纖維素酶活力的測定

1、生物產(chǎn)品檢驗技術(shù)課程羊元教學(xué)設(shè)計卡一、教案頭課程單元纖維素酶活力的測定授課對象生物技術(shù)專業(yè)單元學(xué)時2授課教師授課地點.授課時間.教 學(xué) 目 標(biāo)能力（技能）目標(biāo)知識目標(biāo)素質(zhì)目標(biāo)掌握紫外分光光 度法測定的纖維素酶 活力的操作流程；掌握酶液、底物母 液、緩沖液的配制方 法；熟練分光光度計的 使用方法；能夠精確完成葡萄 糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制；酶活力的計算。掌握CMC法測定纖維 素酶活力的原理；掌握CMC法測定纖維 素酶活力的方法；養(yǎng)成認真主動學(xué)習(xí)的 習(xí)慣；能掌握常用儀器的使 用和保養(yǎng)方法；養(yǎng)成完成實訓(xùn)后及時 整理實訓(xùn)場所的良好職 業(yè)素養(yǎng)；養(yǎng)成良好的團隊合作 精神。能力訓(xùn) 練任務(wù)CMC法測定纖維素酶活力實訓(xùn)教

2、 學(xué) 重 點 與 難 點重點難點CMC法測定纖維素酶活力的操作 流程；酶活力的計算方法。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。各種試液配制；教 學(xué) 內(nèi)任務(wù)一纖維素酶的性質(zhì)纖維素酶的生產(chǎn)流程任務(wù)二CMC法測定纖維素酶活力的實驗原理CMC法測定纖維素酶活力的操作流程CMC法測定纖維素酶活力的操作要點酶活力的計算教 學(xué) 設(shè) 計 與 組 織過程設(shè)計導(dǎo)入新課通過闡述纖維素酶是一種重要復(fù)合酶，主要由外切B-葡聚糖 盟、內(nèi)切葡聚糖酶和(3-葡萄糖昔酶等組成，還有很高活力的木 聚糖酶活力。纖維素酶反應(yīng)和一般酶反應(yīng)不一樣,其最主要的區(qū)別在于纖 維素酶是多組分酶系，且底物結(jié)構(gòu)極其復(fù)雜。由于底物的水不溶性，纖維素酶的吸附作用代替了酶

3、與底物 形成的ES復(fù)合物過程。纖維素酶先特異性地吸附在底物纖維素 上，然后在幾種組分的協(xié)同作用下將纖維素分解成葡萄糖。酶作用的最適溫度為4050C,最適pH在4.06.0.常見的激活劑有：氟化鈉、Mg2+、氯化鉆、Ca2+、磷酸鈣等,纖維素酶在飼料、酒精、紡織和食品等領(lǐng)域具有巨大的市場 潛力。提出其活力測定的重要性。生產(chǎn)纖維素酶的微生物菌種較多的是有細菌、放線菌、真菌 等，其中酶活力較強的菌種為木霉屬(Trichoderma)、曲霉屬CAs pergillus)和青霉屬(Penic/inm),特別是綠色木霉(Trichoder mavirde)及其近緣菌株等較為典型，是目前公認的較好的纖維 素

4、酶生產(chǎn)菌?，F(xiàn)已制成制劑的有綠色木霉、黑曲霉、鐮刀霉等纖 維素酶。同時，反芻動物依靠瘤胃微生物可消化纖維素，因此可 以利用瘤胃液獲得纖維酶的粗酶制劑。另外，也可利用組織培養(yǎng) 法獲得所需要的微生物。纖維素酶的生產(chǎn)流程？時間5min.lOmin5minlOmin種子培羔纖維素酶液體發(fā)酵法工藝流程CMC酶活力法測定纖維素酶活力的實驗原理纖維素酶水解梭甲基纖維素鈉產(chǎn)生還原糖，還原糖能將3, 5- 二硝基水楊酸(DNS)還原，生成橙黃色的氨基化合物，在540nm 波長處有最大光吸收，在一定范圍內(nèi)還原糖的量與反應(yīng)液的顏色 強度呈比例關(guān)系，利用比色法測定其還原糖生成的量就可測定纖 維素酶的活力。材料與用具材料

5、商品纖維素酶。試劑3, 5-二硝基水楊酸顯色劑(又稱DNS試劑):稱取10 g 3, 5- 二硝基水楊酸，溶于蒸餡水中，加入20 g分析純NaOH, 200 g酒 石酸鉀鈉，加水500 ml,升溫溶解后，加入重蒸酚2 g,無水亞 硫酸鈉0.5g,加熱攪拌，待全部溶解后，冷卻，定容至1 000 ml。 貯存于棕色瓶中，室溫保存，放置一周后使用。0. 1 mol/LpH4. 6醋酸-醋酸鈉緩沖液：稱取結(jié)晶醋酸鈉 (CH3C00Na. 3H20)13. 61 g,醋酸(CH3C00H)6. 00 g,用蒸餡水溶 解，并定容至1 000 ml,配好后用pH計校正。lOmin1 mg/ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液

6、:準(zhǔn)確稱取100 mg分析純葡萄糖(預(yù) 先在70C、600 mm汞柱下干燥5 h至恒重)，用少量蒸餡水溶解 并定容至100 ml,冰箱中保存?zhèn)溆?。底物?.5%舞甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液，配制方為稱取 0. 500 0 g手及甲基纖維素鈉(Sigma公司生產(chǎn))，準(zhǔn)確至0. 001 g, 用上述緩沖溶液溶解并定容至100 ml,冰箱中保存，有效期3d。待測酶液：稱取酶粉1.0 g(或吸取液體酶1.00 ml),先用 少量的0. 05 mol/L pH 4. 5醋酸-醋酸鈉緩沖液溶解，并用玻璃棒 搗研，然后將上清液小心傾入適當(dāng)?shù)娜萘科恐?，沉渣部分再加?量上述緩沖液溶解，如此反復(fù)搗研34次

7、，最后全部移入容量瓶 中，用緩沖液定容至刻度，40C水浴鍋中浸提1 h,用四層紗布或脫脂棉過濾，濾液供測定用。3）器具分析天平、變溫電爐、恒溫水浴鍋、分光光度計、秒表等。（五）CMC酶活力法測定纖維素酶活力的操作流程（六）操作要點（1）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線取 Img / ml 葡萄糖液 0. 2, 0. 4, 0. 6, 0. 8, 1. 0, 1. 2,1.4 ml于7支試管中，再分別加蒸偏水至2.0 ml。向各管加3, 5-30minlOmin5min二硝基水楊酸1.5ml,置沸水浴煮沸5 min,冷卻后用蒸餡水定容 至20ml,搖勻。以2ml蒸餡水加DNS溶液1.5ml,按上述同樣操 作作為空白

8、調(diào)零，在波長540 mm處比色。以吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo), 葡萄糖毫克數(shù)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。各管葡萄糖含量見下表。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制各試管所含物質(zhì)的體積（2）酶樣測定管號空白1234567葡萄糖溶00. 20.40.60. 81.1.1.蒸餡水2.01. 81.61.41.21.0.0.DNS/ml1.51.51.51.51.51.1.1.葡萄糖量00.20.40.60.81.1.1.于比色管中加入1. 5 ml 5%竣甲基纖維素鈉溶液，在40C水浴 鍋中預(yù)熱5 min,加入0. 5 ml稀釋后的酶液，置40C水浴鍋中， 立即計時，保溫30min（糖化）后取出，即刻加入3 ml DNS顯色液, 于沸水

9、浴中煮沸5 min,使酶失活，終止反應(yīng)，流水冷卻，加蒸 餡水5 ml,搖勻，定容至10 ml；同時以0.5 ml緩沖液代替酶 液，同上操作，作為空白，在540nm處比色，測定吸光度值A(chǔ), 查曲線得相應(yīng)的葡萄糖含量W。（七）酶活力的計算酶的比活力定義：在pH 4.6, 40C條件下，每分鐘水解底物 產(chǎn)生還原糖1網(wǎng)，為1酶活力單位。X= （WXIOOOXn） /（0. 5X180X30）式中，X酶的比活力，U/g；180葡萄糖分子量；0.5酶液的體積，ml；W查標(biāo)準(zhǔn)曲線得出相應(yīng)的葡萄糖含量，mg；30反應(yīng)時間，min；n一一酶稀釋倍數(shù)；1 000由mg換算為ug的換算系數(shù)。（A）單元課小結(jié)由纖維素酶的性質(zhì)應(yīng)用引入，使同學(xué)了解學(xué)習(xí)測定糖化酶 活力的目的、意義。掌握正確的學(xué)習(xí)方法。安排下節(jié)課的學(xué)習(xí)任務(wù)。建立班級學(xué)習(xí)小組，每4人組成一個學(xué)習(xí)小組，由班長、 學(xué)習(xí)委員和小組長組織學(xué)習(xí)興趣小組，協(xié)助代課老師組 織教學(xué)。思考討論布置思考題。5min.教1.恒溫水浴鍋。學(xué)2.分析天平。儀3.變溫電爐。器4.分光光度計。設(shè)5.秒表等備教 學(xué) 資 料教材：生物產(chǎn)品分析與