酯酶知識(shí)學(xué)習(xí)培訓(xùn)課件

1、第4章 酯 酶4.1酯酶的定義、來源及分類 RORH2O RHROH 酯 酸醇甘油三酯H2O甘油二酯（或甘油一酯 或甘油）脂肪酸酯酶和脂酶同義嗎？酶？酶酯酶（esterase）催化酯類中酯鍵裂解的酶類，反應(yīng)可逆。水解時(shí)，產(chǎn)物為酸和醇類；合成時(shí)，把酸的羥基與醇的醇羥基縮合并脫水，產(chǎn)物為酯類及其它香味物質(zhì)。RORH2O RHROH 酯 酸醇脂酶(Lipase，EC 3.1.1.3)甘油酯水解酶，脂肪酶，是酯酶中的一類，催化甘油三酯水解生成甘油二酯或甘油一酯或甘油。甘油三酯H2O甘油二酯（或甘油 一酯或甘油）脂肪酸酯酶分布和來源酯酶廣泛分布于植物、動(dòng)物和微生物動(dòng)物胰臟酯酶和微生物酯酶是主要來源。主要

2、是真菌，12屬233種，其次是細(xì)菌。酯酶已經(jīng)實(shí)現(xiàn)商品化，在食品、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域起著重要作用。羧基酯類（E.C.3.1.1）磷酸單酯（E.C.3.1.3）磷酸二酯（E.C.3.1.4）三磷酸單酯（E.C.3.1.5）硫酸酯（E.C.3.1.6）硫酯（E.C.3.1.6）酯酶脂酶羧酸酯（EC3.1.1.1)芳基酯(EC3.1.1.2)乙酸酯(EC3.1.1.6)甘油酯(EC3.1.1.3)葉綠素酶(EC3.1.1.14)果膠酯酶(EC3.1.1.11)乙酰膽堿酯酶(EC3.1.1.7)磷脂酶磷脂酶A (EC3.1.1.4)磷脂酶B(EC3.1.1.5)種類4.1.2酯酶的分類（E.C.3.1）常

3、見類型依據(jù)酶對(duì)底物的特性分為非特異性和特異性酯水解酶非特異性酶羧酸酯水解酶作為以脂肪族和芳香族醇的羧酸酯為底物的酶可以作用于乙酸乙酯、丁酸乙酯、甘油三丁酸酯、乙酸苯酯；乙酸酯水解酶是以乙酸脂為底物的酶可以作用于乙酸乙酯和乙酸苯脂 特異性酯酶分為醇特異性和酸特異性醇可以是一元醇或多元醇、脂肪族醇或芳香族醇；酸可以是有機(jī)酸或無機(jī)酸。如羧酸酯水解酶中有磷脂酶、葉綠素酶、乙酰膽堿酯酶、果膠酯酶等。 特異性脂酶?；视蛯Ｒ恍詢?yōu)先水解相對(duì)分子質(zhì)量不同的三?；视?。位置專一性酶包括1,3位置專一、和單一位置專一性酶。 脂肪酸專一性在水解一類脂肪酸形成的酯鍵時(shí)比另一類脂肪酸形成的酯鍵來得快。立體異構(gòu)專一性 4

4、.2酯酶的催化特性4.2.1酯化作用中酯酶的催化特性非極性溶劑適合于酯化合成，控制酯化系統(tǒng)中的水含量，有利于向合成方向進(jìn)行。及時(shí)移出反應(yīng)產(chǎn)物可促進(jìn)酯化反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行酶的非水相催化酶的固定化例如，在甘油單酯的生產(chǎn)過程中，利用固定化酶膜反應(yīng)器技術(shù)和吸附柱回收體系中的單?；视?，產(chǎn)率可達(dá)90%以上，膜反應(yīng)器若連續(xù)生產(chǎn)，每克酶可生產(chǎn)15kg的甘油單酯。4.2.2脂酶的催化特性脂酶的天然底物是不溶于水的，脂酶作為水解酶能作用于乳化的脂肪球100ml甘油三油酸酯乳狀液中界面面積1052胰脂酶作用于不溶解的甘油三酯時(shí)，酶活力和乳化液界面面積的關(guān)系B甘油三丁酯O甘油三油酸酯脂酶活力的測(cè)定最適pH和最適溫度隨底物

5、、脂酶的純度、緩沖液和測(cè)定的方法不同而稍有改變。大多數(shù)脂酶的最適pH在堿性范圍，即pH89，如胰脂酶的最適pH為89，但是也有一些脂酶具有酸性的最適pH。不同的微生物脂酶的最適pH存在著很大的差異，它們的范圍為5.68.5。 1972年從土壤中分離篩選出我國第一株堿性脂肪酶產(chǎn)生菌并首創(chuàng)了維多利亞藍(lán)快速平板鑒別法分離到堿性脂肪酶野生型菌株 維多利亞藍(lán)快速平板鑒別法（初篩）維多利亞藍(lán)加入培養(yǎng)基，調(diào)pH，取各種試樣在瓊脂平板上涂布培養(yǎng)，如在其周圍產(chǎn)生藍(lán)綠色圈者，表明脂肪被水解成脂肪酸。酶活性測(cè)定方法（復(fù)篩）橄欖油乳化液，pH9.4，37C水浴，反應(yīng)一定時(shí)間，用NaOH進(jìn)行電位滴定酶活單位定義：每分鐘

6、釋放出游離的一微克分子的脂肪酸所需的酶量為一個(gè)活力單位U。采用對(duì)硝基棕櫚酸脂(pNPP)法 ：Experiments were carried out in a volume of 5ml containing 10 mM pNPP and 1M ethanol in n-heptane, and then 25l samples lipase for 5min at 40C . Liberation of pNP （硝基苯酚） was detected using a common spectrophotometer and detected at 410nm after extractin

7、g aliquots of sample from the reaction medium with 1ml of 0.1M NaOH solution.乙酰膽堿酯酶的催化特性乙酰膽堿酯酶（acetylcholine esterase，EC 3.1.1.7）存在于所有動(dòng)物的神經(jīng)組織中，它催化下列反應(yīng)： （CH3)3N+CH2CH2OCOCH3H2O (CH3)3N+CH2CH2OHCH3COOH+乙酰膽堿酯酶在將神經(jīng)脈沖從神經(jīng)細(xì)胞傳遞至運(yùn)動(dòng)肌神經(jīng)原后立即發(fā)生此反應(yīng)。一些有機(jī)磷化合物、氨基甲酸酯和許多其他化合物對(duì)乙酰膽堿酯酶具有不可逆的抑制作用，因此，這些化合物是有毒的，這也是它們殺滅昆蟲的機(jī)制

8、。果膠酯酶的催化特性果膠酯酶（Pectinesterase，PE, EC3.1.1.11）存在于高等植物組織中，真菌、酵母、細(xì)菌中也產(chǎn)生。 對(duì)半乳糖醛酸甲酯具有高度專一性催化果膠脫酯，生成果膠酸，與鈣離子橋連，形成凝膠，提高果實(shí)的硬度。蘋果酒生產(chǎn)工藝4.3酯酶的應(yīng)用現(xiàn)狀及前景4.3.1 催化合成芳香酯4.3.2催化合成單甘酯4.3.3催化合成糖酯4.3.4催化合成磷脂4.3.5三酰甘油的改性4.3.6在提取維生素E中的應(yīng)用4.3.7在食用油脂精煉中的應(yīng)用4.3.8在功能性油脂分離和純化中的應(yīng)用4.3.9在面制品中的應(yīng)用4.4.1催化合成芳香酯低分子量芳香酯是一類重要的芳香化合物，多呈天然水果香

9、味，它們廣泛應(yīng)用于食品、飲料等食品工業(yè)中。酶法生產(chǎn)被看成很有希望工業(yè)化生產(chǎn)芳香酯類的途徑。商業(yè)上重要的低分子量酯可以在無水有機(jī)溶劑中或無溶劑環(huán)境中經(jīng)過轉(zhuǎn)酯生產(chǎn)，也可以由酸與醇直接酯化合成。固定化脂肪酶現(xiàn)已用于芳香酯的合成。生產(chǎn)多種脂肪族和芳香族香味酯，如乙酸乙酯、丁酸異戊酯、癸酸異戊酯、乙酸香葉酯 、月桂酸丁酯、安息香酸甲酯等。美國把乳脂或黃油乳化后加酯酶保溫催化，釋放出脂肪酸，獲得的酯化香味液比黃油的香味高150倍。意大利在利用酯酶使干酪增香獲得成功國外利用酯酶把乙醇和酪酸進(jìn)行酯化，獲得具有特殊芳香味的酪酸酯。日本利用酯酶合成具有濃郁香味的甘油酯等酯類我國利用酯酶，提高濃香型曲酒中的已酸乙酯

10、、乙酸乙酯、乳酸乙酯和丁酸乙酯等四大酯的含量，應(yīng)用此技術(shù)后，優(yōu)級(jí)率提高10.18%。利用酯酶提高食醋的風(fēng)味，特別是提高食醋中乙酸乙酯和乳酸乙酯等酯類的含量，效果較為明顯，一般乙酸乙酯提高5%10%。乳酸乙酯提高3%8%，口感有明顯地提高。利用脂肪酶和酯酶增香 甘肅渭水酒業(yè)集團(tuán) 2003 年利用酯酶增香技術(shù)，已生產(chǎn)出己酸乙酯生物合成酯香液， 合成酯香液的己酸乙酯含量以 100mL酯香液中酯含量計(jì), 酯化 10d 生酯量為 1080mg，30d 為 2370mg，60d 為 4180mg，90d 達(dá)到 7230mg 水平。生產(chǎn)的酯香液已用于成品酒（中低檔酒）的勾調(diào)，明顯好于外購香料。主要優(yōu)點(diǎn)是酒體

11、自然感強(qiáng)、綿甜、主體香突出。4.4.2催化合成單甘酯 單甘酯是世界上用量最大的食品乳化劑工業(yè)上主要使用堿催化法將油脂甘油水解（200260，30min），由于高溫對(duì)不飽和成分是不適合的，酶法生產(chǎn)單甘酯或雙甘酯已被廣泛研究。 酶法生產(chǎn)單甘酯的方法甘油與酸、烷基酯相互作用發(fā)生直接酯化或轉(zhuǎn)酯化。利用甘油和油酸或油酸乙酯生產(chǎn)單油酸甘油酯；三酰甘油部分醇解和甘油解；利用三棕櫚酰甘油酯生產(chǎn)單棕櫚酰甘油酯。利用單甘酯較其他甘油酯熔點(diǎn)高，選擇適宜的反應(yīng)溫度，使單甘酯從反應(yīng)體系中析出而大大提高產(chǎn)量；在動(dòng)物脂、棕櫚油、大豆油、菜子油、等均有報(bào)道。 4.4.3催化合成糖酯用單糖或雙糖代替甘油制備類脂分子，酰基化的糖

12、不僅具有特有的營養(yǎng)特性，并為可作為良好的表面活性劑。糖酯可以作煎炸油，也可作為一些產(chǎn)品如冰淇淋、人造奶油、奶酪和焙烤食品的脂肪代用品，其無毒、無味、無刺激性、無致癌變作用，因很難吸收，提供的能量幾乎等于零。谷物中存在半乳糖二?；视驼伎傰チ康?5，面包的焙烤有用催化合成糖酯的方法特異的脂肪酶可通過催化糖或糖醇與脂肪酸或酯反應(yīng)生產(chǎn)糖酯。如利用甲基葡萄糖苷及烷基葡萄糖苷與油酰甲酯之間的酯化反應(yīng)生產(chǎn)葡萄糖酯時(shí)，為得到乳化效果最好的單酰糖酯，利用脂肪酶的位置選擇性阻斷叔羥基而使伯羥基與脂肪酸反應(yīng)生成蔗糖單酯。針對(duì)糖在有機(jī)溶劑中溶解度低、產(chǎn)率低等缺點(diǎn)，固體反應(yīng)底物可大大提高糖酯合成比例；4.4.4 催化

13、合成磷脂溶血磷脂具有重要的生理功能，并被作為良好的乳化劑廣泛用于食品、醫(yī)藥和化妝品中。溶血磷脂的脂肪酸，可經(jīng)酶促合成方法轉(zhuǎn)到溶血磷脂中。一般是利用sn-1、sn-3位置專一性脂肪酶通過醇解和轉(zhuǎn)酯方式合成溶血磷脂，其中將長鏈多不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)入溶血磷脂中。磷脂酶用來將魚油中的多不飽和脂肪酸摻入磷脂中，改善其營養(yǎng)價(jià)值。4.4.5 三酰甘油的改性天然存在的油脂因具有鏈長、飽和度不同的脂肪酸而具有不同的物理、化學(xué)性質(zhì)和營養(yǎng)特性，產(chǎn)量與儲(chǔ)藏穩(wěn)定性也不盡相同。為獲得具有特定物理和化學(xué)性質(zhì)的油脂，更好地提高油脂的營養(yǎng)、穩(wěn)定性，提高產(chǎn)品品質(zhì)，需要對(duì)天然油脂進(jìn)行改性以提高其使用價(jià)值。目前油脂改性以化學(xué)改性為主，但

14、隨著非水介質(zhì)脂肪酶催化反應(yīng)研究的不斷深入，脂肪酶催化的油脂改性已被廣泛研究，并在一些生產(chǎn)中得到應(yīng)用。 4.4.5.1 結(jié)構(gòu)化脂質(zhì)的生產(chǎn)結(jié)構(gòu)脂質(zhì)由于特定結(jié)構(gòu)而具有功能性的三酰甘油。如sn-1位和sn-3位上是短中鏈?；娜ｕ?，易被胰脂肪酶水解成sn-2甘酰酯和中鏈脂肪酸，sn-2甘酰酯在腸中可被吸收而短中鏈脂肪酸可快速分解供應(yīng)能量；具有二個(gè)中鏈（C8C12）、一個(gè)長鏈的三甘酯，特別是MLM三甘酯，其長鏈?；挥趕n2位上是近期倍受關(guān)注的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)。結(jié)構(gòu)酯質(zhì)的生產(chǎn)如多不飽和脂肪酸（PUFA）對(duì)心血管疾病有較好的療效，降低糖尿病、高血壓和癌癥的發(fā)病率，增加免疫力，促進(jìn)兒童神經(jīng)發(fā)育。而長鏈PUBA的吸

15、收有一定困難，且二十二碳六烯酸（DHA）和二十碳五烯酸（EPA）對(duì)消化道有一定的刺激作用，以天然脂類化合物形式富集PUFA，促進(jìn)PUFA的吸收具有應(yīng)用意義。強(qiáng)化PUFA的方法很多，非水相脂肪酶催化的方法包括以下幾種： （1）脂肪酶催化酯化反應(yīng)脂肪酶催化PUFA與甘油之間發(fā)生酯化反應(yīng)，生成單甘酯（14%，含27%EPA和50%DHA），雙甘酯（43%，含25%EPA和50%DHA）和三甘酯（37%，含25%EPA和50%DHA）。 （2）脂肪酶催化轉(zhuǎn)酯反應(yīng)植物油、魚油和其他油與富含PUFA的脂肪酸、?；グl(fā)生轉(zhuǎn)酯反應(yīng)，將EPA或DHA、g-亞油酸等整合到幾種植物油（低介酸菜子油、花生油、高油酸向

16、日葵油、大豆油，玻璃苣油），三辛酰甘酯和三癸酰甘酯等中，也可部分水解后再酰化來提高天然魚油中PUFA含量。利用1,3位置專一性酶，可將EPA整合到短鏈和中鏈三甘酰中，催化生產(chǎn)富含PUFA的結(jié)構(gòu)化脂質(zhì)。 （3）將PUFA富集于膽甾醇和磷脂中有人利用選擇性脂肪酶將沙丁魚油和自由脂肪酸中的DHA、EPA通過酯化反應(yīng)富集于膽固醇中。還有人把多種甾醇有效地與 EPA、g-亞油酸等多種PUFA合成甾醇酯，促進(jìn)PUFA的穩(wěn)定性。應(yīng)用實(shí)例豬油的脂肪酸結(jié)構(gòu)與人乳脂有一點(diǎn)相似，即棕櫚酸主要分布在sn-2位，但豬油的硬脂酸含量過高，影響其熔點(diǎn)和嬰兒的吸收；必需脂肪酸含量過低，特別是亞麻酸，且不符合亞油酸與亞麻酸之間

17、的平衡比(515)；不含DHA等。采用1,3位催化專一性脂肪酶作催化劑，以適當(dāng)配比的游離脂肪酸為?；w，改變豬油的1,3位脂肪酸組成來合成結(jié)構(gòu)與人乳脂相似的脂肪。獲得較為滿意的結(jié)果。 在面條專用粉中，可減少面團(tuán)上出現(xiàn)斑點(diǎn)，改善面帶壓片或通心粉擠出過程中顏色的穩(wěn)定性。同時(shí)還可以提高面條或通心粉的咬勁，使面條在水煮過程中不粘連、不易斷，表面光亮滑爽。這是因?yàn)橹久缚稍黾用鎴F(tuán)晶體結(jié)構(gòu)的熱穩(wěn)定性。因此若過量使用會(huì)使布置變得太硬，產(chǎn)生相反效果。4.4.5.2人造奶油的生產(chǎn)工業(yè)人造奶油的生產(chǎn)主要是在堿性催化劑作用下，通過酯交換，部分增加飽和脂肪酸的量，從而使油脂具有特定的熔融特性。但化學(xué)方法反應(yīng)溫度高于

18、100，需要真空或充氮以防止脂肪氧化，脂肪酶可在相對(duì)溫和的條件下催化油脂間的轉(zhuǎn)酯或酯交換，從而獲得質(zhì)量較好的人造奶油。4.4.5.3 類可可脂的生產(chǎn)可可脂是最貴重的油脂之一，具有入口即化的熔融特性，是加工巧克力的重要原料，價(jià)格十分昂貴。運(yùn)用酯交換技術(shù)可以生產(chǎn)出可可脂的類似物，傳統(tǒng)酯交換工藝采用的是化學(xué)方法，常用的催化劑是金屬鈉或氫氧化鈉、無機(jī)酸等，會(huì)造成反應(yīng)體系中?；g的交換與分布的隨機(jī)性，致使副產(chǎn)品增多。使用1,3-定向脂肪酶作為催化劑，?；倪w移與交換則限制在1-位和3-位上，這樣就能生產(chǎn)出化學(xué)法酯交換所無法得到的特定目標(biāo)產(chǎn)物?，F(xiàn)以棕櫚油中間分提物、烏桕脂、茶油等原料，通過酯交換改性技術(shù)生

19、產(chǎn)類可可脂的研究取得了很大的進(jìn)展。4.4.6在提取維生素E中的應(yīng)用植物油脫臭餾分是提取天然維生素E的方法，但其中甘油酯的存在會(huì)給后續(xù)的高真空蒸餾或分子蒸餾帶來困難，影響甾醇的結(jié)晶分離和產(chǎn)品質(zhì)量。國內(nèi)外一般多采用皂化法和酯交換法來分解并除去甘油酯，然而，皂化是在堿性環(huán)境中進(jìn)行的，酯交換也需加堿催化，維生素E在強(qiáng)堿性條件下易氧化分解，提取率很低。利用脂肪酶催化油脂水解反應(yīng)來分解其中的甘油酯，則是一種簡捷而又經(jīng)濟(jì)的方法。 4.4.7在食用油脂精煉中的應(yīng)用在食用油脂精煉工藝中，通常采用的脫酸方法是向油中加入堿以中和油中的游離脂肪酸。而在堿煉過程中總是不可避免地要造成中性油、甾醇、生育酚等的損失。近10

20、年來，借助脂肪酶在一定條件下能催化脂肪酸與甘油間的酯化反應(yīng)，從而把油中的大量游離脂肪酸轉(zhuǎn)變成中性甘油酯。生物精煉技術(shù)已應(yīng)用于高酸值油脂的脫酸。含多不飽和脂肪酸油脂例如含有二十二碳六烯酸(22：6n-3;DHA)的金槍魚油和含有C-亞麻酸(18：3n-6GLA)的琉璃苣油已經(jīng)應(yīng)用于功能性食品和嬰兒食品配料中。含有花生四烯酸(AA)單細(xì)胞油也已經(jīng)用于嬰兒食品配料中。這對(duì)此類脂肪酸產(chǎn)品開發(fā)與品質(zhì)提出了更高的要求,它們的純化方法研究已經(jīng)成為亟需解決的問題。目前,工業(yè)上采用蒸餾和脲包法純化二十碳五烯酸乙酯。采用蒸餾、脲包、高壓液相色譜或銀離子交換色譜技術(shù)可以對(duì)DHA和GLA進(jìn)行純化,但此工藝由于其生產(chǎn)成

21、本過高而無法實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。因此,更多的研究者轉(zhuǎn)向酶反應(yīng)技術(shù)的研究。4.4.8功能性油脂分離和純化利用酶對(duì)多不飽和脂肪酸的反應(yīng)活性較弱這個(gè)性質(zhì)，可以富集魚油水解后甘油酯相中的多不飽和脂肪酸，包括EPA和DHA。通過酶水解琉璃苣油可以獲得富含GLA（亞麻酸）的油，同樣采用這種酶對(duì)含有花生四烯酸的單細(xì)胞油進(jìn)行水解也可獲得富含花生四烯酸的油。但很難使其含量超過70%，這主要是因?yàn)槊笇?duì)多不飽和脂肪酸酯鍵也有一定的水解能力。發(fā)現(xiàn)酯化過程中酶對(duì)脂肪酸的專一性要比在水解過程更明顯，利用這個(gè)性質(zhì)，成功地使GLA在脂肪酸中的含量提高到85%，回收率為64% 。選擇性酯化純化多不飽和脂肪酸(PUFA)第一步可用堿性