2015年第10講+細胞膜的生物物理學-01

1、1 Membrane Biophysics 01第十講 膜的生物物理學楊永亮2015年2分子生物物理學 (蛋白質(zhì)折疊、單分子、病毒等)生物物理學的實驗方法 (分子成像、X-射線、冷凍電鏡、GFP等技術(shù)) 膜的生物物理學前沿生物物理學 (干細胞、蛋白質(zhì)組學等)神經(jīng)生物物理學醫(yī)學生物物理學生物物理學綱要3生物物理學的基本思路是相互作用(interactions)和相互識別(recognition)！4引言What is membrane biophysics ?膜生物物理學是研究生物膜結(jié)構(gòu)、物理化學性質(zhì)和相互作用的學科5生物膜的主要功能它們是把細胞分割成一個個“小室” (compartment)

2、的物理屏障。它們具有選擇通透性。它們是“小室”間傳遞化學信息和能量的介面。它們?yōu)榈鞍踪|(zhì)的合成、加工與修飾、分選與定位，提供了工作平臺和輸運載體。6Membrane ArchitectureMolecular Biology of the Cell, Third edition, N.Y. 1994 7Basic Components生物膜的基本組成8 1. 脂質(zhì)及脂質(zhì)聚集體9 什么是脂質(zhì) (lipids)?脂質(zhì)是一類脂肪類物質(zhì)脂質(zhì)是生物膜的重要成分脂質(zhì)是形成生物膜的基礎(chǔ)脂質(zhì)相互作用遵從物理化學規(guī)律101. 1 膜脂質(zhì)的類型磷脂 (phospholipid)甘油磷脂 (glycerophosph

3、olipid)鞘磷脂 (sphingomyelin)糖脂 (glycolipid)類固醇 (steroid)11 甘油磷脂的一般結(jié)構(gòu)式(GPL) R1, R2為脂肪烴鏈 R1一般為不飽和 R2一般為飽和 X為極性基團12甘油磷脂glycero-phospholipids是細胞膜的主要成分存在于所有生物中形成生物膜的骨架-脂雙層PCPEPSPGCLPI13 鞘磷脂主要存在于動物的腦， 神經(jīng)，血液中 植物及微生物細胞中很少鞘磷脂鞘氨醇神經(jīng)酰胺(SM)14 鞘磷脂和甘油磷脂的區(qū)別骨架甘油磷脂：甘油鞘磷脂：鞘氨醇碳氫鏈甘油磷脂：長度近似相等; 一條飽和，一條不飽和鞘磷脂：一長一短；兩條都為飽和氫鍵甘油

4、磷脂：受體，只能用氫鍵形成3分子聚集體鞘磷脂：既可作受體，亦可作供體，可用氫鍵形成分子網(wǎng)絡(luò)氫鍵受體氫鍵供體GPLSM15 糖脂 (glycolipid) 動物細胞中主要是鞘糖脂 由神經(jīng)酰胺 (ceramide) 糖基 化形成 糖脂僅存在于質(zhì)膜外表面 糖脂起信號識別的作用Gal = 半乳糖Glc = 葡萄糖GalNAc = 乙酰氨基半乳糖NANA = 唾液酸 唾液酸帶負電，是細胞膜表面電荷的主要來源16Salic acid 唾液酸流感病毒用唾液酸作為入侵受體17 膽固醇 (cholesterol)18膽固醇的確切的生理功能還不十分清楚 !已知與生物膜的相行為，流動性，膜的分選與運輸。 膜中膽固醇

5、含量與細胞老化(aging)有一定關(guān)聯(lián)。 1920脂質(zhì)分子的雙親性21脂質(zhì)分子理化性質(zhì)的意義脂質(zhì)分子的雙親性決定了其在水中以聚集形式存在極性頭部親水-在水溶液中朝向水非極性尾部親油-在水溶液中避開水并聚集脂質(zhì)分子的形狀決定其以何種方式聚集22Characteristics of Membrane生物膜的特性23膜的流動性24膜的不對稱性25膜脂內(nèi)外分布的不對稱性脂的類型內(nèi)側(cè)外側(cè)鞘磷脂1783磷脂酰膽堿2674磷脂酰乙醇胺7723磷脂酰絲氨酸955糖脂59526膜蛋白內(nèi)外分布的不對稱性27Figure 冷凍斷裂電鏡技術(shù)顯示的脂雙層及膜蛋白分布的不對稱性 28Membrane Proteins膜蛋

6、白29膜蛋白 (membrane protein)膜蛋白是膜功能的載體物質(zhì)輸運- 載體 （糖轉(zhuǎn)運蛋白），通道（K+通道），離子泵（Na+/K+-ATP酶）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)- 受體 （G-蛋白偶聯(lián)受體），酶（磷脂酶C）能量轉(zhuǎn)換- 酶（ATP合成酶），電子傳遞蛋白（細胞色素C）細胞識別- 糖蛋白 (glycoproteins)30內(nèi)在膜蛋白(integral membrane proteins)是整合于膜上的蛋白質(zhì)，總是與膜結(jié)合在一起。包括： 跨膜蛋白 (transmembrane protein)，顧名思義即跨越膜的兩端的蛋白質(zhì)。單向及多向內(nèi)在膜蛋白 (single-pass and multi-pas

7、s membrane protein) 31外周膜蛋白是能夠暫時與膜結(jié)合的蛋白質(zhì)(Peripheral membrane proteins)這種結(jié)合可以通過加入極性試劑，如高pH或高鹽溶液來破壞脂錨定蛋白 (例如GPI蛋白) 32Q: multipass and single-pass transmembrane proteins in this figure? 33膜蛋白鑲嵌方式 GPI proteins34 Lipid-raft model (脂筏模型)脂筏是質(zhì)膜上富含膽固醇和鞘磷脂的微結(jié)構(gòu)域如同脂筏一樣載著各種蛋白 35 研究膜蛋白結(jié)構(gòu)的方法分子生物學 分子克隆 (molecular c

8、loning)- 一級結(jié)構(gòu)定點突變 (site-directed mutagenesis)- 功能分子雜交 (molecular hybridization)- 鑒定蛋白家族36 研究膜蛋白結(jié)構(gòu)的方法結(jié)構(gòu)生物學二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 (secondary structure prediction)- 二級結(jié)構(gòu)X-射線晶體學 (X-ray crystallography)- 三級及四級結(jié)構(gòu)電子顯微學 (electron microscopy)- 三級及四級結(jié)構(gòu)372.3 膜蛋白的結(jié)構(gòu)膜蛋白分為兩大類內(nèi)在蛋白 (integral protein)或 intrinsic protein外周蛋白 (periph

9、eral protein) 或 extrinsic protein外周膜蛋白與水溶性蛋白結(jié)構(gòu)類似本節(jié)只介紹膜內(nèi)在蛋白的結(jié)構(gòu)38內(nèi)在蛋白的種類-螺旋單次跨膜-螺旋多次跨膜-折疊桶-螺旋錨定蛋白39內(nèi)在蛋白(integral membrane proteins)通過疏水相互作用與膜脂疏水區(qū)結(jié)合分子跨膜或鑲嵌在膜內(nèi)用去垢劑或？才能從膜上分離內(nèi)在蛋白-酶-抗原-受體-載體-離子泵-離子通道40 內(nèi)在蛋白如何跨膜脂雙層的碳氫鏈是疏水的(hydrophobic)蛋白質(zhì)必須減小極性，增強疏水性才能跨膜方式：形成分子內(nèi)氫鍵并折疊-螺旋-折疊41The N-H of every peptide bond ish

10、ydrogen-bonded to the carbonyl group of the peptide bond 4 amino acids awayRibbon illustrationof -helixRibbon +C and NbackboneArrangementof atoms showing H bonds42 跨膜肽段的長度-螺旋的螺距為5.4 , 一周有3.6個氨基酸-螺旋中每個氨基酸的高度為 ? (=)脂雙層疏水核的厚度為30跨膜約需? 個氨基酸(= ? ?)43 Antiparallel sheet (peptide chains runin opposite direc

11、tions) Peptide chains held together by hydrogen bonds between peptide bonds of adjacent peptide chains44 膜蛋白中-片層的跨膜肽鍵的極性通過形成氫鍵減弱側(cè)鏈基團交替排列于片層兩側(cè)一側(cè)以極性基團為主另一側(cè)以非極性基團為主非極性側(cè)向外與脂雙層疏水烴鏈作用45 膜蛋白結(jié)構(gòu)形式II- 片層桶46膜蛋白結(jié)構(gòu)實例1-水通道細胞膜上有促進水通透的蛋白質(zhì)-水通道(water channel)促進水的吸收與排泄水通道蛋白由 P.Agre 于1990發(fā)現(xiàn)水通道蛋白(AQP1)的三維結(jié)構(gòu)由電子晶體學和X-射線晶體

12、學解出P.Agre 榮獲2003年Nobel化學獎47 Agre的實驗非洲爪蟾卵母細胞 4849水通道1（AQP1) 的三維結(jié)構(gòu) (Sui et al, Nature 414, 872, 2001)50 水通道的結(jié)構(gòu)51 水通道的選擇性 -為什么離子不能通過？通道的最狹窄處(constriction area)的直徑為2.8H2O與周圍基團形成氫鍵 可通過通道離子不能形成等效配位復(fù)合物 不能通過通道52 水通道的選擇性 -為什么質(zhì)子(H3O+)不能通過？通道的中央有帶正電 的氨基酸靜電排斥作用將帶正 電荷的H3O+阻擋通道還含有帶負電的 氨基酸靜電排斥作用將帶 負電的離子阻擋53膜蛋白結(jié)構(gòu)實例

13、2- K+ Channel細胞膜上存在K+ Channel維持膜電位的穩(wěn)定缺鉀不僅精力和體力下降，心律失常，全身肌肉無力、懶動 結(jié)構(gòu)由Rockefeller大學R.Mackinnon用 X-射線晶體學解析R.Mackinnon 榮獲2003年 Nobel 生理醫(yī)學獎54K+ Channel的分子結(jié)構(gòu)分子生物學及電生理學實驗表明K+ Channel是一個單一的多肽，由四個亞基組成每個亞基含6個跨膜螺旋 (S1-S6)S5與S6之間存在一個發(fā)夾區(qū)H5, 與形成選擇性濾器有關(guān)S4帶正電荷S6參與Channel的形成55 細菌K+ Channel細菌Streptomyces lividans 存在K+

14、通道KcsA, 由4個亞基構(gòu)成每個亞基含2個-螺旋，相當于K+通道的螺旋5和6KcsA可用分子生物學方法大量表達, 為用X-射線晶體學解析結(jié)構(gòu)奠定了基礎(chǔ)56 細菌K+ Channel的三維結(jié)構(gòu) (Doyle et al, Science 280, 69,1998)57 細菌K+ Channel的三維結(jié)構(gòu)58 K+ Channel的結(jié)構(gòu)特點帶負電的氨基酸集中于通道兩端的入口與出口處一個環(huán)從pore helix伸向通道出口處， 形成選擇性濾器 (selectivity filter), 并起到脫水作用由4個亞基構(gòu)成的選擇性濾器形成一個短而堅固的狹孔，孔的直徑0.3nm一個籠子只能容納一個鉀離子選擇

15、性濾器(籠子)由3個主鏈羰基構(gòu)成59 K+ Channel的結(jié)構(gòu)特點60 K+ Channel的選擇性 -為什么陰離子不能通過？帶負電的氨基酸（紅色）集中于通道兩端的入口和出口處靜電場作用吸引陽離子 (cations)排斥陰離子 (anions)61CartoonPotassium ion channel62Na+離子和鉀離子誰的半徑大？Na+離子是否可以通過？63 K+ Channel的選擇性 -Na+能否通過？一種流行觀點：當離子進入選擇性孔道時，必須脫水對K+而言，選擇性孔道的大小合適K+與羰基作用，形成配位復(fù)合物對Na+ 而言，選擇性孔道比Na+ 大Na+不能有效的與羰基作用Na+不能

16、有效脫水，無法通過濾器64離子與K+ Channel的相互作用65事實上，這種觀點目前已經(jīng)被證反，通道在極端條件下（鉀離子完全不存在）是可以通透鈉離子的。Nature Structural & Molecular Biology (17): 10191023, (2010)66 K+ Channel如何開關(guān)？形成selectivity filter的結(jié)構(gòu)非常堅固 在通道開關(guān)過程中不發(fā)生構(gòu)像變化跨膜螺旋在通道開關(guān)過程中發(fā)生構(gòu)像變化, 控制底部的開啟67細菌K+ Channel的開關(guān)機制 (Jiang et al, Nature 417, 523, 2002)紅色：關(guān)閉狀態(tài)；黑色：開放狀態(tài)68 通

17、道開關(guān)的控制類似于照相機光圈的運動 通道并不完全關(guān)閉，形成通道的氨基酸側(cè)鏈阻礙了離子通過 K+ Channel開關(guān)的模式圖69負責“擰緊”通道閘口70膜蛋白結(jié)構(gòu)實例3- ATP合成酶ATP合成酶 (ATP synthase)存在于線粒體內(nèi)膜上利用跨膜質(zhì)子電化學梯度驅(qū)動ATP合成結(jié)構(gòu)由劍橋MRC分子生物學實驗室J.Walker用X-射線晶體學解析J.Walker榮獲1997年Nobel化學獎71 ATP 合成酶的構(gòu)成F1- the catalytic subunit當將F1從膜上分離下來時，發(fā)現(xiàn)F1可催化 ATP 水解 Fo- a proton channel當把F1從膜上分離時，H+可從含F(xiàn)0

18、的膜中流出當把F1重新加回時，膜對H+的通透性降低到原來的水平F1F072 ATP合成酶的亞單位-F1大腸桿菌的F1 含5種多肽鏈 a3, b3, g, d, e a & b subunits 的氨基酸組成類似（homologous） 從膜平面看a & b subunits 交替排列，形成一個環(huán)73 ATP合成酶的結(jié)構(gòu)模式線粒體大腸桿菌74 F1-ATPase的晶體結(jié)構(gòu) (Abrahams JP et al, Nature 370, 621, 1994) g subunit 在a & b subunits 環(huán)之間形成一個支柱shaft （Colours: a, b, g, d, e.）75真人

19、演示版？/v/b/45040948-1775147555.htmlEssential Cell Biology, 3rd Edition，199876Binding change mechanismPaul Boyer 提出：與Fo相連的不規(guī)則形狀的亞單位相對于3個 subunits進行旋轉(zhuǎn)旋轉(zhuǎn)由流過Fo 的H+ 驅(qū)動旋轉(zhuǎn)改變了3個 subunits的構(gòu)象，驅(qū)動ATP合成77Binding change mechanism綠色亞單位按順序在下列三種狀態(tài)變化:松散 ( loose) 構(gòu)象，活性部位松散的結(jié)合ADP + Pi 緊密 (tight）構(gòu)象， 活性部位緊密結(jié)合底物并形成ATP開放 (open）構(gòu)象， 形成的ATP從活性部位釋放78 ATP合成酶工作機制 -Banding Change Mechanism79 ATP合成酶工作機制-Banding Change MechanismF1的晶體結(jié)構(gòu)表明:三個催化亞基處于不同結(jié)合狀態(tài)三個催化亞基處于不同構(gòu)象狀態(tài)結(jié)構(gòu)與binding change model完全符合, Walker 與Boyer分享了1997 Nobel 化學獎80In vitro study of membrane protein 生物膜的離體研究81Methods for solubilization of membrane proteins超聲波降解82 去