速酶的基因有DS酶基因、trpE、trpD、trpC、trpB、trpA等。trpE、trpD、trpC、trpB、trpA這五種結(jié)構(gòu)基因集中在DNA的某一范圍內(nèi)，被同一個(gè)調(diào)節(jié)基因所控制，形成色氨酸操縱子。將與色氨酸合成有關(guān)的基因克隆到質(zhì)粒pDTS9901上，然后導(dǎo)入色氨酸生產(chǎn)菌BPS-13中，在500ml培養(yǎng)基中30C通風(fēng)培養(yǎng)，可產(chǎn)色氨酸35.2g/L(親株產(chǎn)20.1g/

17、L)。研究發(fā)現(xiàn)，如果使大腸桿菌中色氨酸操縱子中的弱化子缺失，則trp基因表達(dá)量可提高六倍，而且無(wú)論是在阻遏細(xì)胞內(nèi)還是在永久性突變的細(xì)胞內(nèi)都是這樣(即無(wú)論trpR+或trpR-)。因此，如果給色氨酸生產(chǎn)菌定向帶上色氨酸弱化子缺失標(biāo)記，必然會(huì)提高色氨酸的產(chǎn)量。(2)改變分支代謝途徑流向提高代謝分支點(diǎn)某一分支代謝途徑的酶活力，使其在與另外的分支代謝途徑的競(jìng)爭(zhēng)中占據(jù)優(yōu)勢(shì)，可以提高目的代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。芳香族氨基酸生物合成中，色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸三條支路上的任何一條支路的酶活性被加強(qiáng)，其與另兩條支路的競(jìng)爭(zhēng)將占據(jù)優(yōu)勢(shì)。通過(guò)同時(shí)加強(qiáng)色氨酸支路代謝流和弱化苯丙氨酸、酪氨酸代謝流，可以實(shí)現(xiàn)色氨酸支路的最大代謝

18、通量。例如，將合成色氨酸的多酶基因與DS基因克隆到谷氨酸棒桿菌(CorynebacteriumglutamicUm中，構(gòu)建出色氨酸工程菌，它促使了Trp支路第一個(gè)產(chǎn)物氨茴酸Ant的生成，并通過(guò)突變解除Trp對(duì)該質(zhì)粒所編碼的Ant合成酶和Ant磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶的反饋抑制，結(jié)果色氨酸產(chǎn)量達(dá)43g/L。若再將苯丙氨酸合成相關(guān)的酶基因如pheA基因敲除，則可使色氨酸產(chǎn)生菌產(chǎn)酸達(dá)50g/L。另外，切斷由分支酸到預(yù)苯酸、VK、CoQ的代謝支路，可節(jié)約碳源，使中間產(chǎn)物分支酸更多地轉(zhuǎn)向合成色氨酸，而且還可以解除苯丙氨酸、酪氨酸對(duì)合成途徑中DS的反饋調(diào)節(jié)，從而有利于色氨酸積累。具體可采用構(gòu)建預(yù)苯酸缺陷、苯丙氨酸缺陷、酪氨酸缺陷、VK缺陷、CoQ缺陷等代謝改造措施。據(jù)報(bào)道，有人以谷氨酸棒桿菌為出發(fā)菌株，經(jīng)代謝改造得到的KY9456(Phe-+Tyr-)菌株可積累L-色氨酸0.15g/L。這個(gè)產(chǎn)量是很低的，由此也可看出只構(gòu)建缺陷型是不夠的，還必須解除由色氨酸引起的反饋調(diào)節(jié)。構(gòu)建AS酶缺陷的回復(fù)突變株，可增加色氨酸的積累。因?yàn)楫?dāng)AS-的突變株發(fā)生回復(fù)突變時(shí)，往