單克隆抗體與基因工程抗體制備技術(shù)

1、第四章單克隆抗體與基因工程抗體制備技術(shù)本章考點(diǎn)1.概念雜交瘤技術(shù)基本原理雜交瘤抗體的制備技術(shù)基因工程抗體由雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)牛的針對(duì)抗原分子上某一單個(gè)抗原決定簇的抗體，稱為單克降抗體。其理化性狀高度均一、生物活性單一、與抗原結(jié)合的特異性強(qiáng)、且來(lái)源容易。傳統(tǒng)的方法是將抗原注入動(dòng)物，由動(dòng)物體內(nèi)B細(xì)胞產(chǎn)生的抗體。由于多數(shù)天然的抗原分子具有多種抗原決定簇，每一種決定簇可激活具有相應(yīng)抗原受體的B細(xì)胞產(chǎn)生針對(duì)某一抗原決定簇的抗體。因此，將抗原注入機(jī)體后，刺激多個(gè)B細(xì)胞克降所產(chǎn)牛的抗體是針對(duì)多種抗原決定簇的混合抗體，故稱為多克降抗體（PoAb）。第一節(jié)雜交瘤技術(shù)基本原理單克隆是指利用在細(xì)胞融合基礎(chǔ)上的B細(xì)胞雜交瘤

2、技術(shù)。雜交瘤技術(shù)的基本原理是通過(guò)融合兩種細(xì)胞而同時(shí)保持兩者的主要特征。這兩種細(xì)胞分別是經(jīng)抗原免疫的小鼠脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞。被特異性抗原免疫的小鼠脾細(xì)胞淋巴細(xì)胞）的主要特征是它的抗體分泌功能，但不能在體外連續(xù)培養(yǎng)，小鼠骨髓瘤細(xì)胞則可在培養(yǎng)條件下無(wú)限分裂、增殖，即具有所謂永生性。在選擇培養(yǎng)基的作用下，只有B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合的雜交細(xì)胞才能具有持續(xù)培養(yǎng)的能力，形成同時(shí)具備抗體分泌功能和保持細(xì)胞永生性兩種特征的細(xì)胞克降。一、B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)細(xì)胞的選擇和融合：雜交瘤技術(shù)的目的是制備對(duì)抗原特異性的單克隆抗體，所以融合一方必須是經(jīng)過(guò)抗原免疫的B細(xì)胞，通常選用被免疫動(dòng)物的脾細(xì)胞，脾淋巴細(xì)胞的主要特征是抗

3、體分泌功能。融合細(xì)胞另一方則要求在培養(yǎng)條件下的永生性，只有腫瘤細(xì)胞才是具備這一條件，所以選擇同一體系的骨髓瘤細(xì)胞,因多發(fā)性骨髓瘤是B細(xì)胞系惡性腫瘤，其特點(diǎn)是穩(wěn)定易培養(yǎng)、自身不分泌免疫球蛋白及細(xì)胞因子、融合率高、是次黃嘌吟磷酸核酸核糖轉(zhuǎn)化酶（HGPRT）的缺陷株，是理想的脾細(xì)胞融合對(duì)象。選擇培養(yǎng)基的應(yīng)用：細(xì)胞融合的選擇培養(yǎng)基中有二種關(guān)鍵成分：次黃嘌吟（H）、氨甲蝶吟（A）、胸腺嘧啶核苷（T）.所以取三者的字頭稱為HAT培養(yǎng)基。次黃嘌吟和胸腺嘧啶核苷是細(xì)胞DNA合成的途徑；氨甲蝶吟（A）是葉酸的拮抗劑，可阻斷瘤細(xì)胞利用正常途徑合成DNA，而融合作用的瘤細(xì)胞是經(jīng)毒性培養(yǎng)基選取出的缺乏HGPRT細(xì)胞株

4、，不能在該培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，只有融合細(xì)胞具有親代雙方遺傳性能，才能在HAT培養(yǎng)基上長(zhǎng)期存活與繁殖。有限稀釋與抗原特異性的選擇：細(xì)胞融合是一個(gè)隨機(jī)的過(guò)程，需在融合細(xì)胞抗體篩選的基礎(chǔ)上進(jìn)行特異性篩選。將融合細(xì)胞進(jìn)行充分稀釋，進(jìn)行克隆化處理，再將陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行再次克隆化，應(yīng)用特異性抗原包被的ELISA找出針對(duì)目標(biāo)抗原的抗體陽(yáng)性細(xì)胞株進(jìn)行增殖，再進(jìn)行冰凍，體外培養(yǎng)或動(dòng)物腹腔接種。圖13雜交瘤技術(shù)操作主要流程示意圖二、T細(xì)胞雜交瘤T細(xì)胞雜交瘤可分為小鼠細(xì)胞雜交瘤和人T細(xì)胞雜交瘤。其基本過(guò)程是將激活的細(xì)胞與酶缺陷型淋巴瘤細(xì)胞融合，通過(guò)有限克隆稀釋，獲得特異性表達(dá)細(xì)胞受體（TCR）或其他功能的雜交瘤細(xì)胞。其主要步

5、驟為：淋巴瘤細(xì)胞系的選擇要求有以下特征：（1）體外能無(wú)限、快速生長(zhǎng)。（2）融合率高。（3）不分泌淋巴因子和殺傷功能。（4）缺乏某一特異性的細(xì)胞表面抗原或受體。（5）HGPRT酶缺陷型。特異性細(xì)胞的制備與活化：主要有可溶性抗原誘導(dǎo)激活的細(xì)胞、同種反應(yīng)性細(xì)胞、人的特異性細(xì)胞等。T細(xì)胞雜交瘤的篩選。三、陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞形成后的初期很不穩(wěn)定，為確保單克隆抗體的專一性及避免其他陰性細(xì)胞對(duì)其生長(zhǎng)影響，必須將陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞分離培養(yǎng)，產(chǎn)生單克隆雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)2一3次檢測(cè)均為陽(yáng)性的雜交瘤單個(gè)細(xì)胞，才能進(jìn)行克隆化培養(yǎng)?？寺』囵B(yǎng)后的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞應(yīng)及時(shí)凍存，最好保存千196C液氮中。

6、第二節(jié)單克隆抗體的制備技術(shù)利用雜交瘤技術(shù)制備McAb基本原理是根據(jù)三個(gè)原則：（1）淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體的克隆選擇學(xué)說(shuō)；（2）雜交瘤細(xì)胞保持雙方親代細(xì)胞特性化；（3）然后大量培養(yǎng)增殖，制備所需的McAb。一、單克隆抗體的產(chǎn)生動(dòng)物體內(nèi)誘生方法：目前McAb治療用或體外診斷用的多數(shù)尚采用這一方法制備。先在小鼠腹腔注射液體石蠟或福氏不完全佐劑，一周后將雜交瘤細(xì)胞懸液注射腹腔，1一2周后，無(wú)菌抽取腹水，離心取上清液即可。體外培養(yǎng)法：這是實(shí)驗(yàn)室制備的方法。將雜交瘤細(xì)胞置培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，待培養(yǎng)液顏色改變或細(xì)胞過(guò)多開始死亡時(shí)，收集上清液，離心去掉碎片及細(xì)胞即可。另一種是雜交瘤細(xì)胞高密度培養(yǎng)法。二、單克隆抗體的純化及

7、鑒定目前常用的純化方法有鹽析、凝膠過(guò)濾、離子交換層析和辛酸提取等方法。單克隆抗體性質(zhì)鑒定方法如放免測(cè)定、補(bǔ)體介導(dǎo)溶血試驗(yàn)、ELISA、免疫酶、玫瑰花結(jié)形成試驗(yàn)等，最常用的為ELISA方法，一般先作定性試驗(yàn)，如陽(yáng)性，進(jìn)一步作定量檢測(cè)。第三節(jié)單克隆抗體醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用單克隆抗體目前全世界已研制成數(shù)以萬(wàn)計(jì)，在生物及醫(yī)學(xué)界有著廣泛用途，在醫(yī)學(xué)中已經(jīng)用于：1作為診斷試劑，用于診斷各類病原體，目前這是McAb應(yīng)用最多的領(lǐng)域之一。腫瘤特異性抗原和相關(guān)抗原的檢測(cè)：用于腫瘤的診斷、分型及定位。檢測(cè)淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志物，用于區(qū)分細(xì)胞亞群和細(xì)胞分化階段。抗原微量成分的檢測(cè)及對(duì)酶類、激素、維生素、藥物等的檢測(cè)。在防治工作中

8、如惡性腫瘤的治療，“生物導(dǎo)彈”的研制等都有廣泛前景。研究工作中用作“探針”，確定大分子生物物質(zhì)在細(xì)胞中的分布及位置。用于抗原物質(zhì)的提取及純化。第四節(jié)基因工程抗體技術(shù)由于雜交瘤單克隆抗體為異源性蛋白，應(yīng)用于人時(shí)易產(chǎn)生抗小鼠抗體，基因工程抗體通過(guò)基因工程技術(shù)改造現(xiàn)有優(yōu)良的鼠單克隆抗體基因。盡量減少抗體中鼠源成分，保留原有抗體特異性，從而創(chuàng)造出一種新型抗體。一、人源化抗體人源化抗體主要指鼠源單克隆抗體以基因克隆及DNA重組技術(shù)改造，重新表達(dá)的抗體，其大部分氨基酸序列為人源序列取代，基本保留親本鼠單克隆抗體的親和力和特異性，又降低了其異源性，有利應(yīng)用于人體。人-鼠嵌合抗體此抗體為通過(guò)基因工程技術(shù)，將人

9、IgGC區(qū)與鼠IgV區(qū)連接，導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)表達(dá)制備而成的抗體?？贵w的表面修飾，使Fv表面人源化。二、小分子抗體此為分子量小，具有抗原結(jié)合功能的分子片段，包括Fab,Fv,單鏈抗體，單區(qū)抗體等。此種抗體分子量小，可在大腸桿菌等原核細(xì)胞表達(dá)，在人體內(nèi)穿透力強(qiáng)，有利于疾病的治療。三、抗體融合蛋白將抗體分子片段與其他蛋白融合，可得到多樣性生物功能的融合蛋白，如：1含F(xiàn)v段的抗體融合蛋白：將Fv與某些毒素、酶、細(xì)胞因子基因拼連，通過(guò)這些抗體的引導(dǎo)，可將其生物活性物質(zhì)導(dǎo)向靶細(xì)胞特定部位，所謂“生物導(dǎo)彈”。2嵌合受體：將ScFv與某些細(xì)胞膜蛋白分子融合，形成的融合蛋白，可表達(dá)于細(xì)胞表面，稱為嵌合受體，由于其介導(dǎo)

10、的殺傷效應(yīng)不受MHC限制，在過(guò)繼性免疫治療中有潛在應(yīng)用價(jià)值。含F(xiàn)c的抗體融合蛋白：CD4分子細(xì)胞膜外部分與Fc融合后由真核細(xì)胞表達(dá)。此融合蛋白能競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合HIV，阻斷HIV對(duì)敏感細(xì)胞的感染；還可介導(dǎo)ADCC及CDC，可通過(guò)胎盤。四、雙特異性抗體雙特異性不同的兩個(gè)小分子抗體連接在一起可得到雙特異性抗體。雙特異性抗體能同時(shí)結(jié)合兩種抗原，因而可介導(dǎo)標(biāo)記物與靶抗原結(jié)合或某些效應(yīng)因子定位于靶細(xì)胞，在免疫學(xué)檢測(cè)中可簡(jiǎn)化操作步驟，提高檢驗(yàn)質(zhì)量；應(yīng)用雙特異性抗體介導(dǎo)的藥物殺傷效應(yīng)可用于腫瘤等的治療。五、抗體庫(kù)技術(shù)抗體庫(kù)技術(shù)是指基因克隆技術(shù)將全套抗體重鏈及輕鏈可變區(qū)基因克隆出來(lái)，重組到質(zhì)粒表達(dá)載體，通過(guò)大腸桿菌直

11、接表達(dá)有功能的抗體分子片段，最后篩選到特異的可變區(qū)基因，現(xiàn)有組合抗體庫(kù)技術(shù)及菌體抗體庫(kù)技術(shù)。習(xí)題26制備單克隆抗體常選用小鼠的哪類細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞A中性粒細(xì)胞K細(xì)胞肥大細(xì)胞成纖維細(xì)胞腹腔細(xì)胞粹答疑編號(hào)500734040101正確答案E習(xí)題27目前實(shí)驗(yàn)室常用的克隆化方法是顯微鏡操作法有限稀釋法軟瓊脂平板法流式細(xì)胞儀篩選法免疫法需答疑編號(hào)500734040102正確答案B答案解析將融合細(xì)胞進(jìn)行充分稀釋，進(jìn)行克隆化處理，再將陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行再次克隆化。習(xí)題28能在HAT培養(yǎng)基生長(zhǎng)繁殖的細(xì)胞是A小鼠脾細(xì)胞小鼠骨髓瘤細(xì)胞飼養(yǎng)細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞免疫活性細(xì)胞需答疑編號(hào)500734040103正確答案D答案解析細(xì)胞融

12、合的選擇培養(yǎng)基中有三種關(guān)鍵成分：次黃嘌吟（H）、氨甲蝶吟（A）、胸腺嘧啶核苷（T），所以取三者的字頭稱為HAT培養(yǎng)基。只有融合細(xì)胞具有親代雙方遺傳性能，才能在HAT培養(yǎng)基上長(zhǎng)期存活與繁殖，而骨髓瘤細(xì)胞是次黃嘌吟磷酸核酸核糖轉(zhuǎn)化酶（HGPRT）的缺陷株，不能生長(zhǎng)。第五章凝集反應(yīng)本章考點(diǎn)1.概述直接凝集反應(yīng)間接凝集反應(yīng)第一節(jié)概述細(xì)菌、紅細(xì)胞等顆?？乖?，或可溶性抗原（或抗體）與載體顆粒結(jié)合成致敏顆粒后，它們與相應(yīng)抗體（或抗原）在適當(dāng)電解質(zhì)存在下，形成肉眼可見的凝集現(xiàn)象，稱凝集反應(yīng)。凝集反應(yīng)分為兩個(gè)階段：抗原抗體的特異性結(jié)合；出現(xiàn)可見的顆粒凝聚。凝集反應(yīng)的特點(diǎn)：凝集試驗(yàn)是一個(gè)定性的檢測(cè)方法，即根據(jù)凝集

13、現(xiàn)象的出現(xiàn)與否判定結(jié)果陰性或陽(yáng)性也可以進(jìn)行半定量檢測(cè)，即將抗體作一系列稀釋，與抗原結(jié)合產(chǎn)生凝集的最高稀釋倍數(shù)作為其效價(jià)或滴度由于凝集反應(yīng)靈敏度高、方法簡(jiǎn)便，因而在臨床檢驗(yàn)中被廣泛應(yīng)用。第二節(jié)直接凝集反應(yīng)直接凝集反應(yīng)：其原理是細(xì)菌、螺旋體和紅細(xì)胞等顆粒性抗原，在適當(dāng)?shù)碾娊赓|(zhì)參與下可直接與相應(yīng)抗體結(jié)合出現(xiàn)凝集，稱直接凝集反應(yīng)。參加凝集反應(yīng)的抗原稱凝集原，抗體則稱為凝集素。從方法上來(lái)講有玻片法和試管法兩類。玻片法凝集主要用于抗原的定性分析，短時(shí)間便能觀察結(jié)果，一般用來(lái)鑒定菌種或分型；也用于人類AB0血型的測(cè)定。試管凝集反應(yīng)是用定量抗原懸液與一系列遞度倍比稀釋的待檢血清混合，保溫靜置后，根據(jù)每管內(nèi)顆粒

14、凝集的程度，以判斷待檢血清中有無(wú)相應(yīng)抗體及其效價(jià)，可以用來(lái)協(xié)助臨床診斷或流行病原調(diào)查研究。例如Wida1反應(yīng)、Well-Felix反應(yīng)、輸血時(shí)也常用于受體和供體兩者間的交叉配血試驗(yàn)。第三節(jié)間接凝集反應(yīng)間接凝集反應(yīng)是將可溶性抗原（或抗體）先吸附于適當(dāng)大小的顆粒載體表面，然后與相應(yīng)抗體（或抗原）作用，在適宜電解質(zhì)存在的條件下，出現(xiàn)特異性凝集現(xiàn)象，稱間接凝集反應(yīng)。根據(jù)致敏載體用的是抗原或抗體以及凝集反應(yīng)的方式，間接凝集反應(yīng)分為4類：正向間接凝集反應(yīng)；反向間接凝集反應(yīng)；間接凝集抑制反應(yīng)；協(xié)同凝集反應(yīng)。圖14（正向）間接凝集反應(yīng)（查抗體）拔佯雀Si圖15（反向）間接凝集反應(yīng)（查抗原）拉怎益十頓程臨:賈首

15、*0疥圖16間接凝集抑制試驗(yàn)（查抗原）（上圖為標(biāo)本中含有待測(cè)抗原，下圖為標(biāo)本中無(wú)待測(cè)抗原，注意凝集說(shuō)明標(biāo)本中沒(méi)有待測(cè)抗原）間接凝集反應(yīng)適用于各種抗體和可溶性抗原的檢測(cè)。以載體來(lái)分，常用的為紅細(xì)胞、膠乳顆粒及明膠顆粒等。常用的試驗(yàn)有：間接血凝試驗(yàn)：其原理是將抗原（或）抗體包被于紅細(xì)胞表面，成為致敏載體，然后與相應(yīng)的抗體（或抗原）結(jié)合，從而使紅細(xì)胞被動(dòng)地凝聚在一起，出現(xiàn)可見的凝集現(xiàn)象。間接血凝試驗(yàn)可分為三類：紅細(xì)胞包被抗原，用以檢測(cè)抗體的血凝，稱為正向間接血凝反應(yīng)（PHA）;紅細(xì)胞包被抗體，用以檢測(cè)抗原的血凝反應(yīng)，稱為反向間接血凝反應(yīng)（RPHA）;先將可溶性抗原（或抗體）與相應(yīng)的抗體（或抗原）混合

16、然后再加入抗原（或抗體）致敏的紅細(xì)胞，則能抑制原先的血凝現(xiàn)象稱為正向（或反向）間接血凝抑制試驗(yàn)。間接血凝抑制試驗(yàn)可用于檢測(cè)抗體、自身抗體、變態(tài)反應(yīng)性抗體也可測(cè)定抗原。間接血凝試驗(yàn)：紅細(xì)胞沉積于管底；1+：紅細(xì)胞沉積于管底，周圍有散在少量凝集；2+：紅細(xì)胞形成片層凝集，面積較小，邊緣較松散；3+：紅細(xì)胞形成片層凝集，面積多于2+；4+：紅細(xì)胞形成片層凝集，均勻布滿孔底，或邊緣皺縮如花邊狀。膠乳凝集試驗(yàn)：膠乳凝集試驗(yàn)也是一種間接凝集試驗(yàn)，所用載體為聚苯乙烯膠乳，是一種直徑約為0.8“m大小的圓形顆粒，帶有負(fù)電荷，可物理性吸附蛋白分子，但這種結(jié)合牢固性差。膠乳凝集試驗(yàn)分試管法和玻片法兩種。膠乳凝集試

17、驗(yàn)用于檢測(cè)抗溶血素0、RF等。明膠凝集試驗(yàn)：將全病毒抗原及重組抗原吸附在粉紅色明膠顆粒上，來(lái)檢測(cè)相應(yīng)抗體。間接凝集反應(yīng)具有快速、敏感、操作簡(jiǎn)便、無(wú)需特殊的實(shí)驗(yàn)設(shè)備等特點(diǎn)，而且能用于抗原或抗體的測(cè)定，因此在臨床檢驗(yàn)中廣為應(yīng)用。（1）抗原的檢測(cè)：反向間接凝集試驗(yàn)用于檢測(cè)病原體可溶性抗原，也可用于檢測(cè)各種蛋白質(zhì)成分。（2）抗體的檢測(cè)：可用于檢測(cè)細(xì)菌、病毒和寄生蟲等感染后產(chǎn)生的抗體，例如間接凝集試驗(yàn)或明膠顆粒凝集試驗(yàn)用于檢測(cè)抗人類免疫缺陷病毒（HIV）抗體以診斷艾滋病、乳膠凝集試驗(yàn)用于檢測(cè)抗溶血素O等。第四節(jié)自身紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)其基本原理是抗人0型紅細(xì)胞的單克隆抗體能與任何種血型的紅細(xì)胞結(jié)合，但不引起凝

18、集反應(yīng)，這種抗體與另一特異性抗體連接成的雙功能抗體，可用于檢測(cè)標(biāo)本中的抗原；如與特異性抗原連接，則可用于檢測(cè)標(biāo)本中的抗體。這一試驗(yàn)與上述血凝試驗(yàn)的區(qū)別在于反應(yīng)中的紅細(xì)胞是未經(jīng)致敏的受檢者新鮮紅細(xì)胞，因此反應(yīng)中的標(biāo)本為受檢者的全血。自身紅細(xì)胞凝集可用于HIV抗體、HBsAg的檢測(cè)，靈敏度與間接血凝試驗(yàn)相仿。第五節(jié)抗人球蛋白參與的血凝試驗(yàn)抗人球蛋白參與的血凝試驗(yàn)，稱Coombs試驗(yàn)，是檢測(cè)抗紅細(xì)胞不完全抗體的一種很有用的方法。包括直接Coombs試驗(yàn)和間接Coombs試驗(yàn)，分別檢測(cè)紅細(xì)胞上的不完全抗體和游離在血清中的不完全抗體。Coombs試驗(yàn)除廣泛應(yīng)用于血液病的檢測(cè)，如自身免疫性溶血性貧血、藥物

19、誘導(dǎo)的溶血、新生兒溶血癥等。還可采用專一特異性的抗球蛋白的血清如抗IgG血清、抗IgA或抗IgM以及抗補(bǔ)體血清等，分析結(jié)合于紅細(xì)胞上的不完全抗體的免疫球蛋白亞類。不堂金拭律it球査白憂佯嗦聘鯨圖18Coombs試驗(yàn)（上圖為直接試驗(yàn)，下圖為間接試驗(yàn)）習(xí)題29ABO血型鑒定最常采用的方法是A正向間接凝集反應(yīng)B反向間接凝集反應(yīng)玻片凝集法試管凝集法E間接凝集抑制反應(yīng)粹答疑編號(hào)500734050101正確答案C（屬于直接凝集反應(yīng)）習(xí)題30外裴試驗(yàn)最常采用的方法是A正向間接凝集反應(yīng)B反向間接凝集反應(yīng)玻片凝集反應(yīng)試管凝集法E間接凝集抑制反應(yīng)粹答疑編號(hào)500734050102正確答案D習(xí)題31SPA協(xié)同凝集試驗(yàn)中的抗體類別是IgMIgGIgAIgEIgD需答疑編號(hào)50073