生物分離工程5(細(xì)胞破碎技術(shù))課件

1、第四章 細(xì)胞破碎 技術(shù)一、概 述 二、常用的細(xì)胞破碎技術(shù)及其應(yīng)用三、細(xì)胞破碎技術(shù)研究的發(fā)展方向 四、思考題一、概 述（一）細(xì)胞破碎的意義（二）細(xì)胞壁的成分與結(jié)構(gòu)（三）細(xì)胞破碎過(guò)程的檢測(cè)（一）細(xì)胞破碎的意義細(xì)胞破碎技術(shù)是分離純化細(xì)胞內(nèi)合成的非分泌型成分的基礎(chǔ)。有效的細(xì)胞破碎對(duì)分離和純化任何細(xì)胞內(nèi)活性藥物成分都是必要的。細(xì)胞破碎與上游和下游工藝設(shè)計(jì)的關(guān)系 上游通過(guò)細(xì)胞的生理狀態(tài)對(duì)細(xì)胞破碎效果產(chǎn)生影響；而下游則要考慮去除細(xì)胞碎片和細(xì)胞蛋白質(zhì)的污染等對(duì)產(chǎn)品活性的影響。細(xì)胞破碎過(guò)程中必須考慮的因素 細(xì)胞壁的堅(jiān)韌程度 、目標(biāo)產(chǎn)品的性質(zhì) 、破碎的規(guī)模、方法 、費(fèi)用等 .（二）細(xì)胞壁的成分與結(jié)構(gòu)細(xì)菌細(xì)胞壁 主

2、要成分是肽聚糖，由N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰胞壁酸和短肽聚合而成的多層網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。 霉菌的細(xì)胞壁 大多由幾丁質(zhì)和葡聚糖構(gòu)成，還含有少量蛋白質(zhì)和脂類(lèi)。 酵母和真菌的細(xì)胞壁 主要為葡聚糖為-1，6葡聚糖，通過(guò)-1，3糖苷鍵與D-葡萄糖第一側(cè)鏈交聯(lián)，也含有甘露糖和幾丁質(zhì)植物細(xì)胞壁 含纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等原核細(xì)胞的結(jié)構(gòu) 在電子顯微鏡下，可觀察到革蘭陽(yáng)性菌細(xì)胞壁較厚，具有2080 nm的肽聚糖層，約占細(xì)胞壁干重的50。而革蘭陰性菌的肽聚糖層較薄，僅23 nm，占細(xì)胞壁干重的10左右。 在肽聚糖層外還有一較厚的外壁層，約810 nm，主要為脂蛋白、脂多糖和其他脂類(lèi)，含量為細(xì)胞壁干重的80。酵母細(xì)胞的結(jié)

3、構(gòu)植物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)（三）細(xì)胞破碎過(guò)程的檢測(cè)革蘭氏染色法次甲基藍(lán)染色法測(cè)定核酸與蛋白質(zhì)含量離心細(xì)胞破碎液觀察革蘭氏染色法 用革蘭氏染色劑進(jìn)行染色破壁的酵母呈粉紅色，而未破壁的酵母呈蘭紫色，分別計(jì)數(shù)，并采用相同的稀釋度用血球記數(shù)板進(jìn)行鏡檢記數(shù)，計(jì)算破壁率。-破壁率（100%）C-破壁前的細(xì)胞數(shù)（相同稀釋倍數(shù)）C-破壁后的細(xì)胞數(shù)（相同稀釋倍數(shù)）n1-染色后呈紫色細(xì)胞數(shù)n2-染色后呈粉紅色細(xì)胞數(shù)次甲基藍(lán)染色法 取未經(jīng)滅活的發(fā)酵液 0.5 ,用 9/的生理鹽水稀釋 1 0 0倍后 ,用次甲基藍(lán)染色5 ,用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù) ,計(jì)算出細(xì)胞的存活率。 酵母存活率 ： =1 -(染色細(xì)胞總數(shù) /酵母細(xì)胞總數(shù) ) 1

4、00 %. 測(cè)定核酸與蛋白質(zhì)含量 分別在 2 60和 2 80波長(zhǎng)下 ,測(cè)定發(fā)酵液的光吸收值，用Lorry法測(cè)量細(xì)胞破碎后上清中的蛋白質(zhì)含量也可以評(píng)估細(xì)胞的破碎程度，判斷細(xì)胞破碎率。核酸提高率：=(處理后發(fā)酵液的吸光值 /未處理發(fā)酵液的吸光值 ) -1100% 用離心細(xì)胞破碎液觀察 用離心細(xì)胞破碎液觀察沉淀模型的方法來(lái)確定細(xì)胞破碎率，完整的細(xì)胞要比細(xì)胞碎片先沉淀下來(lái)，并顯示不同的顏色和紋理。對(duì)比兩項(xiàng)，可以算出細(xì)胞破碎率。 二、常用的細(xì)胞破碎技術(shù)及其應(yīng)用細(xì)胞破碎方式高壓勻漿 高速珠磨 納米磨破碎撞擊破碎 滲透壓沖擊超聲破碎凍融法低溫玻璃化酶溶法-溶菌酶、纖維素酶等機(jī)械法化學(xué)法-化學(xué)滲透物理法(八

5、)化學(xué)滲透法化學(xué)滲透法是使用某些有機(jī)溶劑(如苯、甲苯)、螯合劑(EDTA)、表面活性劑(SDS、triton X-100)、變性劑 (鹽酸胍、脲)等改變細(xì)胞壁或膜的通透性，從而使內(nèi)含物有選擇地滲透出來(lái)。化學(xué)滲透取決于化學(xué)試劑的類(lèi)型以及細(xì)胞壁和膜的結(jié)構(gòu)與組成，不同試劑對(duì)各種微生物細(xì)胞作用的部位和方式有所差異?；瘜W(xué)滲透法有利也有弊EDTA EDTA作為螯合劑，可用于處理革蘭氏陰性菌(如Ecoli)，對(duì)細(xì)胞的外層膜有破壞作用。革蘭氏陰性菌的外層膜結(jié)構(gòu)通常是靠二價(jià)陽(yáng)離子Ca2+或Mg2+結(jié)合脂多糖和蛋白質(zhì)來(lái)維持的，一旦EDTA將Ca2+或Mg2+螯合，大量脂多糖分子將脫落，使外層膜出現(xiàn)洞穴。這些區(qū)域由

6、內(nèi)層膜的磷脂來(lái)填補(bǔ)，導(dǎo)致該區(qū)域通透性增強(qiáng)。Triton X-100 Triton X-100是非離子型清潔劑，對(duì)疏水性物質(zhì)具有很強(qiáng)的親和力，能結(jié)合并溶解磷脂，因此其作用部位主要是內(nèi)膜的雙磷脂層。tritonX100常與其它試劑混合使用。鹽酸胍和脲 鹽酸胍和脲是常用的變性劑。一般認(rèn)為胍能與水中氫鍵作用，削弱了溶質(zhì)分子間的疏水作用，從而使疏水性化合物溶于水溶液，如胍能從大腸桿菌膜碎片中溶解蛋白。 鹽酸胍不僅能改變細(xì)胞的通透性，而且能溶解不溶性重組蛋白(如包含體)，并在其它試劑的配合下使其二硫鍵斷裂，變性解離成單體，從而釋放出來(lái)。除去變性劑和雜蛋白后，在一定條件下恢復(fù)肽鏈內(nèi)或肽鏈間的二硫鍵，再折迭復(fù)

7、性成具有活性的蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)?；瘜W(xué)滲透法的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：對(duì)產(chǎn)物釋出具有一定的選擇性。 例如用0.2molL胍處理E.coli C600-1，5h后80位于胞間質(zhì)的-內(nèi)酰胺酶釋放出來(lái)，而總的蛋白釋放率僅為4。細(xì)胞外形完整；碎片少，有利于后分離。核酸釋出量少，漿液黏度低，便于進(jìn)一步提取。缺點(diǎn)： 時(shí)間長(zhǎng)，效率低?；瘜W(xué)試劑具有毒性。 通用性差。（一）高壓勻漿破碎法1、高壓勻漿閥及其破碎機(jī)理 2、溫控與能耗3、 存在的問(wèn)題 1、高壓勻漿閥及其破碎機(jī)理從高壓室(幾十兆帕)壓出的細(xì)胞懸浮液經(jīng)過(guò)閥座D的中心孔道，從D和閥C之間的小環(huán)隙中噴出，速度可達(dá)每秒幾百米。這種高速?lài)姵龅臐{液又射到靜止的撞擊環(huán)E上，被迫改變

8、方向從出口管流出。細(xì)胞在這一系列過(guò)程中經(jīng)歷了高速造成的剪切、碰撞以及由高壓到常壓的變化，從而造成細(xì)胞的破碎。實(shí)驗(yàn)室級(jí)高壓均質(zhì)儀 高壓細(xì)胞破碎機(jī)2、溫控與能耗將溫度控制在35以下，那么酶活損失可以忽略。對(duì)于溫度敏感性物質(zhì)，需低溫操作。機(jī)械破碎的能耗主要包括提供動(dòng)力(如壓力)消耗的能量以及低溫操作耗費(fèi)的能量。 如，提高壓力需增加能耗(3.5kW100MPa)，同時(shí)產(chǎn)生熱量(23.8100MPa) 。3、存在的問(wèn)題高壓勻漿破碎技術(shù)適合細(xì)菌和部分酵母菌細(xì)胞的破碎處理，而不適用于絲狀微生物細(xì)胞的破碎，這是由于絲狀微生物會(huì)對(duì)破碎器產(chǎn)生堵塞作用。 細(xì)胞破碎時(shí)濃度應(yīng)在60-80(濕重體積)，高于這個(gè)濃度時(shí)破碎

9、效果有所降低。 （二）高速珠磨法 高速珠磨的破碎機(jī)理 溫控、能耗 及存在的問(wèn)題高壓勻漿法與高速珠磨法的優(yōu)劣1、高速珠磨的破碎機(jī)理如：株磨式組織研磨器（圖）；小型株磨器（圖） 微生物細(xì)胞懸浮液與極細(xì)的研磨劑(通常是直徑1 mm的無(wú)鉛玻璃珠)在攪拌槳作用下充分混合，珠子之間以及珠子和細(xì)胞之間的互相剪切、碰撞促進(jìn)細(xì)胞壁破裂，釋出內(nèi)含物。在珠液分離器的協(xié)助下，珠子被滯留在破碎室內(nèi)，漿液流出，從而實(shí)現(xiàn)連續(xù)操作。破碎中產(chǎn)生的熱量由夾套中的冷卻液帶走 珠磨式組織研磨器 利用微細(xì)玻璃珠，在高速運(yùn)轉(zhuǎn)下的相互碰撞，造成組織細(xì)胞的破裂與分散。適合珍貴樣品液的研磨，例如蛋白質(zhì)、酶及細(xì)胞液等。微細(xì)玻璃珠可回收使用。樣品

10、處理量，含玻璃珠可達(dá)350ml。 樣品量可達(dá)80 小型珠磨器 密閉容器可容納1至1.5ml的組織液或是一些細(xì)胞懸濁液，通過(guò)1至3分鐘的劇烈攪拌，能使細(xì)胞徹底的破裂，甚至一些骨頭、微生物的孢子通過(guò)玻璃珠的研磨也能有效的磨碎。玻璃珠適用性： 細(xì)菌用0.1mm的玻璃珠 酵母、藻類(lèi)和組織培養(yǎng)細(xì)胞用0.5mm的玻璃珠 動(dòng)植物的組織用1mm的玻璃珠2、溫控與能耗采用夾套冷卻的方式實(shí)現(xiàn)溫度控制提高破碎率，需要增加裝珠量、提高轉(zhuǎn)速和延長(zhǎng)破碎3、高壓勻漿法與高速珠磨法的優(yōu)劣 高壓勻漿法操作參數(shù)少，易于確定，而且樣品損失量少，最少可處理20ml懸浮液；珠磨機(jī)操作參數(shù)多，一般憑經(jīng)驗(yàn)估計(jì)，并且珠子之間的液體損失使一次

11、處理85ml懸浮液最終只能得到50ml左右的漿液。連續(xù)操作時(shí)珠磨機(jī)顯示出優(yōu)越性，首先它兼具破碎和冷卻雙重功能，減少了產(chǎn)物失活的可能性，而高壓勻漿器需配備換熱器進(jìn)行級(jí)間冷卻；其次珠磨法破碎效率高，（三）超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)1、基本原理2、影響因素 3、實(shí)驗(yàn)室連續(xù)破碎池結(jié)構(gòu)示意圖 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)基本原理 超聲波破碎機(jī)由超聲波發(fā)生器和換能器組成。超聲波發(fā)生器將50Hz220V市電變成20KHz電能供給換能器。換能器隨之作縱向機(jī)械振動(dòng)。振動(dòng)波通過(guò)浸入在生物溶液中的鈦合金變幅桿產(chǎn)生空化效應(yīng)，激發(fā)介質(zhì)里的生物微粒劇烈振動(dòng)，引起的沖擊波和剪切力使細(xì)胞破碎。 空化現(xiàn)象是在強(qiáng)超聲波作用下，氣泡形成、長(zhǎng)大和破碎的現(xiàn)

12、象。超聲破碎與聲頻、聲能、處理時(shí)間、細(xì)胞濃度、菌種類(lèi)型等因素有關(guān)。 影響超聲波破碎的因素 超聲波的聲強(qiáng)、頻率、溫度控制能力和破碎時(shí)間。細(xì)胞懸浮液的離子強(qiáng)度、pH和細(xì)胞種類(lèi)等對(duì)破碎效果也產(chǎn)生影響。發(fā)射針的快速振動(dòng)會(huì)產(chǎn)生大量的熱，在使用中必須每間隔幾分鐘關(guān)掉發(fā)生器以消散熱量。超聲波破碎時(shí)細(xì)胞濃度一般在20左右，高濃度和高黏度都會(huì)降低破碎速度。超聲波產(chǎn)生的化學(xué)自由基團(tuán)能使某些敏感性活性物質(zhì)變性失活，噪聲令人難以忍受，而且大容量裝置的聲能傳遞、散熱均有困難，因而超聲破碎的工業(yè)應(yīng)用潛力有限。 實(shí)驗(yàn)室連續(xù)破碎池結(jié)構(gòu)示意圖 （四）膠體磨-納米破碎機(jī)膠體磨的原理膠體磨基本參數(shù)膠體磨原理膠體磨的基本工作原理是剪

13、切,研磨及高速攪拌作用。磨碎依靠?jī)蓚€(gè)齒形面的相對(duì)運(yùn)動(dòng),其中一個(gè)高速旋轉(zhuǎn)另一個(gè)靜止,使通過(guò)齒面之間的物料受到極大的剪切力及磨擦力,同時(shí)又在高頻震動(dòng),調(diào)整旋渦等腰三角形復(fù)雜力的作用下使物料有效的分散、浮化、粉碎、均質(zhì)。膠體磨基本參數(shù) 型號(hào)L50L65L80L80FL100乳化細(xì)度(um)2222調(diào)節(jié)范圍(mm)1-0.011-0.011-0.011-1.01產(chǎn)量(T/h)0.01-0.050.01-0.050.5-10.5-3電機(jī)功率(KW)1.11.53.04.05.5電壓(V)380380380380轉(zhuǎn)速(r/min)2900290029002900磨片直徑(mm)506580100出口直徑(

14、寸)5/85/83/23/2進(jìn)口直徑(寸)5/45/425/2冷卻水管徑(寸)1/41/4重量(kg)4050100200150（五）撞擊破碎法 細(xì)胞懸浮液以噴霧狀高速凍結(jié)(凍結(jié)速度為數(shù)千min)，形成粒徑小于50m的微粒子。高速載氣(如氮?dú)?，流速約300ms)將凍結(jié)的微粒子送入破碎室，高速撞擊撞擊板，使凍結(jié)的細(xì)胞發(fā)生破碎。 撞擊破碎的特點(diǎn)細(xì)胞破碎僅發(fā)生在與撞擊板撞擊的一瞬間，細(xì)胞破碎程度均勻，可避免細(xì)胞反復(fù)受力發(fā)生過(guò)度破碎的現(xiàn)象。另外，細(xì)胞破碎程度可通過(guò)無(wú)級(jí)調(diào)節(jié)載氣壓力(流速)控制，避免細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的破壞，適用于細(xì)胞器(如線粒體、葉綠體等)的回收。撞擊破碎適用于大多數(shù)微生物細(xì)胞和植物細(xì)胞的破

15、碎，通常處理細(xì)胞懸浮液濃度為1020。實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的撞擊破碎器間歇處理能力約50-500ml，而工業(yè)規(guī)模的連續(xù)處理能力在10Lh以上。（六）滲透壓沖擊破碎法 滲透壓沖擊破碎法是將細(xì)胞放在高滲透壓溶液中(如25的蔗糖或甘油溶液)，由于滲透壓的作用，細(xì)胞內(nèi)水分向外滲出，細(xì)胞收縮，此時(shí)快速將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至低滲緩沖液中(如水溶液)，由于滲透壓的突然變化，胞外的水分迅速滲入胞內(nèi)，使細(xì)胞快速膨脹而破裂的細(xì)胞破碎技術(shù)。細(xì)菌、真菌類(lèi)和植物細(xì)胞的細(xì)胞壁強(qiáng)度較高，滲透壓沖擊破碎法很少用于此類(lèi)細(xì)胞的破碎（七）低溫玻璃化破碎技術(shù)低溫玻璃化破碎技術(shù)是在低溫玻璃化保存過(guò)程中發(fā)生的低溫?cái)嗔鸦A(chǔ)上提出來(lái)的新技術(shù)。其理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)是

16、生物組織超快速凍結(jié)發(fā)生低溫?cái)嗔熏F(xiàn)象,進(jìn)而對(duì)組織細(xì)胞產(chǎn)生不可逆損害,使細(xì)胞組織破裂, 胞物質(zhì)成份游離釋放。該方法在低溫水平下從超微結(jié)構(gòu)上進(jìn)行破碎,避免了通常提取法中使用高溫高壓、強(qiáng)酸強(qiáng)堿處理對(duì)營(yíng)養(yǎng)組分活性的破壞,故具有低溫穩(wěn)定性好,產(chǎn)品質(zhì)量高等優(yōu)點(diǎn)三、細(xì)胞破碎技術(shù)研究的發(fā)展方向 （一）多種破碎方法相結(jié)合 （二）與上游過(guò)程相結(jié)合 （三）與下游過(guò)程相結(jié)合 （一）多種破碎方法相結(jié)合化學(xué)法與酶法取決于細(xì)胞膜壁的化學(xué)組成;機(jī)械法取決于細(xì)胞結(jié)構(gòu)的機(jī)械強(qiáng)度，而化學(xué)組成又決定了結(jié)構(gòu)的機(jī)械強(qiáng)度化學(xué)法或酶法與機(jī)械法相結(jié)合: 例如，用細(xì)胞壁溶解酶預(yù)處理面包酵母，然后高壓勻漿，95MPa壓力下勻漿4次，總破碎率接近100，而單獨(dú)采用高壓勻漿法，同樣條件下破碎率只有32。與上游過(guò)程相結(jié)合在發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中，生長(zhǎng)期、培養(yǎng)參數(shù)等對(duì)細(xì)胞破碎組成結(jié)構(gòu)有直接影響。用基因工程的方法對(duì)菌種進(jìn)行改造也是非常重要的