FISH檢測(cè)標(biāo)本要求課件

1、FISH技術(shù)在腫瘤病理診斷及腫瘤分子靶點(diǎn)治療中的應(yīng)用中山大學(xué)腫瘤防治中心分子病理診斷實(shí)驗(yàn)室王芳 邵建永 細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù) 原理：通過熒光標(biāo)記的DNA探針與細(xì)胞核內(nèi)的DNA 靶序列雜交 觀察：熒光顯微鏡 原位觀察（細(xì)胞、組織）細(xì)胞核 彩色探針信號(hào) 目的：獲得細(xì)胞內(nèi)多條染色體(或染色體片段)或多種 基因狀態(tài)的信息。Fluorescence in situ hybridization（FISH）用已知的標(biāo)記單鏈核酸為探針，按照堿基互補(bǔ)的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進(jìn)行異性結(jié)合，形成可被檢測(cè)的雜交雙鏈核酸。由于DNA分子在染色體上是沿著染色體縱軸呈線性排列，因而可以探針直接與染色體進(jìn)行雜交從而將特定

2、的基因在染色體上定位熒光標(biāo)記探針探針變性樣本DNA變性雜交原理FISH技術(shù)的特點(diǎn)操作簡(jiǎn)便，探針標(biāo)記后穩(wěn)定，可與多種技術(shù)結(jié)合， 可成功地幫助細(xì)胞遺傳學(xué)家做出回顧性分析方法敏感，能迅速得到結(jié)果，24小時(shí)就可以完成檢測(cè)標(biāo)本來源豐富，間期細(xì)胞，分裂中期細(xì)胞、分化或未分化細(xì)胞及死亡或存活的細(xì)胞皆可以被檢測(cè)centromeretelomere subtelomerelocusspecificwhole chromosome paintCSP探針：染色體著絲粒探針GLP探針：位點(diǎn)特異性探針 WPP探針：全染色體或染色體區(qū)域特異性探針FISH探針的種類操作流程簡(jiǎn)圖制片 預(yù)處理 FISH結(jié)果分析 破壞細(xì)胞膜利于

3、探針 雜交。 蛋白酶消化、HCl處理 變性 雜交 洗滌 復(fù)染FISH技術(shù)在乳腺癌檢測(cè)中的應(yīng)用乳腺癌 Her-2基因 致癌基因：Her-2基因； 位點(diǎn)：17q11.2-q12； 編碼蛋白：跨膜蛋白（與 表皮生長(zhǎng)因子受體部分同源）； 25-30%乳腺癌病人都有HER-2的擴(kuò)增； HER-2基因擴(kuò)增是決定Herceptin治療是否有效的關(guān)鍵性指標(biāo)。Her-2基因的檢測(cè)方法檢測(cè)方法檢測(cè)指標(biāo)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)IHCHer-2蛋白費(fèi)用低光鏡即可觀察結(jié)果準(zhǔn)確性差，主觀性強(qiáng)，假陽性率高CISHHer-2 DNA光鏡即可觀察結(jié)果對(duì)低度擴(kuò)增及染色體非整倍擴(kuò)增檢測(cè)靈敏度下降FISHHer-2 DNA對(duì)于低倍、高倍染色體非整倍

4、性擴(kuò)增檢測(cè)準(zhǔn)確性高，靈敏度特異性好，結(jié)果判斷客觀相對(duì)費(fèi)用較高疾病名稱檢測(cè)探針標(biāo)記顏色探針定位探針名稱乳腺癌GLP Her2 / CSP17 紅/綠Her2： 17q11.2-q12CSP17:17p11.1q11.1 CSP17:17號(hào)染色體著絲粒正常: 2紅/2綠異常: 紅信號(hào)大于2為異常細(xì)胞(綠色信號(hào)不少于2個(gè)的細(xì)胞)Her-2基因FISH 探針組DAPI染色后與HE切片對(duì)比圖觀察浸潤(rùn)部分導(dǎo)管內(nèi)癌結(jié)果判斷統(tǒng)計(jì)Ratio值（計(jì)數(shù)浸潤(rùn)性部分的20個(gè)細(xì)胞） Ratio值20個(gè)細(xì)胞核中紅信號(hào)總數(shù)/綠信號(hào)總數(shù) Ratio1.8 為陰性結(jié)果 Ratio2.2或眾多信號(hào)連接成簇時(shí)可不計(jì)算為陽性結(jié)果 比值

5、24為低度擴(kuò)增 410為中度擴(kuò)增 10為高度擴(kuò)增Ratio在1.8-2.2 之間時(shí)，則需要再計(jì)數(shù)20個(gè)細(xì)胞核中 的信號(hào)。如仍為臨界值，則應(yīng)在FISH檢測(cè)報(bào)告中注明。 A. 無須計(jì)數(shù)的大簇團(tuán)信號(hào)（高度擴(kuò)增）B. 顆粒狀信號(hào)（R10，高度擴(kuò)增）C. 須計(jì)數(shù)的顆粒狀信號(hào)（R=3.5，低度擴(kuò)增）ACBHer-2基因擴(kuò)增狀況Her-2基因無擴(kuò)增情況紅信號(hào)數(shù)2，同時(shí)綠信號(hào)非整倍體R30%的腫瘤細(xì)胞全部的細(xì)胞膜高強(qiáng)度著色免疫組化（3+）與FISH對(duì)比圖 40100住院號(hào)：177319浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌級(jí)IHC：+FISH：呈簇團(tuán)狀高度擴(kuò)增100免疫組化（2+）與FISH對(duì)比圖 1.30%的腫瘤細(xì)胞全部的細(xì)胞膜弱至

6、中等著色40住院號(hào)：175465浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌級(jí)IHC：+FISH：Ratio5，中度擴(kuò)增100免疫組化（2+）與FISH對(duì)比圖 2.30%的腫瘤細(xì)胞全部的細(xì)胞膜弱至中等著色40100住院號(hào)：176921浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌級(jí)IHC：+FISH：Ratio1.45，無擴(kuò)增30%的腫瘤細(xì)胞弱的著色免疫組化（1+）與FISH對(duì)比圖140100住院號(hào)：175689浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌級(jí)IHC：+FISH： Ratio1.62，無擴(kuò)增免疫組化（1+）與FISH對(duì)比圖240100住院號(hào)：175895浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌級(jí)IHC：+FISH：簇狀擴(kuò)增30%的腫瘤細(xì)胞弱的著色免疫組化（）與FISH對(duì)比圖110040住院號(hào)：17684

7、6浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌級(jí)IHC：FISH： Ratio1.02， Her2基因無擴(kuò)增7%的細(xì)胞出現(xiàn)黃色融合信號(hào)病例1：會(huì)診84363，男，74y 腹腔腫物；FISH：54%的細(xì)胞可見融合信號(hào)； 診斷：FL。440100病例2：會(huì)診84362，女、36 頸部腫物 抗炎治療后（出現(xiàn)變性壞死） 診斷：DLBCL FISH：陽性，10%的細(xì)胞可見融合信號(hào) 40IHC:BCL2100 t (8;14) (q24;q32) 染色體易位意義： t (8;14)易位后形成的IGH/MYC基因能編碼完整MYC蛋 白，IGH基因附近的增強(qiáng)子使MYC過表達(dá)應(yīng)用范圍： 所有Burkitt淋巴瘤都有t (8;14)易位 診斷不

8、典型Burkitt淋巴瘤須有t (8;14)易位的MYC異?？梢娪诶^發(fā)于濾泡性淋巴瘤的前驅(qū)B淋巴母細(xì)胞白血病/ 淋巴瘤MYC8q24 region14q32 regionC regionV regionV regionC regionIGH/MYC, CEP8 Tri Color, Dual Fusion Translocation Probe 探針雜交示意圖正常細(xì)胞核IGH/MYC, CEP8 三色雙融合易位探針雜交后顯示2R2G2A信號(hào)檢測(cè)探針標(biāo)記顏色探針定位 LSI IGH green 14q32 LSI MYC orange 8q24 CEP 8 aqua 8p11.1-q11.1正常

9、:2G/2O/2A異常:1G/1R/2F/1A或2A腫瘤細(xì)胞核IGH/MYC 雙色雙融合易位探針雜交后顯示1O1G2F信號(hào)1040病例3: 399318，女、5y 頸淋巴結(jié)活檢； ISH: EBERs（+）； FISH:45%的細(xì)胞可見融合信號(hào)； 診斷：散發(fā)性經(jīng)典型BL。病例4: 405618，女，21y盆腔腫物穿刺； ISH: EBERs（+）； FISH: 23%的細(xì)胞可見融合信號(hào)； 診斷：考慮為散發(fā)性經(jīng)典型BL。440 活檢穿刺標(biāo)本病例5:399625，男、42y ISH:EBERs（-）； 經(jīng)多學(xué)科大會(huì)診； 診斷：較符合散發(fā)性非典型BL； FISH: 25%的細(xì)胞可見融合信號(hào)； 440

10、 活檢穿刺標(biāo)本t (11; 14)(q13;q32)染色體易位意義 t (11;14)易位后形成IGH/CCND1基因，IgH基因附近的增 強(qiáng)子使 Cyclin D1過表達(dá)應(yīng)用范圍 套細(xì)胞淋巴瘤的診斷性指標(biāo) 也出現(xiàn)過零星其它淋巴瘤t (11;14)易位的檢出IGH/CCND1Dual Color, Dual Fusion Translocation Probe 11q13 region14q32 regionC regionV regionJ chain簡(jiǎn)潔示意圖探針雜交示意圖腫瘤細(xì)胞核IGH/CCND1雙色雙融合易位探針雜交后顯示1R1G2F信號(hào)細(xì)胞核IGH/CCND1雙色雙融合易位探針雜交

11、后顯示2R2G信號(hào)檢測(cè)探針標(biāo)記顏色探針定位 IGH/CCND1green/orange IGH: 14q32 CCND1: 11q13 正常: 2O/2G異常: 1O/1G/2F1040IHC:CyclinD1病例6: 393301，男，40y； 肘部腫物； IHC：CyclinD1弱陽性； 經(jīng)科內(nèi)會(huì)診； FISH:21%的細(xì)胞可見融合信號(hào)；診斷：MCL 所示箭頭為染色體易位產(chǎn)生的融合信號(hào)（100）10CyclinD140病例7: 386766，女，67y 扁桃體活檢2塊，直徑0.3CM IHC：CyclinD1弱陽性； FISH:45%的細(xì)胞可見融合信號(hào)；診斷：不排除MCL的可能，重取活檢；

12、形態(tài)不典型+IHC不理想所示箭頭為染色體易位產(chǎn)生的融合信號(hào)（100）FISH檢測(cè)標(biāo)本要求新鮮活檢或手術(shù)切除標(biāo)本；石蠟包埋組織或石蠟切片（35um）；腫瘤穿刺活檢組織或細(xì)胞涂片；骨髓穿刺組織盡量送涂片，不用活檢組織（因?yàn)槊撯}需要使用鹽酸，破壞DNA）；腫瘤細(xì)胞陽性的胸腹水涂片；一般在3個(gè)工作日后可以發(fā)出檢測(cè)報(bào)告；EBV-DNA定量PCR結(jié)果的穩(wěn)定性分析EBV-DNA定量PCR標(biāo)準(zhǔn)樣品擴(kuò)增曲線107106105104鼻咽癌檢測(cè)結(jié)果比較5個(gè)不同樣品重復(fù)檢測(cè)；擴(kuò)增可靠性99.4%；每個(gè)樣品同時(shí)進(jìn)行5次重復(fù)，結(jié)果重復(fù)性很好；同時(shí)擴(kuò)增，結(jié)果存在顯著差異的為8；不同時(shí)間擴(kuò)增，結(jié)果存在顯著差異的為6.7。5個(gè)

13、樣品，每個(gè)樣品分5管抽提DNA后，同時(shí)進(jìn)行定量PCR檢測(cè)結(jié)果86987 21134 (24%)62902.67 786.2834080716EB0782113.15 1026.4144080716EB0788629.72 1107.8715080716EB0780556.48 1006.95605080716EB07120732.72 1509.159080716EB076579 2729 (41%)7632.05 95.40062080716EB061822.53 22.78165080716EB068748.75 109.359375080716EB067055.78 88.1972608

14、0716EB067633.76 95.42204080716EB06138 370 (268%)0.00 0080716EB050.00 0080716EB050.00 0080716EB05827.34 10.341734080716EB050.00 0080716EB05Final resultsQuantitySample Name3335827 485146 (14%)3038537.20 37981.715080716EB093244077.60 40550.97080716EB093300465.28 41255.816080716EB094161768.80 52022.11080716EB092934283.76 36678.547080716EB09489681 47968 (10%)497186.24 6214.828080716EB08498939.18 6236.7397080716EB08458680.94 5733.5117