林木組織培養(yǎng)

1、一、植物組織培養(yǎng)在農林業(yè)生產上的主要應用。在現(xiàn)代農林業(yè)生產中植物組織培養(yǎng)主要應用于以下幾個方面：植物組織培養(yǎng)在離體快速繁殖上的應用。植物離體快繁也叫微型繁殖，是目前植物組 織培養(yǎng)中應用最廣泛、最有成效的一種技術。植物組織培養(yǎng)不受地區(qū)、氣候變化的影響，培 養(yǎng)條件可以人為控制，其繁殖速度快，一般比常規(guī)繁殖方法快萬倍到數(shù)十萬倍，為快速獲得 農作物和園林苗木提供了一種新的途徑。植物離體快繁主要應用于新育成、新引進、新發(fā)現(xiàn) 的良種的快繁；無病毒苗的大量快繁及一些特殊材料如育種材料、突變體、基因工程植株、 瀕危植物等的快繁。一些無性繁殖作物如果樹、球莖和鱗莖植物、馬鈴薯、甘薯、菊花、草 莓等，生產中所用的

2、品種一般為雜合型的植株，這類植物如采用種子繁殖，則后代會出現(xiàn)變 異，不能保持原品種的優(yōu)良特性；采用常規(guī)無性繁殖，不僅有些類型的植物繁殖率低，而且 長期多代繁殖后，因病蟲害等原因會使種性下降。因此對這些無性繁殖的作物來說，組織培 養(yǎng)的繁殖方法無論是對加快繁殖還是對提高種性來講都是十分適宜的。目前世界上 80 %85%是通過組織培養(yǎng)進行脫毒和快繁的。目前我國為其他國家代加工生產或直接出口的組 培苗品種有甘蔗、香蕉、百合、玉簪、大花萱草、唐菖蒲、絲石竹等近30種。培育無病毒苗。許多植物都遭受到病毒病不同程度的危害。有的種類甚至同時受到數(shù) 種病毒病的危害，嚴重地影響了產品的商品價值。對于無性繁殖的作物

3、如絕大部分的果樹、 部分蔬菜（洋蔥、大蒜、石刁柏、菊芋、馬鈴薯）和花卉（菊花、唐菖蒲、風信子、秋海棠、 月季）等，如遭受病毒侵染后，代代相傳，則體內可以積累相當高濃度的病毒，影響生長和 成活，嚴重危害生產的發(fā)展。而病毒病又不同于真菌和細菌病害，采用殺菌劑和抗生素等化 學藥劑防止很難湊效。自從Morel （1952）發(fā)現(xiàn)采用莖尖培養(yǎng)的方法可以從嚴重感染病毒的 植株得到無病毒苗后，這方面的工作引起了人們的重視。在許多園藝植物上進行培育試驗也 相繼得到成功，從此莖尖培養(yǎng)就成為解決病毒病害的一個重要途徑。也可以采用莖尖培養(yǎng)與 熱處理相結合的方法來提高莖尖培養(yǎng)的脫毒效果。對于一些木本果樹植物，如果莖尖培

4、養(yǎng)得 到的植株難以發(fā)根生長，且結果晚，則可采用莖尖微體嫁接的方法來培養(yǎng)無病毒苗。利用組織培養(yǎng)生產無病毒苗的方法，已在許多果樹（柑橘、蘋果、草莓、葡萄）、蔬菜 （馬鈴薯、大蒜）、花卉（蘭花、菊花、康乃馨、水仙、唐菖蒲）等作物的常規(guī)生產上得到 應用。目前中國已建成葡萄、蘋果、香蕉、馬鈴薯、甘蔗等作物脫毒快繁生產線11條。植物組織培養(yǎng)在育種上的應用。1964年，印度的Guha和Maheshwari在毛葉曼陀羅 花藥培養(yǎng)中，成功地由花粉誘導得到了單倍體植株，從而促進了花藥和花粉培養(yǎng)的研究，以 后在煙草、水稻、小麥、玉米、番茄、甜椒、草莓、蘋果等多種植物上獲得成功。利用花藥 和花粉培養(yǎng)誘導花粉發(fā)育成單倍

5、體植株，單倍體植株經過秋水仙素等藥劑處理后，染色體加 倍可以獲得同源二倍體的純合系，其后代不會分離，可以直接用于選育雜種一代的親本或性 狀純合的常規(guī)品種。在遠緣雜交中，雜種胚經常停止發(fā)育，得不到雜種植株，而通過胚胎培 養(yǎng)則可以克服遠緣雜交的這種困難。這種方法在育種實踐中早已被采用。如在普通栽培番茄 與野生番茄一秘魯番茄的遠緣雜交中就常被采用。在組織培養(yǎng)中能夠產生突變，突變的產生 因部位而異。莖尖的遺傳性比較穩(wěn)定；細胞和組織在培養(yǎng)中變異率較大。采用紫外線等射線 照射培養(yǎng)物，或者在培養(yǎng)基中加入疊氮化合物，可以誘導和提高突變率。如我國已經篩選出 耐鹽的水稻、煙草、甘蔗的再生植株或細胞系。20世紀70

6、年代初，日本科學家首次利用煙 草葉片分離出的原生質體培養(yǎng)獲得再生植株成功。日本和中國在原生質體培養(yǎng)領域做出了重 要貢獻。中國成功地培養(yǎng)了包括大豆、玉米、小麥、高粱等重要作物在內的30個以上品種 的原生質體再生植株。人工種子。人工種子的概念是1978年提出的，它是指最外面的一層有機的薄膜包裹 以及保護水分免于喪失及防止外部的物理力量沖擊，中間含有培養(yǎng)物（胚狀體、腋芽或不定 芽等）所需要的營養(yǎng)成分和某些植物激素，是作為胚狀體等萌發(fā)時的能量和刺激因素，最內 則是被包埋的胚狀體或芽。通過這幾部分的組合，以人為的方法制造出一種和天然種子類似 的結構。1958年Reinert在胡蘿卜的組織培養(yǎng)中最先發(fā)現(xiàn)了

7、胚狀體（即體細胞胚胎），之 后，在至少100余種植物的組織培養(yǎng)中產生了胚狀體。從20世紀80年代起，人工種子的研 究在世界上受到廣泛的關注。美、日、法等國相繼開展了人工種子的研究，并在胡蘿卜、苜 蓿、芹菜、花椰菜、萵苣和花旗松等植物上獲得了初步成功。中國也從“七五”開始研究人 工種子。植物種質資源的保存與交換。由于許多植物的組織和細胞培養(yǎng)物在液氮超低溫條件下 貯藏后，仍然能夠保持很高的存活率并能重新再生出植株，保持原來的遺傳特性，因此可以 利用植物組織培養(yǎng)技術保存植物種質資源，從而節(jié)省了大量的人力和土地資源。將植物材料 以組培形式保存在容器內運輸，開展國家、地區(qū)間的種質資源交換和植物商品交流，

8、不僅能 夠節(jié)省時間和空間，降低運輸成本，而且能夠減少種子和非試管植株材料所攜帶的有害生物 的危險。設在秘魯首都利馬的國際馬鈴薯中心已對14個國家以組培形式運輸，以后，甘蔗、 姜、甘薯及多種花卉在國家間也采用了組培形式進行商品交流。二、植物組織培養(yǎng)中常見的問題及其對策。在植物初代培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)過程中經常會遇到一些問題，如污染、畸形胚、玻璃苗、褐 變、黃化等,影響實驗結果，甚至導致實驗失敗，給科研和生產造成損失。對這幾個問題產生 的原因及解決措施進行了論述。污染。污染是在組織培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料滋生雜菌，導致培養(yǎng)失敗。造成污 染的原因有多種，培養(yǎng)環(huán)境不清潔，母株預處理不當，外植體滅菌不凈，培

9、養(yǎng)基受菌污染，實驗 所用儀器消毒不徹底，操作程序不當?shù)榷紩斐晌廴尽＜毦廴镜闹饕卣魇桥囵B(yǎng)材料周圍 出現(xiàn)粘液菌斑或培養(yǎng)基中出現(xiàn)混濁霧狀痕跡,主要由外植體、操作器具、培養(yǎng)基滅菌不嚴引 起。真菌污染的特征是菌斑呈絨毛狀、絮狀，有不同顏色的孢子，多由如操作不慎真菌孢子從 瓶口落入造成污染。另外還有內生菌造成的潛伏性污染。解決辦法：嚴格消毒,規(guī)范操作程序。接種室、超凈工作臺、培養(yǎng)室要定期消毒，培養(yǎng) 室相對濕度控制在70%左右。室內污染源主要是空氣中的真菌和細菌，可用75%的酒精室內噴 霧，也可用高錳酸鉀和甲醛混合熏蒸。接種前用70%的酒精擦洗超凈工作臺，并且打開紫外線 燈照射30分鐘，保證超凈工作臺

10、處于無菌狀態(tài)。嚴格無菌操作，接種工具全部消毒，接種人員 自身要全面消毒等。每次操作都要用酒精燈燒烤接種針,在操作過程中，盡量不說話，頭部不 要伸入操作臺內，快速完成接種過程。外植體和培養(yǎng)基的滅菌。在組織培養(yǎng)過程中，選擇不 易污染且易表達全能性的外植體是成功建立組織培養(yǎng)體系的決定因素之一，所取外植體材料 為較幼嫩的莖、葉時，可先將材料用清水沖洗干凈,用吸水紙吸干，再以70%的酒精浸泡，無菌 水沖洗后，用2%10%的次氯酸鈉浸泡。褐變。影響褐變因素有很多，因植物品種、基因型、外植體的取材部位及生理狀態(tài)、 材料的年齡和大小、光照、溫度等環(huán)境條件的影響，褐變程度差異較大。單寧、色素含量高 的木本植物易

11、發(fā)生褐變，像板栗、核桃因單寧含量高，在初代、繼代培養(yǎng)中極易發(fā)生褐變而死 亡。像塊莖、鱗莖類、天南星科、松柏科、木蘭科、茶科植物很易褐化。薔薇科、金縷科， 木犀科植物等不易褐化。幼齡材料褐變率較低，冬春季節(jié)褐變較輕，而夏季褐變較重。溫度過 高或光照較強會促進酚類物質的氧化，加速褐變。有些植物如菊的莖段雖然易褐化，但并不影 響愈傷組織或叢生芽的誘導，可不考慮褐化因素。當褐化嚴重影響了愈傷組織和芽的誘導時， 就要采取措施抑制褐變。解決辦法：選用適宜的外植體、控制培養(yǎng)條件以及選擇幼齡材料作為外植體，褐變較輕。 外植體受傷害程度直接影響褐變，切割時盡可能減小傷口面積，并縮短切口暴露在空氣中的 時間。筆者

12、在試驗中發(fā)現(xiàn)切口長度以814 mm褐變較輕，成活率達85%。選擇合適的消毒劑 和消毒方法，增加瓊脂的用量使培養(yǎng)基的硬度增大，降低了酚類物質的擴散速度，褐變減少。初期培養(yǎng)要在黑暗和弱光下進行。降低溫度，暗處理母株，連續(xù)轉移幾次，可減少外植體發(fā)生 褐變。黃化。培養(yǎng)基中礦物質營養(yǎng)不均衡、鐵含量不足、激素配比不當、糖不足、長期不轉 移、培養(yǎng)環(huán)境通氣不良、pH值大、光照不足、培養(yǎng)溫度不適等是整株失綠、全部或部分葉 片黃化的主要原因。解決辦法：）配制母液和培養(yǎng)基的制作過程中，要檢查儀器設備是否準確，還要認真細 致地核對每項稱量的每一個環(huán)節(jié)；配制培養(yǎng)基時切記不要忘記加糖；及時轉接培養(yǎng)物； 使用透氣的封口膜以

13、改善瓶內通氣狀況；適當調節(jié)pH值、激素配比和無機鹽濃度； 控制培養(yǎng)室內的溫度;適當增加光照；在培養(yǎng)基中添加抗生素類物質如青霉素、鏈霉素、 頭孢霉素等,有時也會出現(xiàn)幼苗黃化現(xiàn)象，應適當減少用量或停止使用?；闻?。體細胞胚胎在早期發(fā)育時出現(xiàn)畸形，形態(tài)和生理功能都出現(xiàn)異常,不能育成苗， 或移栽不能成活的現(xiàn)象叫畸形胚，如聯(lián)體胚、子葉畸形胚、單極胚、多極胚、無極胚、胚軸 畸形胚、重新愈傷化胚、玻璃化胚、白化胚等。越靠近子葉片畸形胚分化率越高，子葉片上 的不定胚幾乎都是畸形胚。解決辦法：在體胚發(fā)育早期，培養(yǎng)基中加入適當濃度的ABA、NAA、KT,子葉畸形胚、多 極胚和其他畸形較輕的胚狀體可在畸形胚的基礎上

14、長出正常芽，逐漸發(fā)育成正常苗。當KT 使用濃度為0.5mg/L時,最有利于畸形胚萌發(fā)轉化為正常苗，轉化率可達37.5%。增加蔗糖濃 度或直接干燥減少水分，縮短胚性愈傷組織誘導培養(yǎng)時間，減少種植密度，選擇通風透光條件 好的培養(yǎng)器，都可減少畸形胚的發(fā)生。玻璃苗。植物組織培養(yǎng)中，出現(xiàn)試管苗含水量高，嫩梢呈半透明狀,葉片皺縮卷曲，植株 矮小失綠，葉表無角質層臘質，組織結構發(fā)育畸形的現(xiàn)象，這時的試管苗稱為玻璃苗。玻璃苗 生根困難，移栽后不易成活,不能繼續(xù)培養(yǎng)。玻璃苗多為組培過程中措施不當造成的非遺傳生 理性失調癥狀,進行適當?shù)幕謴团囵B(yǎng)，多數(shù)可恢復正常生長。培養(yǎng)基中離子種類，比例不適， 瓊脂濃度低，培養(yǎng)環(huán)

15、境如溫度、光照、濕度、pH值、通氣不良等間接影響玻璃苗的發(fā)生。解決辦法：選擇不易玻璃化的基因型材料及部位作為外植體。選擇適當培養(yǎng)基、糖 源及外源激素的種類和濃度，提高培養(yǎng)基中Ca2+、Zn2+等離子濃度，適當提高瓊脂用量。降 低培養(yǎng)基的襯質勢，減少培養(yǎng)基中植物材料可獲得的水分。適當提高培養(yǎng)基中蔗糖含量， 降低培養(yǎng)器內部環(huán)境的相對溫度。改善培養(yǎng)容器的通風換氣條件，使用透氣性好的容器或 封口材料如用棉塞封口等都可減少玻璃苗的發(fā)生。三、植物微體快速繁殖主要技術環(huán)節(jié)。植物快繁與脫毒生產的技術環(huán)節(jié)包括培養(yǎng)基制備、器具消毒、外植體選擇、接種和初級 培養(yǎng)、繼代增殖培養(yǎng)、壯苗、生根、馴化和移栽、種苗生產計劃與

16、成本預算等。培養(yǎng)基選配、 外植體選取、試管苗馴化與移栽、種苗生產計劃與成本預算是4項主要技術。培養(yǎng)基的選配。種植物能否通過組織培養(yǎng)進行大量、快速的繁殖，關鍵在于設計和選 用合適的培養(yǎng)基，使每個分生組織細胞或脫分化的體細胞能夠持續(xù)生長并適時分化。MS培 養(yǎng)基是快繁與脫毒培養(yǎng)中應用最廣泛的培養(yǎng)基，它的特點是無機鹽的濃度高，具有高含量的 氮、鉀，尤其硝酸鹽的用量很大。同時還含有一定數(shù)量的銨鹽，這使得它營養(yǎng)豐富，不需要 添加更多的有機附加物，就能滿足植物組織對礦質營養(yǎng)的要求，有加速愈傷組織和培養(yǎng)物生 長的作用，即使培養(yǎng)物久不轉移，仍可維持其生存，所以它是大多數(shù)植物的培養(yǎng)基。與MS 比較類似的有LS、B

17、L、ER培養(yǎng)基。B5、N6和SH等為硝酸鹽含量較高的培養(yǎng)基，H、Nitsch、 Miller和Blaydes培養(yǎng)基為中等無機鹽培養(yǎng)基。植物生長調節(jié)物質對愈傷組織誘導、器官分化及植株再生具有重要的作用，常常是培養(yǎng) 基中不可缺少的的關鍵物質。植物生長調節(jié)物質包括生長素和細胞分裂素。生長素的主要作 用是誘導愈傷組織的產生促進細胞脫分化，促進細胞的伸長生長，誘導受傷的組織表面形成 愈傷組織，促進生根。常用的生長素有吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）、萘乙酸（NAA）、 2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）和ABT生根粉等。外植體的選取?？焖俜敝骋x擇種質優(yōu)良、植株健壯、時期合適、大小適宜的外植體。

18、性狀優(yōu)良的種質，有利于提高成功的機率，增加其實用價值。生長健壯無病蟲的植株，其器 官或組織代謝旺盛，再生能力強，比較容易培養(yǎng)成功。在植株生長的最適時期取材不僅成活 率高，而且生長速度快，增殖率高。植物的莖尖、莖段、根、葉、花、胚等器官都可以快繁 與脫毒，其中莖尖是活躍的生長區(qū)，容易培養(yǎng)成功。取材的大小根據(jù)不同植物材料而異，材 料太大易污染，也不需要；材料太小，多形成愈傷組織，甚至難于成活?？焖俜敝骋话氵x0.5- 1.0cm的培養(yǎng)材料；脫毒培養(yǎng)，多用0.廣0.5mm的生長點作材料，如果采用0.1mm以下的 生長點，則培養(yǎng)時間長，成活率低。試管苗的馴化與移栽。由于試管苗長期與外界環(huán)境隔離，形成了一

19、個高溫、高濕、弱 光和無菌的獨特生態(tài)系統(tǒng)。馴化的目的在于提高試管苗對外界環(huán)境條件的適應性，提高其光 合作用的能力，最終提高移栽成活率。馴化一般是在試管苗移栽前進行煉苗，方法是將長有 完整試管苗的試管或三角瓶由培養(yǎng)室轉移到半遮蔭的自然光下進行鍛煉，在自然光下恢復植 物體內葉綠體的光合作用能力和健壯度，并打開瓶蓋注入少量自來水使幼苗逐漸降低溫度， 轉向有菌，這樣幼苗周圍的環(huán)境就會逐步與自然環(huán)境相似。移栽的方法有常規(guī)移栽法、直接移栽法和嫁接移栽法。常規(guī)移栽法是指將試管苗在生長 素濃度高的培養(yǎng)基上誘導生根，當獲得大量的不定根后，打開培養(yǎng)瓶注入少量自來水，在半 遮光下馴化3-5d，然后取出洗去培養(yǎng)基，移

20、栽到無菌的混合土中，保持一定的溫度和水分， 當長出2-3片新葉時就可將其移栽到田間或盆缽的方法。馴化時間視作物與具體情況而定， 一般為 2-10d。種苗生產計劃與成本預算。任何一項產業(yè)都必須面向市場，以市場的需求為導向。良 好的經濟效益來源于適度的生產規(guī)模、合理的預算、良好的產品質量、科學的經營管理、合 理的生產規(guī)模應取決于市場的供需狀況和產品的價值。這就涉及到試管苗的增殖率和生產一 定數(shù)量苗木所需的時間，也就是如何確定生產規(guī)模和培養(yǎng)計劃。四、植物基因轉化受體系統(tǒng)的條件。高效穩(wěn)定的再生能力。從理論上講，植物的任何體細胞都具有再生完整植株的潛能， 即具有全能性但在組織培養(yǎng)的實踐中，并不是所有的體細胞都能再生出完整植株。一般營養(yǎng) 生長中心（分生組織）和薄壁細胞易再生出植株。再生頻率必須具有好的穩(wěn)定性和重復性。 植物轉化頻率一般情況下只有0.1%?；蜣D化操作，如農桿菌侵染，使用抗菌素篩選及繼 代培養(yǎng)，都會使轉化外植體再生頻率降低，有的甚至不能分化，或只能分化形成芽，而難以 形成植株。較高的遺傳穩(wěn)定性。植物受體接受外源DNA后不影響其分裂和分化，并能穩(wěn)定地將外 源基因遺傳給后代，保持遺傳的穩(wěn)定性，盡量減少變異。不因導入優(yōu)良性狀的目的基因，使 原有的目的性狀（優(yōu)良性狀）在后代發(fā)生了變