微生物的生長(zhǎng)及其控制課件

1、微生物的生長(zhǎng)及其控制本章基本要求：掌握測(cè)定微生物生長(zhǎng)繁殖的方法，掌握微生物的生長(zhǎng)規(guī)律，了解影響微生物生長(zhǎng)的主要理化因素，掌握控制有害微生物的主要方法。本章的重點(diǎn)是：影響微生物生長(zhǎng)的主要理化因素、有害微生物的控制。本章的難點(diǎn)是：微生物的生長(zhǎng)規(guī)律、有害微生物的控制。 第一節(jié) 測(cè)定生長(zhǎng)繁殖的方法第二節(jié) 微生物的生長(zhǎng)規(guī)律第三節(jié) 影響微生物生長(zhǎng)的主要因素第四節(jié) 微生物培養(yǎng)法概論第五節(jié) 有害微生物的控制生長(zhǎng)微生物細(xì)胞吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)行新陳代謝，當(dāng)同化作用異化作用時(shí)，生命個(gè)體的重量和體積不斷增大的過(guò)程。幾個(gè)的概念繁殖生命個(gè)體生長(zhǎng)到一定階段，通過(guò)特定方式產(chǎn)生新的生命個(gè)體，即引起生命個(gè)體數(shù)量增加的生物學(xué)過(guò)程。發(fā)

2、育從生長(zhǎng)到繁殖，是生物的構(gòu)造和機(jī)能從簡(jiǎn)單到復(fù)雜、從量變到質(zhì)變的發(fā)展變化過(guò)程，這一過(guò)程稱為發(fā)育。個(gè)體生長(zhǎng)微生物細(xì)胞個(gè)體吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)行新陳代謝，原生質(zhì)與細(xì)胞組分的增加為個(gè)體生長(zhǎng)。群體生長(zhǎng)群體中個(gè)體數(shù)目的增加。可以用重量、體積、密度或濃度來(lái)衡量。個(gè)體生長(zhǎng)個(gè)體繁殖 群體生長(zhǎng)群體生長(zhǎng) = 個(gè)體生長(zhǎng) + 個(gè)體繁殖由于微生物的個(gè)體極小，所以常用群體生長(zhǎng)來(lái)反映個(gè)體生長(zhǎng)的狀況測(cè)定生長(zhǎng)繁殖的方法生長(zhǎng)意味著原生質(zhì)含量的增加，測(cè)定生長(zhǎng)的方法都直接或間接地以此為依據(jù)。測(cè)定繁殖則是建立在計(jì)算個(gè)體數(shù)目的基礎(chǔ)上。一、微生物的純培養(yǎng) 稀釋平板法 劃線法 單細(xì)胞挑取法 選擇培養(yǎng)基分離法二、測(cè)生長(zhǎng)量三、計(jì)繁殖數(shù)計(jì)繁殖數(shù)直接法間

3、接法比例計(jì)數(shù)法血球計(jì)數(shù)法液體稀釋法平板菌落計(jì)數(shù)法其它（P、DNA）測(cè)生長(zhǎng)量直接法間接法測(cè)體積稱重量（干重、濕重）比濁法生理指標(biāo)法測(cè)含碳量測(cè)含氮量Viable cell count1.dilute sample1 ml9 ml10 100 1000 104 105 106 107cell No./ml2. plate out 0.1 ml 6Inoculating an agar plate to obtain single colonies6Mixed culturePure culture單細(xì)胞挑取法Mixed cultureOral swabSwab from sole of shoeEa

4、ch colony was examined microscopically6選擇培養(yǎng)基分離法1.dilute sample1 ml9 ml10 100 1000 104 105 106 107牛肉膏培養(yǎng)基土豆培養(yǎng)基高氏培養(yǎng)基6二、測(cè)生長(zhǎng)量干重法將一定量的菌液中的菌體通過(guò)離心或過(guò)濾分離出來(lái),然后烘干(干燥溫度可采用105、100或80)、稱重。一般干重為濕重的10%20%，而一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞一般重約10-1210-13g。該法適合菌濃度較高的樣品。舉例：液體培養(yǎng)物中細(xì)胞濃度達(dá)到2109個(gè)/ml時(shí)，100ml培養(yǎng)物可得1090mg干重的細(xì)胞。直接法7間接法比濁法：原理是在一定范圍內(nèi)，菌懸液中的細(xì)胞濃

5、度與混濁度成正比，即與光密度成正比，菌數(shù)越多，光密度越大。因此，借助于分光光度計(jì)，在一定波長(zhǎng)下測(cè)定菌懸液的光密度，就可反應(yīng)出菌液的濃度。特點(diǎn)：快速、簡(jiǎn)便；但易受干擾。7生理指標(biāo)法測(cè)含氮量蛋白質(zhì)是細(xì)胞的主要物質(zhì)，含量穩(wěn)定，而氮是蛋白質(zhì)的主要成分，通過(guò)測(cè)含氮量就可推知微生物的濃度。一般細(xì)菌含氮量為干重的12.5%，酵母菌為7.5%，霉菌為6.0%，根據(jù)一定體積培養(yǎng)液中的含氮量再乘以6.25，就可測(cè)得粗蛋白的含量。其他方法含碳、磷、DNA、RNA、耗氧量、消耗底物量、產(chǎn)二氧化碳、產(chǎn)酸、產(chǎn)熱、粘度等，都可用于生長(zhǎng)量的測(cè)定。7各種型號(hào)的全自動(dòng)血球計(jì)數(shù)儀三、計(jì)繁殖數(shù)比例計(jì)數(shù)法血球計(jì)數(shù)板法液體稀釋法平板菌落

6、計(jì)數(shù)法濾膜培養(yǎng)法適于單細(xì)胞狀態(tài)直接法血球計(jì)數(shù)板原理：將1cm20.1mm的薄層空間劃分為400小格，從中均勻分布地選取80或100小格，計(jì)數(shù)其中的細(xì)胞數(shù)目，換算成單位體積中的細(xì)胞數(shù)。血球計(jì)數(shù)板法適用范圍：個(gè)體較大細(xì)胞或顆粒，如血球、酵母菌等。不適用于細(xì)菌等個(gè)體較小的細(xì)胞，因?yàn)椋?）細(xì)菌細(xì)胞太小； （2）不易沉降。特點(diǎn)：快速，準(zhǔn)確，對(duì)酵母菌可同時(shí)測(cè)定出芽率，或在菌懸液中加入少量美藍(lán)可以區(qū)分死活細(xì)胞。間接法平板菌落計(jì)數(shù)法液體稀釋法薄膜過(guò)濾計(jì)數(shù)法平板菌落計(jì)數(shù)法的一般步驟 3.平板菌落計(jì)數(shù)法平板菌落計(jì)數(shù)法技術(shù)要求：樣品充分混勻，操作熟練快速（1520min完成操作），嚴(yán)格無(wú)菌操作；注意事項(xiàng)：每一支吸管

7、只能用于一個(gè)稀釋度，樣品混勻處理，傾注平板時(shí)的培養(yǎng)基溫度；適用范圍：中溫、好氧和兼性厭氧、能在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上生長(zhǎng)的微生物，誤差：多次稀釋造成的誤差是主要來(lái)源，其次還有由于樣品內(nèi)菌體分布不均勻、以及不當(dāng)操作4.液體稀釋法10n10n-210n-1薄膜過(guò)濾計(jì)數(shù)法常用該法測(cè)定含菌量較少的空氣和水中的微生物數(shù)目。將定量的樣品通過(guò)薄膜（硝化纖維素薄膜、醋酸纖維薄膜）過(guò)濾，菌體被阻留在濾膜上，取下濾膜進(jìn)行培養(yǎng)，然后計(jì)算菌落數(shù)，可求出樣品中所含菌數(shù)。第二節(jié) 微生物的生長(zhǎng)規(guī)律由于微生物細(xì)胞極其微小，研究其個(gè)體生長(zhǎng)存在著技術(shù)上的困難。同步生長(zhǎng)的概念：一個(gè)細(xì)胞群體中各個(gè)細(xì)胞都在同一時(shí)間進(jìn)行分裂的狀態(tài)，稱為同步生長(zhǎng)（s

8、ynchronous growth） ，進(jìn)行同步分裂的細(xì)胞稱為同步細(xì)胞。同步細(xì)胞群體在任何一時(shí)刻都處在細(xì)胞周期的同一相，彼此間形態(tài)、生化特征都很一致，因而是細(xì)胞學(xué)、生理學(xué)和生物化學(xué)等研究的良好材料。一、微生物的個(gè)體生長(zhǎng)和同步生長(zhǎng)獲得同步生長(zhǎng)的方法：獲得同步生長(zhǎng)的方法主要有兩類：環(huán)境條件誘導(dǎo)法：變換溫度、光線、培養(yǎng)基等。造成與正常細(xì)胞周期不同的周期變化。選擇法：選擇性過(guò)濾、梯度離心。物理方法，隨機(jī)選擇，不影響細(xì)胞代謝。Helmstetter-Cummings 法原理：一些細(xì)菌細(xì)胞會(huì)緊緊粘附于硝酸纖維微孔濾膜上。步驟：菌懸液通過(guò)微孔濾膜，細(xì)胞吸附其上；反置濾膜，以新鮮培養(yǎng)液通過(guò)濾膜，洗掉浮游細(xì)胞；

9、除去起始洗脫液后就可以得到剛剛分裂下來(lái)的新生細(xì)胞，即為同步培養(yǎng)。二、單細(xì)胞微生物的典型生長(zhǎng)曲線定量描述液體培養(yǎng)基中微生物群體生長(zhǎng)規(guī)律的實(shí)驗(yàn)曲線，稱為生長(zhǎng)曲線。把少量純種單細(xì)胞微生物接種到一定體積的培養(yǎng)液中后，在適宜的條件下培養(yǎng)，如果以細(xì)胞數(shù)目的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，就可以繪制出分批培養(yǎng)條件下微生物的生長(zhǎng)曲線。典型的生長(zhǎng)曲線 （Growth curve）延滯期對(duì)數(shù)期穩(wěn)定期衰亡期將少量單細(xì)胞的純培養(yǎng)，接種到一恒定容積的新鮮液體培養(yǎng)基中，在適宜條件下培養(yǎng)，每隔一定時(shí)間取樣，測(cè)菌細(xì)胞數(shù)目。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以細(xì)菌增長(zhǎng)數(shù)目的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制所得的曲線。生長(zhǎng)曲線的制作其它名稱：停滯期、調(diào)

10、整期、適應(yīng)期（一）延滯期（lag phase）1.現(xiàn)象：菌數(shù)沒(méi)增加，曲線平行于橫軸。2.特點(diǎn)：生長(zhǎng)速率常數(shù)= 0細(xì)胞形態(tài)變大或增長(zhǎng)細(xì)胞內(nèi)RNA特別是rRNA含量增高，原生質(zhì)嗜堿性增強(qiáng)合成代謝活躍（核糖體、酶類、ATP合成加快），易產(chǎn)生誘導(dǎo)酶對(duì)外界不良條件敏感，（如氯化鈉濃度、溫度、抗生素等化學(xué)藥物）3.原因：適應(yīng)新的環(huán)境條件，合成新的酶，積累必要的中間產(chǎn)物菌種 ：繁殖速度較快的菌種的延遲期一般較短；4.影響延滯期長(zhǎng)短的因素：接種物菌齡 ：用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌種接種時(shí)，其延遲期較短，甚至檢查不到延遲期；接種量：一般來(lái)說(shuō)，接種量增大可縮短甚至消除延遲期（發(fā)酵工業(yè)上一般采用1/10的接種量）；培養(yǎng)基成分

11、：在營(yíng)養(yǎng)成分豐富的天然培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的延滯期比在合成培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)短；接種后培養(yǎng)基成分有較大變化時(shí)，會(huì)使延滯期加長(zhǎng)，所以發(fā)酵工業(yè)上盡量使發(fā)酵培養(yǎng)基的成分與種子培養(yǎng)基接近。5.認(rèn)識(shí)延遲期的特點(diǎn)及形成原因?qū)?shí)踐的指導(dǎo)意義在發(fā)酵工業(yè)上需設(shè)法盡量縮短延遲期；采取的縮短lag phase 的措施有：增加接種量； （群體優(yōu)勢(shì)-適應(yīng)性增強(qiáng)） 采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的健壯菌種；調(diào)整培養(yǎng)基的成分，在種子培養(yǎng)基中加入發(fā)酵培養(yǎng)基的某些成分。選用繁殖快的菌種在食品工業(yè)上，盡量在此期進(jìn)行消毒或滅菌（二）對(duì)數(shù)期（logarithmic phase）1.概念：指在生長(zhǎng)曲線中，緊接這延滯期的一段細(xì)胞數(shù)目以幾何級(jí)數(shù)增加，其對(duì)數(shù)與時(shí)間呈直

12、線關(guān)系的時(shí)期。 又稱指數(shù)期。2.特點(diǎn)：生長(zhǎng)速率常數(shù)最大，即代時(shí)最短；細(xì)胞進(jìn)行平衡生長(zhǎng)，菌體大小、形態(tài)、生理特征等比較一致；代謝最旺盛；細(xì)胞對(duì)理化因素較敏感；指數(shù)期生長(zhǎng)的數(shù)學(xué)模型繁殖代數(shù) n=3.322(lgx2-lgx1)生長(zhǎng)速率常數(shù)（R）代時(shí)（G）3.影響指數(shù)期微生物代時(shí)長(zhǎng)短的因素：菌種：大腸桿菌 15 min；金黃色葡萄球菌30min; 結(jié)核分枝桿菌800 min ; 培養(yǎng)基成分：營(yíng)養(yǎng)豐富代時(shí)短。同在37下培養(yǎng)，大腸桿菌 在牛奶中代時(shí)12.5 min，而在肉湯培養(yǎng)基中為17min.培養(yǎng)溫度：溫度對(duì)微生物的生長(zhǎng)速率有明顯影響。營(yíng)養(yǎng)物濃度：一定濃度范圍內(nèi)影響生長(zhǎng)速率和生長(zhǎng)總量。營(yíng)養(yǎng)物濃度對(duì)微生

13、物生長(zhǎng)速率和產(chǎn)量8.0mg/ml6.0mg/ml4.0mg/ml2.0mg/ml1.0mg/ml0.5mg/ml0.2mg/ml0.1mg/ml只最大收獲量受影響生長(zhǎng)速度和最大收獲量受影響時(shí)間細(xì)胞數(shù)或菌體量生長(zhǎng)限制因子：凡是處于較低濃度范圍內(nèi)，可影響生長(zhǎng)速率和菌體產(chǎn)量的營(yíng)養(yǎng)物就稱生長(zhǎng)限制因子。4.應(yīng)用意義：由于此時(shí)期的菌種比較健壯，是增殖噬菌體的最適菌齡；生產(chǎn)上用作接種的最佳菌齡；發(fā)酵工業(yè)上盡量延長(zhǎng)該期，以達(dá)到較高的菌體密度；食品工業(yè)上盡量使有害微生物不能進(jìn)入此期；是生理代謝及遺傳研究或進(jìn)行染色、形態(tài)觀察等的良好材料。又稱：恒定期或最高生長(zhǎng)期（三） 穩(wěn)定期（stationary phase）1

14、.特點(diǎn)：生長(zhǎng)速率常數(shù)為零：新增殖的細(xì)胞數(shù)與老細(xì)胞的死亡數(shù)幾乎相等，微生物的生長(zhǎng)速率處于動(dòng)態(tài)平衡，培養(yǎng)物中的細(xì)胞數(shù)目達(dá)到最高值。積累內(nèi)含物：細(xì)胞分裂速度下降，開(kāi)始積累內(nèi)含物，產(chǎn)芽孢的細(xì)菌開(kāi)始產(chǎn)芽孢。開(kāi)始合成次生代謝產(chǎn)物：對(duì)于發(fā)酵生產(chǎn)來(lái)說(shuō)，一般在穩(wěn)定期的后期產(chǎn)物積累達(dá)到高峰，是最佳的收獲時(shí)期。2.生長(zhǎng)產(chǎn)量常數(shù)（Y，或生長(zhǎng)得率，growth yield）：概念：表示微生物產(chǎn)量與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗之間有規(guī)律的比例關(guān)系。 Y=菌體干重/ 消耗營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度Y=x x0C0 C=x x0C0根據(jù)生長(zhǎng)產(chǎn)量常數(shù)可確定微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需要量如：Y=0.5，表示要得到5g菌體，需某營(yíng)養(yǎng)物（葡萄糖）10g。3.產(chǎn)生原

15、因：營(yíng)養(yǎng)物尤其是生長(zhǎng)限制因子的耗盡；營(yíng)養(yǎng)物的比例失調(diào)，如碳氮比不合適;有害代謝廢物的積累（酸、醇、毒素等）物化條件（pH、氧化還原勢(shì)等）不合適;4.應(yīng)用意義：最佳收獲時(shí)期：發(fā)酵生產(chǎn)形成次生代謝產(chǎn)物的重要時(shí)期（抗生素、氨基酸等），生產(chǎn)上應(yīng)盡量延長(zhǎng)此期，提高產(chǎn)量，措施如下： 補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（補(bǔ)料）調(diào)pH 調(diào)整溫度 促進(jìn)了連續(xù)培養(yǎng)原理的提出和創(chuàng)建。（四） 衰亡期（decline phase）1.特點(diǎn)：2.產(chǎn)生原因：生長(zhǎng)條件的進(jìn)一步惡化，使細(xì)胞內(nèi)的分解代謝大大超過(guò)合成代謝，繼而導(dǎo)致菌體的死亡。 “負(fù)生長(zhǎng)”：細(xì)胞死亡數(shù)增加，死亡數(shù)大大超過(guò)新增殖的細(xì)胞數(shù)，群體中的活菌數(shù)目急劇下降，出現(xiàn)“負(fù)生長(zhǎng)”；細(xì)胞形態(tài)多

16、樣、內(nèi)含物增多：細(xì)胞內(nèi)顆粒更明顯，細(xì)胞出現(xiàn)多形態(tài)、畸形或衰退形，芽孢開(kāi)始釋放；自溶現(xiàn)象：因菌體本身產(chǎn)生的酶及代謝產(chǎn)物的作用，使菌體死亡、自溶等；時(shí)間長(zhǎng)：衰亡期比其他各時(shí)期時(shí)間長(zhǎng)，它的長(zhǎng)短也與菌種和環(huán)境條件有關(guān)。（五）絲狀菌的非典型生長(zhǎng)曲線可分為三個(gè)時(shí)期：生長(zhǎng)延滯期，快速生長(zhǎng)期和生長(zhǎng)衰退期。典型生長(zhǎng)曲線與非典型的絲狀菌生長(zhǎng)曲線兩者差別是：后者缺乏指數(shù)生長(zhǎng)期，與此期相當(dāng)?shù)闹皇桥囵B(yǎng)時(shí)間與菌絲體干重的立方根成直線關(guān)系的一段快速生長(zhǎng)時(shí)期。三、連續(xù)培養(yǎng)（continuous culture）分批培養(yǎng)（batch culture） ：將微生物置于一定容積的定量的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基一次性加入。不再補(bǔ)充和更換

17、，最后一次性收獲。連續(xù)培養(yǎng)（continuous culture） ：在微生物培養(yǎng)的過(guò)程中，不斷地供給新鮮的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)排除含菌體及代謝產(chǎn)物的發(fā)酵液，讓培養(yǎng)的微生物長(zhǎng)時(shí)間地處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，以利于微生物的增殖速度和代謝活性處于某種穩(wěn)定狀態(tài)。理論基礎(chǔ)：由于對(duì)典型生長(zhǎng)曲線中穩(wěn)定期到來(lái)原因的認(rèn)識(shí)，采取相應(yīng)有效措施推遲其來(lái)臨，從而發(fā)展出現(xiàn)在的連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)。當(dāng)微生物在單批培養(yǎng)方式下生長(zhǎng)達(dá)到對(duì)數(shù)期后期時(shí)，一方面以一定的速度流進(jìn)新鮮培養(yǎng)基并攪拌，另一方面以溢流方式流出培養(yǎng)液，使培養(yǎng)物達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，其中的微生物就能長(zhǎng)期保持對(duì)數(shù)期的平衡生長(zhǎng)狀態(tài)和穩(wěn)定的生長(zhǎng)速率。單批培養(yǎng) 恒濁法恒化法 單批培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)時(shí)間連續(xù)流

18、入新鮮培養(yǎng)液lg細(xì)胞數(shù)（個(gè)/ml）連續(xù)培養(yǎng) 連續(xù)培養(yǎng)方法連續(xù)培養(yǎng)器按控制方式分按培養(yǎng)器的級(jí)數(shù)分按細(xì)胞狀態(tài)分按用途分內(nèi)控制（控制菌體密度）：恒濁器外控制（控制培養(yǎng)液流速、以控制生長(zhǎng)速率）：恒化器單級(jí)連續(xù)培養(yǎng)器多級(jí)連續(xù)培養(yǎng)器一般連續(xù)培養(yǎng)器固定化細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)器實(shí)驗(yàn)室科研用：連續(xù)培養(yǎng)器發(fā)酵生產(chǎn)用：連續(xù)發(fā)酵罐連續(xù)培養(yǎng)器連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)恒化連續(xù)培養(yǎng)概念：以恒定流速使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)濃度恒定而保持細(xì)菌生長(zhǎng)速率恒定的方法。原理：通過(guò)控制某一種營(yíng)養(yǎng)物濃度（如碳、氮源、生長(zhǎng)因子等） ，使其始終成為生長(zhǎng)限制因子，而達(dá)到控制培養(yǎng)液流速保持不變，并使微生物始終在低于其最高生長(zhǎng)速率條件下進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖。特點(diǎn)：維持營(yíng)養(yǎng)成分的亞適量，控制

19、微生物生長(zhǎng)速率。菌體生長(zhǎng)速率恒定，菌體均一、密度穩(wěn)定，產(chǎn)量低于最高菌體產(chǎn)量。應(yīng)用范圍：實(shí)驗(yàn)室科學(xué)研究恒化器Chemostat 或bactogen概念：通過(guò)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基流速，使培養(yǎng)液濁度保持恒定的連續(xù)培養(yǎng)方法。連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)恒濁培養(yǎng)原理：通過(guò)調(diào)節(jié)新鮮培養(yǎng)基流入的速度和培養(yǎng)物流出的速度來(lái)維持菌濃度不變,即濁度不變。采用恒濁器，當(dāng)濁度高時(shí)，使新鮮培養(yǎng)基的流速加快，濁度降低，則減慢培養(yǎng)基的流速。特點(diǎn)：基質(zhì)過(guò)量，微生物始終以最高速率進(jìn)行生長(zhǎng)，并可在允許范圍內(nèi)控制不同的菌體密度；但工藝復(fù)雜，煩瑣。使用范圍：用于生產(chǎn)大量菌體、生產(chǎn)與菌體生長(zhǎng)相平行的某些代謝產(chǎn)物，如乳酸、乙醇等。裝置控制對(duì)象培養(yǎng)基培養(yǎng)基流速生長(zhǎng)速

20、率產(chǎn)物應(yīng)用范圍恒濁器菌體密度（內(nèi)控制）無(wú)限制生長(zhǎng)因子不恒定最高大量菌體或與菌體形成相平行的產(chǎn)物生產(chǎn)為主恒化器培養(yǎng)基流速（外控制）有限制生長(zhǎng)因子恒定低于最高不同生長(zhǎng)速率的菌體實(shí)驗(yàn)室為主恒濁器與恒化器的比較連續(xù)發(fā)酵（continuous fermentation）連續(xù)培養(yǎng)在生產(chǎn)上的應(yīng)用，相對(duì)于單批發(fā)酵而言。優(yōu)點(diǎn)：高效，簡(jiǎn)化了操作裝料、滅菌、出料、清洗發(fā)酵罐等單元操作；自控：便于利用各種儀表進(jìn)行自動(dòng)控制；產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定節(jié)約大量動(dòng)力、人力、水和蒸汽，且使水、汽、電的負(fù)荷均衡合理。缺點(diǎn)：菌種易于退化；易于遭到雜菌污染；營(yíng)養(yǎng)物利用率低于單批培養(yǎng)。連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)間受以上因素限制，一般只能維持?jǐn)?shù)月 1年。四、微

21、生物的高密度培養(yǎng)微生物的高密度培養(yǎng)又稱高密度發(fā)酵，一般是指微生物在液體培養(yǎng)中細(xì)胞群體密度超過(guò)常規(guī)培養(yǎng)10倍以上時(shí)的生長(zhǎng)狀態(tài)或培養(yǎng)技術(shù)主要是在用基因工程菌生產(chǎn)多肽類藥物的實(shí)踐中逐漸發(fā)展起來(lái)的。優(yōu)點(diǎn)：提高產(chǎn)物的比生產(chǎn)率；減少培養(yǎng)容器的體積和培養(yǎng)基的消耗；提高下游工程中分離、提取的效率；縮短生產(chǎn)周期；減少設(shè)備投入；降低生產(chǎn)成本。河海大學(xué)第三節(jié) 影響微生物生長(zhǎng)的主要因素微生物與所處的環(huán)境之間具有復(fù)雜的相互影響和相互作用:一方面,各種各樣的環(huán)境因素對(duì)微生物的生長(zhǎng)和繁殖有影響,另一方面,微生物生長(zhǎng)繁殖也會(huì)影響和改變環(huán)境.研究環(huán)境因素與微生物之間的關(guān)系,可以通過(guò)控制環(huán)境條件來(lái)利用微生物有益的一面,同時(shí)防止它

22、有害的一面。影響微生物生長(zhǎng)的外界因素很多，除了前面講過(guò)的營(yíng)養(yǎng)因素之外，還有許多物理化學(xué)條件。 溫度 氧氣 輻射 干燥 滲透壓 超聲波與微波 酸、堿與pH 重金屬及其化合物 表面消毒劑 有機(jī)化合物（酚類、醇類、醛類） 鹵族元素及其化合物 表面活性劑（新潔爾滅、杜滅芬） 染料 抗代謝藥物：磺胺類等 化學(xué)治療劑 抗生素 中草藥有效成分物理因素化學(xué)因素溫度是影響微生物生長(zhǎng)的最重要因素之一。溫度對(duì)微生物的影響具體表現(xiàn)在：一、溫度影響酶活性，溫度變化影響酶促反應(yīng)速率，最終影響細(xì)胞合成。影響細(xì)胞膜的流動(dòng)性，溫度高，流動(dòng)性大，有利于物質(zhì)的運(yùn)輸，溫度低，流動(dòng)性降低，不利于物質(zhì)運(yùn)輸，因此，溫度變化影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸

23、收與代謝產(chǎn)物的分泌。影響物質(zhì)的溶解度，對(duì)生長(zhǎng)有影響。從微生物整體來(lái)看:生長(zhǎng)的溫度范圍一般在-10 100 極端下限為-30 ，極端上限為105300 但對(duì)于特定的某一種微生物：只能在一定溫度范圍內(nèi)生長(zhǎng)，在這個(gè)范圍內(nèi)，每種微生物都有自己的生長(zhǎng)溫度三基點(diǎn)，即最低、最適、最高生長(zhǎng)溫度處于最適生長(zhǎng)溫度時(shí)，生長(zhǎng)速度最快，代時(shí)最短。（一）微生物生長(zhǎng)的三個(gè)溫度基點(diǎn)超過(guò)最低生長(zhǎng)溫度時(shí)，微生物不生長(zhǎng)。超過(guò)最高生長(zhǎng)溫度時(shí)，微生物不生長(zhǎng)，溫度過(guò)高，甚至?xí)劳?。根?jù)微生物的最適生長(zhǎng)溫度的不同，可將微生物劃為：(二)微生物生長(zhǎng)溫度類型低溫型微生物（嗜冷微生物）中溫型微生物（嗜溫微生物）高溫型微生物（嗜熱微生物）低溫型微

24、生物:最適生長(zhǎng)溫度在5-20,主要分布在地球的兩極、冷泉、深海、冷凍場(chǎng)所及冷藏食品中。例：假單孢菌中的某些嗜冷菌在低溫下生長(zhǎng)，常引起冷藏食品的腐敗。嗜冷微生物在低溫下生長(zhǎng)的機(jī)理，目前還不清楚，據(jù)推測(cè)有兩種原因：它們體內(nèi)的酶能在低溫下有效地催化，在高溫下酶活喪失細(xì)胞膜中的不飽和脂肪酸含量高，低溫下也能保持半流動(dòng)狀態(tài)，可以進(jìn)行物質(zhì)的傳遞。 中溫型微生物：最適生長(zhǎng)溫度為2040 ，大多數(shù)微生物屬于此類。室溫型主要為腐生或植物寄生，在植物或土壤中。體溫型主要為寄生，在人和動(dòng)物體內(nèi)。高溫型微生物：最適生長(zhǎng)溫度為50 60 ,主要分布在溫泉、堆肥和土壤中。在高溫下能生長(zhǎng)的原因：酶以及核糖體有較強(qiáng)的抗熱性核

25、酸具有較高的熱穩(wěn)定性（核酸中G+C含量高（tRNA），可提供形成 氫鍵，增加熱穩(wěn)定性 ）。細(xì)胞膜中飽和脂肪酸含量高，較高溫度下能維持正常的液晶狀態(tài)。高溫微生物的特點(diǎn):生長(zhǎng)速度快，合成大分子迅速，可及時(shí)修復(fù)高溫對(duì)其造成的分子損傷。耐高溫菌具應(yīng)用優(yōu)勢(shì)：在減少能源消耗、減少染菌、縮短發(fā)酵周期等方面具重要意義。菌 名生長(zhǎng)溫度發(fā)酵溫度累積產(chǎn)物溫度 （ ） （ ） （ ） Streptococcus thermophilus374737S.lactis3440產(chǎn)細(xì)胞：2530產(chǎn)乳酸：30Streptomyces griseus3728_Corenybacterium pekinense32 3335_Cl

26、ostridium acetobutylicum3733_Penicilium chrysogenum302520以青霉素的生產(chǎn)為例：培養(yǎng)165小時(shí)采用分段控制溫度的方法，其青霉素產(chǎn)量比始終在30 培養(yǎng)提高了14.7%。分段控制方式：05小時(shí)，30 ；540小時(shí)，25 ；40125小時(shí)，20 ；125165小時(shí)，25 。不同生理生化過(guò)程的最適溫度微生物不同生理活動(dòng)要求不同溫度，所以， 最適生長(zhǎng)溫度 發(fā)酵速度快、積累代謝產(chǎn)物多。1、高溫對(duì)微生物的影響高溫下蛋白質(zhì)不可逆變性，膜受熱出現(xiàn)小孔，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)（溶菌）。微生物對(duì)熱的耐受力與以下因素有關(guān):（三）高溫與低溫對(duì)微生物的影響(1)微生物種類及發(fā)育

27、階段 嗜熱菌比其它類型的菌體抗熱有芽孢的細(xì)菌比無(wú)芽孢的菌抗熱微生物的繁殖結(jié)構(gòu)比營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)抗熱性強(qiáng)老齡菌比幼齡菌抗熱(2)微生物對(duì)熱的耐受力還受環(huán)境條件的影響 與培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分有關(guān)培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)含量高時(shí)比較耐熱.與pH 有關(guān) pH適宜時(shí)不易死亡，pH不適宜時(shí)，容易死亡.與水分有關(guān)含水量大時(shí)容易死亡，含水量小時(shí)不容易死亡.與含菌量有關(guān) 含菌量高，抗熱性增強(qiáng)，含菌量低，抗熱性差。與熱處理時(shí)間有關(guān)熱處理時(shí)間長(zhǎng)，微生物易死亡。當(dāng)環(huán)境溫度低于微生物的最適生長(zhǎng)溫度時(shí)，微生物的生長(zhǎng)繁殖停止，當(dāng)微生物的原生質(zhì)結(jié)構(gòu)并未破壞時(shí)，不會(huì)很快造成死亡并能在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持活力，當(dāng)溫度提高時(shí)，可以恢復(fù)正常的生命活動(dòng)。2、低溫

28、對(duì)微生物的影響低溫保藏菌種就是利用這個(gè)原理。一些細(xì)菌、酵母菌和霉菌的瓊脂斜面菌種通?？梢蚤L(zhǎng)時(shí)間地保藏在4的冰箱中。當(dāng)溫度過(guò)低，造成微生物細(xì)胞凍結(jié)時(shí)，有的微生物會(huì)死亡，有些則并不死亡。造成死亡的原因：凍結(jié)過(guò)程造成細(xì)胞脫水。凍結(jié)速度對(duì)冰晶形成有很大影響，緩慢凍結(jié)，形成的冰晶大，對(duì)細(xì)胞損傷大；快速凍結(jié)，形成的冰晶小、分布均勻，對(duì)細(xì)胞的損傷小，因此，利用快速凍結(jié)可以對(duì)一些菌種進(jìn)行凍結(jié)保藏，一般情況下在菌懸液中再加一些甘油、糖、牛奶、保護(hù)劑等可對(duì)菌種進(jìn)行長(zhǎng)期保藏。凍結(jié)時(shí)細(xì)胞水分變成冰晶，冰晶對(duì)細(xì)胞膜產(chǎn)生機(jī)械損傷，膜內(nèi)物質(zhì)外漏。微生物耐熱性大小的幾種表示方法： 熱力致死時(shí)間：在特定的溫度及其它條件下，殺死

29、一定數(shù)量的微生物所需要的時(shí)間 F值：在一定的基質(zhì)中，溫度為121.1，加熱殺死一定數(shù)量微生物所需的時(shí)間. D 值：利用一定溫度進(jìn)行加熱，活菌數(shù)減少一個(gè)對(duì)數(shù)周期（即90%活菌被殺死）所需的時(shí)間. Z值：在加熱致死曲線中，時(shí)間降低一個(gè)對(duì)數(shù)周期（即縮短90%的加熱時(shí)間）所需要升高的溫度滅菌與消毒的概念： 滅菌是指采用強(qiáng)烈的理化因素使任何物體內(nèi)外部的一切微生物永遠(yuǎn)喪失其生長(zhǎng)繁殖能力的措施；消毒是一種采用較溫和的理化因素，僅殺死物體中病原微生物的措施.加熱滅菌和加熱消毒的方法： 干熱滅菌法 火焰滅菌法 干燥加熱空氣滅菌法高溫滅菌 巴氏消毒法 常壓下 煮沸消毒法 濕熱滅菌法 間歇滅菌法 常規(guī)加壓滅菌法 加

30、壓下 (高壓蒸汽滅菌法) 連續(xù)加壓滅菌法影響加壓蒸汽滅菌效果的因素滅菌物體的含菌量滅菌鍋內(nèi)空氣的排除程度滅菌物體的pH值滅菌對(duì)象的體積加熱與散熱的速度高溫對(duì)培養(yǎng)基的影響及其防止措施高溫對(duì)培養(yǎng)基的不利影響： 形成沉淀物（有機(jī)沉淀物如多肽類，無(wú)機(jī)沉淀物如磷酸鹽）；破壞營(yíng)養(yǎng)；提高色澤（褐變?nèi)绠a(chǎn)生氨基糖等）；改變培養(yǎng)基的pH值；降低培養(yǎng)基的濃度消除有害影響的措施 采用特殊的加熱滅菌法 過(guò)濾除菌法 加入螯合劑 微生物對(duì)氧的需要和耐受力在不同的類群中變化很大，根據(jù)微生物與氧的關(guān)系,可把它們分為幾種類群:二、氧氣氧濃度對(duì)不同微生物生長(zhǎng)的影響專性好氧菌（strict aerobe）必須在有分子氧的條件下才能生

31、長(zhǎng)，有完整的呼吸鏈，以分子氧作為最終氫受體，細(xì)胞含有超氧物歧化酶（SOD，superoxide dismutase）和過(guò)氧化氫酶。在有氧或無(wú)氧條件下均能生長(zhǎng)，但有氧情況下生長(zhǎng)得更好，在有氧時(shí)靠呼吸產(chǎn)能，無(wú)氧時(shí)借發(fā)酵或無(wú)氧呼吸產(chǎn)能；細(xì)胞含有SOD和過(guò)氧化氫酶。兼性厭氧菌（facultative aerobe）微好氧菌（microaerophilic bacteria）只能在較低的氧分壓下(0.01-0.03)才能正常生長(zhǎng)，通過(guò)呼吸鏈并以氧為最終氫受體而產(chǎn)能。耐氧菌（aerotolerant anaerobe）可在分子氧存在下進(jìn)行厭氧生活的厭氧菌。生活不需要氧，分子氧也對(duì)它無(wú)毒害。不具有呼吸鏈，依

32、靠專性發(fā)酵獲得能量。細(xì)胞內(nèi)存在SOD和過(guò)氧化物酶，但缺乏過(guò)氧化氫酶。厭氧菌（anaerobe）分子氧對(duì)它有毒害，短期接觸空氣，也會(huì)抑制其生長(zhǎng)甚至致死；在空氣或含有10%CO2的空氣中，在固體培養(yǎng)基表面上不能生長(zhǎng)，只有在其深層的無(wú)氧或低氧化還原電勢(shì)的環(huán)境下才能生長(zhǎng)；生命活動(dòng)所需能量通過(guò)發(fā)酵、無(wú)氧呼吸、循環(huán)光合磷酸化或甲烷發(fā)酵提供；細(xì)胞內(nèi)缺乏SOD和細(xì)胞色素氧化酶，大多數(shù)還缺乏過(guò)氧化氫酶。嚴(yán)格厭氧微生物并不是被氣態(tài)的氧所殺死，而是由于不能解除某些氧代謝產(chǎn)物的毒性而死亡。厭氧菌的氧毒害機(jī)制 SOD學(xué)說(shuō)在氧還原為水的過(guò)程中，可形成某些有毒的中間產(chǎn)物，例如，過(guò)氧化氫（H2O2）、超氧陰離子（ O2 ）等

33、。超氧陰離子為活性氧，兼有分子和離子的性質(zhì)，反應(yīng)力極強(qiáng)，極不穩(wěn)定，可破壞膜和重要生物大分子，對(duì)微生物造成毒害或致死。好氧微生物具有降解這些產(chǎn)物的酶，如過(guò)氧化氫酶、過(guò)氧化物酶、超氧化物歧化酶等，而嚴(yán)格厭氧菌缺乏SOD，故易被生物體內(nèi)極易產(chǎn)生的超氧陰離子自由基毒害致死。各類菌所含對(duì)氧解毒酶專性好氧菌 SOD，過(guò)氧化氫酶 兼性厭氧菌 SOD， 過(guò)氧化氫酶 專性厭氧菌 二種酶均無(wú) 微好氧菌 少量SOD 耐氧菌 SOD， 過(guò)氧化物酶H2O + O22 O2 + 2H+O2 + H2O22H2OO2 + eO2 ( O2 )超氧陰離子在細(xì)胞內(nèi)可由酶促或非酶促形成。超氧物陰離子歧化酶是在生物進(jìn)化中發(fā)展出來(lái)的

34、一種自我保護(hù)方式。兼性厭氧菌E.coli在發(fā)生SOD缺失突變后，就會(huì)變成一種“嚴(yán)格厭氧菌”。生物體中超氧陰離子的形成與去除12SOD好氧生物和耐氧細(xì)菌過(guò)氧化氫酶 好氧生物過(guò)氧化物酶 NADH2NAD耐氧菌在培養(yǎng)不同類型的微生物時(shí)，要采用相應(yīng)的措施保證不同微生物的生長(zhǎng)。培養(yǎng)好氧微生物：需震蕩或通氣，保證充足的氧氣。培養(yǎng)專性厭氧微生物：需排除環(huán)境中的氧氣，同時(shí) 在培養(yǎng)基中添加還原劑，降低 培養(yǎng)基中的氧化還原電位勢(shì)。培養(yǎng)兼性厭氧或耐氧微生物：可深層靜止培養(yǎng)。影響膜表面電荷的性質(zhì)及膜的通透性，進(jìn)而影響對(duì)物質(zhì)的吸收能力。三、pH（一）環(huán)境pH值對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響改變酶活、酶促反應(yīng)的速率及代謝途徑：如：酵

35、母菌在pH4.5-5產(chǎn)乙醇，在 pH6.5以上產(chǎn)甘油、酸。環(huán)境pH值還影響培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的離子化程度，從而影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收，或有毒物質(zhì)的毒性。（二) 不同微生物對(duì)pH要求不同微生物的生長(zhǎng)pH值范圍極廣，從pH8都有微生物能生長(zhǎng)。但絕大多數(shù)種類都生活在pH5.0-9.0之間。微生物生長(zhǎng)的pH值三基點(diǎn)：各種微生物都有其生長(zhǎng)的最低、最適和最高pH值。低于最低、或超過(guò)最高生長(zhǎng)pH值時(shí)，微生物生長(zhǎng)受抑制或?qū)е滤劳觥２煌奈⑸镒钸m生長(zhǎng)的pH值不同，根據(jù)微生物生長(zhǎng)的最適pH值，將微生物分為： 嗜堿微生物：硝化細(xì)菌、尿素分解菌、多數(shù)放線菌 耐堿微生物：許多鏈霉菌 中性微生物：絕大多數(shù)細(xì)菌，一部分真菌 嗜酸

36、微生物：硫桿菌屬 耐酸微生物：乳酸桿菌、醋酸桿菌 微生物種類最低pH最適pH最高pH大腸桿菌枯草芽孢桿菌金黃色葡萄球菌黑曲霉一般放線菌一般酵母菌 4.3 4.5 4.2 1.5 5.0 3.06.08.06.07.57.07.55.06.07.08.05.06.0 9.5 8.5 9.3 9.0 10 8.0 一些微生物生長(zhǎng)的pH值范圍同一種微生物在其不同的生長(zhǎng)階段和不同的生理生化過(guò)程中，對(duì)pH值的要求也不同。在發(fā)酵工業(yè)中，控制pH值尤其重要，舉例：Aspergillus niger在pH22.5范圍時(shí)有利于合成檸檬酸，當(dāng)在pH2.56.5范圍內(nèi)時(shí)以菌體生長(zhǎng)為主，而在pH7.0時(shí)，則以合成草酸

37、為主. 微生物 生長(zhǎng)最適pH 合成抗生素最適pH灰色鏈霉菌6.36.96.77.3紅霉素鏈霉菌6.67.06.87.3產(chǎn)黃青霉6.57.26.26.8金霉素鏈霉菌6.16.65.96.3龜裂鏈霉菌6.06.65.86.1灰黃青霉6.47.06.26.5生長(zhǎng)的最適pH值與發(fā)酵的最適pH值同一種微生物在不同的生長(zhǎng)階段和不同生理生化過(guò)程中，對(duì)環(huán)境pH值要求不同。例如：丙酮丁醇梭菌 在pH值=5.57.0時(shí)，以菌體生長(zhǎng)為主 在pH值=4.35.3時(shí)，進(jìn)行丙酮丁醇發(fā)酵同一種微生物由于環(huán)境pH值不同，可能積累不同的代謝產(chǎn)物。例如：黑曲霉pH值=23時(shí)，產(chǎn)物以檸檬酸為主，只產(chǎn)少量草酸。pH值在7左右時(shí)，產(chǎn)物

38、以草酸為主，只產(chǎn)少量檸檬酸。（三）微生物細(xì)胞內(nèi)的pH值雖然微生物生活的環(huán)境pH值范圍較寬，但是其細(xì)胞內(nèi)的pH值卻相當(dāng)穩(wěn)定，一般都接近中性。這種維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定中性pH值的特性能夠保持細(xì)胞內(nèi)各種生物活性分子的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和細(xì)胞內(nèi)酶所需要的最適pH值。微生物胞內(nèi)酶的最適pH值一般為中性，胞外酶的最適pH值接近環(huán)境pH值。（四）微生物的生命活動(dòng)對(duì)環(huán)境pH值的影響微生物在生長(zhǎng)過(guò)程中也會(huì)使外界環(huán)境的pH值發(fā)生改變，原因：由于有機(jī)物分解：分解糖類、脂肪等，產(chǎn)生酸性物質(zhì)，使培養(yǎng)液pH值下降；分解蛋白質(zhì)、尿素等，產(chǎn)生堿性物質(zhì)，使培養(yǎng)液pH值上升由于無(wú)機(jī)鹽選擇性吸收：銨鹽吸收（(NH4)2SO4 H2SO4）， pH

39、硝酸鹽吸收(NaNO3 NaOH)， pH培養(yǎng)過(guò)程中調(diào)節(jié)pH值的措施過(guò)酸時(shí)：加入堿或適量氮源，提高通氣量。過(guò)堿時(shí)：加入酸或適量碳源，降低通氣量。NH4+被吸收NO3+被吸收配制培養(yǎng)基時(shí)調(diào)整pH值的措施：（五）酸堿添加劑的抑菌機(jī)理無(wú)機(jī)酸：與H+濃度成正比的高氫離子濃度，可引起菌體表面蛋白的變性和核酸的水解，并破壞酶類的活性有機(jī)酸：與不電離的部分成正比,故有時(shí)有機(jī)酸的抑菌效果無(wú)機(jī)酸。作為食品防腐劑的有機(jī)酸如苯甲酸和水楊酸可與微生物細(xì)胞中的成分發(fā)生氧化作用，從而抑制微生物的生長(zhǎng)。堿類物質(zhì)：強(qiáng)堿可引起蛋白質(zhì)、核酸大分子變性、水解，以殺死或抑制微生物。食品工業(yè)中常用石灰水、NaOH、Na2CO3等作為機(jī)

40、器、工具以及冷藏庫(kù)的消毒劑。幾種常用表面消毒劑及其應(yīng)用表面消毒劑：對(duì)一切活細(xì)胞都有毒性，不能用作活細(xì)胞內(nèi)化學(xué)治療用的化學(xué)藥劑類型名稱及使用濃度作用機(jī)制應(yīng)用范圍重金屬鹽0.05-0.1%升汞 0.1-1%AgNO3使蛋白質(zhì)變性非金屬物品，器皿皮膚，滴新生兒眼睛酚類3-5%石炭酸2%煤酚皂（來(lái)蘇兒）蛋白質(zhì)變性，損傷細(xì)胞膜地面、家具、器皿皮膚醇類70-75%乙醇蛋白變性、脫水、溶脂皮膚、器械醛類0.5-10%甲醛蛋白質(zhì)變性物品消毒、接種室熏蒸氧化劑0.1%KMnO4蛋白質(zhì)變性皮膚、尿道、水果蔬菜鹵素及其化合物0.2-0.5mg/L氯氣10-20%漂白粉0.5-1%漂白粉2.5%碘酒破壞細(xì)胞膜、酶、蛋

41、白質(zhì)蛋白質(zhì)變性飲水、游泳池水地面、廁所飲水、空氣、體表皮膚表面活性劑0.05-0.1%新潔爾滅破壞膜及蛋白質(zhì)、皮膚、黏膜、手術(shù)器械染料2-4%龍膽紫蛋白質(zhì)變性皮膚、傷口四 輻射不同波長(zhǎng)的射線對(duì)微生物的作用不同，可見(jiàn)光部分（400-800納米）往往能被某些光合微生物所利用，而波長(zhǎng)較短的紫外線（13.6-400納米）、X-射線（0.06-13.6納米）、r-射線（0.01-0.14納米）均可抑制甚至殺死微生物。尤其是r-射線因作用距離較遠(yuǎn)、穿透力較強(qiáng)而用于食品的殺菌保藏。物理殺菌：一類新的冷殺菌技術(shù)，它在克服熱殺菌不足之處的基礎(chǔ)上，運(yùn)用物理手段如電場(chǎng)、高壓、電子、光等的單一或兩種以上的共同作用，在

42、低溫或常溫下達(dá)到殺菌的目的。這種方法不須向食品中加入化學(xué)物質(zhì)，不會(huì)使菌體產(chǎn)生抗性，且條件易于控制，在保持食品自然風(fēng)味的基礎(chǔ)上，殺菌效果明顯。常用的物理殺菌的方法有超高壓脈沖電場(chǎng)殺菌、脈沖強(qiáng)光殺菌、半導(dǎo)體光催化殺菌，輻射殺菌。五 干燥（濕度）水分約占微生物細(xì)胞組成的70-85%，環(huán)境中缺水時(shí)（干燥的環(huán)境）引起微生物細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的變性和鹽類濃度的增高，抑制微生物的生長(zhǎng)，甚至造成微生物的死亡。干燥對(duì)微生物的作用受環(huán)境溫度、失水速度、菌齡、微生物所處基質(zhì)等條件的影響。干燥用于食品保藏的方法可分為兩類，即自然干燥（熏干、曬干、冷凍干燥）和人工干燥（常壓干燥如熱風(fēng)、噴霧、凍結(jié)、微波等；真空干燥如真空和冷凍

43、真空干燥）六 滲透壓微生物生長(zhǎng)與滲透壓的關(guān)系（高滲透壓、低滲透壓對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響）根據(jù)微生物對(duì)高滲透壓耐性的不同，將其分為以下三類 高度嗜鹽細(xì)菌（20-30%食鹽溶液中生長(zhǎng)） 嗜鹽細(xì)菌 中等嗜鹽細(xì)菌（5-18%的食鹽溶液中生長(zhǎng)） 低嗜鹽細(xì)菌（2-5%的食鹽溶液中生長(zhǎng)） 耐鹽細(xì)菌（可在10%以下的食鹽溶液中生長(zhǎng)） 耐糖細(xì)菌（可在60%以下的含糖高滲溶液中生長(zhǎng)）* 普通微生物一般在0.85-0.90的食鹽溶液中生長(zhǎng)河海大學(xué)第四節(jié) 微生物培養(yǎng)法概論培養(yǎng)微生物是研究和應(yīng)用微生物的基礎(chǔ)。一個(gè)良好的微生物培養(yǎng)裝置的基本條件：按微生物的生長(zhǎng)規(guī)律進(jìn)行科學(xué)的設(shè)計(jì)，在能提供豐富而均勻營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的基礎(chǔ)上，保證微生物

44、獲得適宜的溫度和良好的通氣條件（厭氧菌除外），為微生物提供一個(gè)適宜的物理化學(xué)條件和嚴(yán)防雜菌的污染。微生物培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展少量大規(guī)模淺深固體液體靜動(dòng)單批連續(xù)游離固定化從微生物到動(dòng)植物細(xì)胞野生菌工程菌單菌混菌低密度高密度人工自動(dòng)一、實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)法（一）固體培養(yǎng)法1、好氧菌的固體培養(yǎng)法：試管斜面、瓊脂平板等。2、厭氧菌的固體培養(yǎng)：需要特殊的培養(yǎng)裝置或器皿，要配制特殊的培養(yǎng)基，加入適當(dāng)?shù)倪€原劑，必要時(shí)要加入刃天青等氧化還原勢(shì)指示劑。具體培養(yǎng)方法有：高層瓊脂柱、厭氧培養(yǎng)皿、亨蓋特滾管技術(shù)、厭氧罐和厭氧培養(yǎng)箱。（二）液體培養(yǎng)法1、好氧菌的液體培養(yǎng)：氧的供應(yīng)是好氧菌生長(zhǎng)、繁殖的限制因子。在培養(yǎng)中要保持培養(yǎng)液較高

45、的溶解氧濃度。具體培養(yǎng)方法有：試管液體培養(yǎng)、三角瓶淺層液體培養(yǎng)、搖瓶培養(yǎng)和臺(tái)式發(fā)酵罐等。2、厭氧菌的液體培養(yǎng)：厭氧罐或厭氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)；好氧環(huán)境中加入巰基乙酸、半胱氨酸、維生素C等有機(jī)還原劑或鐵絲等無(wú)機(jī)還原劑，在培養(yǎng)基上封一層石蠟油或凡士林-石蠟油。Brewer 皿.高層瓊脂柱亨蓋特技術(shù)Anaerobic Glove Box厭氧手套箱Batch & Continuous culture1 L - 1000L二、生產(chǎn)實(shí)踐中培養(yǎng)微生物的裝置（一）固態(tài)培養(yǎng)法1、好氧菌的曲法培養(yǎng)：原始的曲法培養(yǎng)就是將麩皮、碎麥或豆餅等固態(tài)基質(zhì)經(jīng)蒸煮和自然接種后，薄薄地鋪在培養(yǎng)容器表面，使微生物即可獲得充足的揚(yáng)棄，又有利

46、于散發(fā)熱量，還十分有利于真菌產(chǎn)生孢子。根據(jù)制曲容器的形狀和生產(chǎn)規(guī)模的大小，可把制曲方法分成瓶曲、袋曲、盤曲、簾子曲、轉(zhuǎn)鼓曲和通風(fēng)曲等。通風(fēng)曲是一種機(jī)械化程度和生產(chǎn)效率都很高的現(xiàn)代大規(guī)模制曲技術(shù)，在我國(guó)醬油釀造業(yè)中廣泛應(yīng)用。2、厭氧菌的堆積培養(yǎng)法生產(chǎn)實(shí)踐上對(duì)厭氧菌進(jìn)行大規(guī)模固態(tài)培養(yǎng)的例子還不多見(jiàn)。我國(guó)的傳統(tǒng)白酒生產(chǎn)中，采用大型深層地窖對(duì)固態(tài)發(fā)酵料進(jìn)行堆積式固態(tài)發(fā)酵，這對(duì)酵母菌的酒精發(fā)酵和己酸菌的己酸發(fā)酵等都十分有利，因此可生產(chǎn)名優(yōu)大曲酒（蒸餾白酒）。（二）液體培養(yǎng)法1、好氧菌的培養(yǎng)淺盤培養(yǎng)深層液體通氣培養(yǎng)：發(fā)酵罐通風(fēng)曲槽結(jié)構(gòu)模式圖 1.天窗，2.曲室，3.風(fēng)道，4.曲槽，5.曲料，6.篦架，7.

47、鼓風(fēng)機(jī)，8.電動(dòng)機(jī) 機(jī)械攪拌通風(fēng)發(fā)酵罐的構(gòu)造及其運(yùn)轉(zhuǎn)原理 好氧菌的曲法培養(yǎng)酒曲的分類現(xiàn)代大致將酒曲分為五大類，分別用于不同的酒。它們是： 麥曲，主要用于黃酒的釀造；小曲，主要用于黃酒和小曲白酒的釀造；紅曲，主要用于紅曲酒（黃酒的一個(gè)品種）的釀造；大曲，用于蒸餾酒的釀造。麩曲，這是現(xiàn)代才發(fā)展起來(lái)的，用純種霉菌接種以麩皮 為原料的培養(yǎng)物?？捎糜诖娌糠执笄蛐∏?。目前麩曲法白酒是我國(guó)白酒生產(chǎn)的主要操作法之一。其白酒產(chǎn)量占總產(chǎn)量的70%以上。 掛曲大曲的一種小曲紅曲近代人工踏制大曲A whole process of DA-QU prepation用米粉制成 用蒸熟的米飯制成 第五節(jié) 有害微生物的控

48、制廣東海洋大學(xué)一、幾個(gè)基本概念滅菌（sterilization）采用強(qiáng)烈的理化因素使任何物體內(nèi)外部的一切微生物永遠(yuǎn)喪失其生長(zhǎng)繁殖能力的措施，稱為滅菌。消毒（disinfection）采用較溫和的理化因素，僅殺死物體表面或內(nèi)部的一部分對(duì)人體有害的病原菌，而對(duì)被處理物體基本無(wú)害的措施，稱為消毒。防腐（antisepsis）利用理化因素完全抑制霉腐微生物的生長(zhǎng)繁殖，從而達(dá)到防止物品發(fā)生霉腐的措施，稱為防腐?；煟╟hemotheraphy）即化學(xué)治療。利用具有高度選擇毒力的化學(xué)物質(zhì)抑制宿主體內(nèi)病原微生物的生長(zhǎng)繁殖，以達(dá)到治療該傳染病的一種措施。高溫滅菌（消毒）法是最常用的物理方法。高溫可引起蛋白質(zhì)、

49、核酸等活性大分子氧化或變性失活而導(dǎo)致微生物死亡。 二、消毒滅菌火焰灼燒法烘箱熱空氣滅菌法干熱滅菌法巴氏消毒法煮沸消毒法間歇滅菌法高壓蒸汽滅菌法高溫滅菌（消毒）法（一）消毒滅菌的種類濕熱滅菌（消毒）法連消法高溫滅菌多數(shù)細(xì)菌，酵母菌和霉菌的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和病毒在50-65 10 min可以致死。一般噬菌體6580 致死， 放線菌霉菌的孢子比營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞抗熱性強(qiáng)，7680 10min可以殺死細(xì)菌芽孢，在120 下20min才能致死， 嗜熱脂肪芽孢桿菌可在80 條件下生活，在120 ，12min才能殺死。同種微生物老齡菌比幼菌耐熱。 干熱滅菌法（dry heat sterilization）焚燒法（incine

50、ration）：是將被滅菌物品在火焰中燃燒，使所有的生物質(zhì)碳化。簡(jiǎn)單、徹底，但對(duì)被滅菌物品的破壞極大。適用于無(wú)經(jīng)濟(jì)價(jià)值的物品滅菌，及不怕燒的實(shí)驗(yàn)器具，如接種環(huán)、鑷子、試管或三角瓶口的滅菌等。常用于廢棄物、動(dòng)物尸體等處理.干燥熱空氣滅菌法(hot-air oven)：將物品放入烘箱內(nèi)，然后升溫至150170 ，維持12小時(shí)。適用于玻璃、陶瓷和金屬物品的滅菌，不適合液體樣品，及棉花、紙張、纖維和橡膠類物質(zhì)的滅菌。特點(diǎn)：由于空氣傳熱穿透力差，菌體在脫水狀態(tài)下不易殺死，所以溫度高、時(shí)間長(zhǎng)。濕熱法(moist heat sterilization) ：特點(diǎn)：溫度低、時(shí)間短、滅菌效果高原因： 1) 菌體內(nèi)

51、含水量越高，則凝固溫度越低； 2) 蒸汽冷凝會(huì)放出潛熱； 3) 飽和水蒸汽穿透力強(qiáng)； 4) 濕熱易破壞細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)大分子的穩(wěn)定 性，主要破壞氫鍵結(jié)構(gòu)。種類：巴氏消毒法、煮沸消毒法、間歇滅菌法、高壓蒸汽滅菌法和連消法。高壓蒸汽滅菌法利用水的沸點(diǎn)隨水蒸氣壓力的增加而上升，以達(dá)到100 以上高溫滅菌的方法。 方法：121（1kg/cm2或15磅/英寸2）維持15-20min。 112（0.5kg/cm2或8磅/英寸2）20-30min。 115（0.75kg/cm2或11磅/英寸2）20-30min。應(yīng)根據(jù)滅菌物品的性質(zhì)或成分選擇滅菌溫度例如：生理鹽水、營(yíng)養(yǎng)瓊脂等培養(yǎng)基用121 。 含葡萄糖、乳糖、

52、氨基酸等培養(yǎng)基用112 。適用：耐高溫物品，玻璃儀器、含水或不含水物品。 高 壓 蒸 汽 滅 菌 鍋?zhàn)⒁馐马?xiàng)：排凈冷空氣； 滅菌終了，緩慢降壓； 滅菌結(jié)束，趁熱取出物品。間歇滅菌法：方法：將待滅菌物品在80-100蒸煮15-60min，冷卻后擱置室溫（28-37）下過(guò)夜，并重復(fù)以上過(guò)程三遍以上。其蒸煮過(guò)程可殺死微生物的營(yíng)養(yǎng)體，但不能殺死芽胞，室溫過(guò)夜促使殘留的芽孢萌發(fā)成營(yíng)養(yǎng)體，再經(jīng)蒸煮過(guò)程可殺死新的營(yíng)養(yǎng)體；循環(huán)三次以上可保證徹底滅菌的目的。應(yīng)用：適用于不耐高溫的物品滅菌，如不適于高壓滅菌的特殊培養(yǎng)基、一些藥品的滅菌。缺點(diǎn)：麻煩、費(fèi)時(shí)。煮沸消毒法將水加熱至100，煮沸15min30min，可殺死

53、所有營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和部分芽孢，達(dá)到消毒的目的。如飲用水，一些金屬器械。巴斯德消毒法（Pasteurization）：用較低的溫度來(lái)殺死其中的病源微生物，這樣既保持食品的營(yíng)養(yǎng)風(fēng)味，又進(jìn)行了消毒.該法一般是將待消毒的液體食品置于62處理30min，然后迅速冷卻。即可達(dá)到消毒目的。如牛奶、啤酒。低溫長(zhǎng)時(shí)法(Low temperature long time,LTLT)；62.930min處理牛奶高溫瞬時(shí)法（High temperature short time, HTST): 71.615s處理牛奶超高溫巴斯德滅菌法(Ultrapasteurization):讓液體食品停留在140左右3-4s，急劇冷卻至

54、75，經(jīng)勻質(zhì)化后冷卻至20。連消法（continuous autoclaving）：也叫連續(xù)加壓蒸氣滅菌法方法：讓培養(yǎng)基在管道的流動(dòng)過(guò)程中快速升溫、維持和冷卻，然后流進(jìn)發(fā)酵罐。培養(yǎng)基一般加熱至135140 下維持515s。優(yōu)點(diǎn)： 1)徹底滅菌，同時(shí)有效減少了營(yíng)養(yǎng)成分的破壞，提高了原料的利用率和發(fā)酵產(chǎn)品的質(zhì)量和產(chǎn)量； 2)縮短了滅菌時(shí)間，提高了發(fā)酵罐的利用率； 3)蒸氣負(fù)荷均衡，提高了鍋爐利用效率； 4)適宜自動(dòng)化操作。應(yīng)用：大型發(fā)酵廠的大批培養(yǎng)基滅菌。利用溫度進(jìn)行殺菌的定量指標(biāo)有熱死時(shí)間：指在某一溫度下，殺死某微生物的水懸浮液群體所需的最短時(shí)間。例如，E. coli在60下為10min，Sal

55、monella typhi在58下為30min。熱死溫度：又稱熱死點(diǎn)，指在一定時(shí)間內(nèi)（一般為10min）殺死某微生物的水懸浮液群體所需的最低溫度。如根瘤土壤桿菌為53 。（二）影響加壓蒸氣滅菌效果的因素1、滅菌物體含菌量2、滅菌鍋內(nèi)空氣排除程度3、滅菌對(duì)象的pH：pH在6.08.0時(shí)微生物不易死亡4、滅菌對(duì)象的體積：影響熱傳導(dǎo)速率和熱容量5、加熱與散熱速度（三）高溫對(duì)培養(yǎng)基的影響及其防止措施高溫對(duì)培養(yǎng)基的不利影響：會(huì)產(chǎn)生混濁或形成不溶性沉淀營(yíng)養(yǎng)成分被破壞（ PO4-3存在，葡萄糖生成酮糖，菌不利用）；色澤加深（褐變?nèi)绠a(chǎn)生氨基糖等）；改變培養(yǎng)基的pH值（通常下降0.2） ；形成有害物質(zhì)，抑制微生

56、物生長(zhǎng)；消除有害影響的措施 采用特殊的加熱滅菌法 過(guò)濾除菌法 加入螯合劑、氣體滅菌劑（環(huán)氧乙烷）過(guò)濾作用過(guò)濾作用紫外線（非電離輻射）殺菌機(jī)制： 誘導(dǎo)核酸形成胸腺嘧啶二聚體，從而干擾了核酸的復(fù)制輻射 低溫：利用4以下的各種低溫以保藏食物、藥品、菌種等。缺氧：在密閉容器中加入除氧劑，如鐵粉。真空保藏也是比較常用的方法。干燥：采用曬干或紅外線干燥保藏糧食、食品等，或在密封條件下用吸濕劑也可達(dá)到防霉作用。高滲：通過(guò)鹽漬或糖漬達(dá)到高滲。高酸度：如泡菜、酸菜等。防腐劑：苯甲酸、山梨酸、脫氫醋酸等三、防腐的措施控制微生物的化學(xué)物質(zhì)(因素)四、化學(xué)殺菌劑、消毒劑和治療劑（一）表面消毒劑抗代謝物抗生素（二）化學(xué)

57、治療劑溶液狀態(tài)氣體狀態(tài)生物藥物素評(píng)價(jià)抗菌化學(xué)物質(zhì)的藥效和毒性時(shí)，經(jīng)常使用以下3種指標(biāo)：最低抑制濃度（MIC）：在一定條件下，某化學(xué)藥劑抑制特定微生物的最低濃度；半致死劑量（LD50）：在一定條件下，某化學(xué)藥劑能殺死50%試驗(yàn)動(dòng)物時(shí)的劑量；最低致死劑量（MLD）：在一定條件下，某化學(xué)藥物能引起試驗(yàn)動(dòng)物群體100%死亡的最低劑量。消毒劑:可以抑制或殺滅微生物，但對(duì)人體也可能產(chǎn)生有害作用的化學(xué)試劑.主要用于抑制或殺滅物體表面、器械、排泄物和環(huán)境中的微生物；不能用作活細(xì)胞或機(jī)體治療用的化學(xué)藥劑。防腐劑:可以抑制或阻止微生物生長(zhǎng)，但對(duì)人體或動(dòng)物體的毒性較低的化學(xué)藥劑.用于肌體表面，如皮膚、粘膜、傷口等處防止感染，也有的用于食品、飲料、藥品的防腐作用。但現(xiàn)時(shí)消毒劑和防腐劑界限并不很嚴(yán)格.（一）消毒劑和防腐劑消毒防腐劑的作用機(jī)理一般有下列三種方式:使微生物蛋白質(zhì)凝固變性,發(fā)生沉淀.如酒精等.破壞菌體的酶系統(tǒng),影響菌體代謝.如過(guò)氧化氫等.降低微生物表面張力,增加細(xì)胞膜的通透性,使細(xì)胞發(fā)生破裂或溶解.如來(lái)蘇兒等酚類物質(zhì).種類：酸和堿 ；重金屬及其鹽類；氧化劑；有機(jī)化合物；鹵素及化合物；染色劑；表面活性劑。 類型 名稱及使用方法 作用原理 應(yīng)用范圍醇類70%75%乙醇脫水、蛋白質(zhì)變性皮膚、器皿醛類0.5%10%甲醛2%戊二醛