微生物檢測原理

1、1、膽鹽乳糖培養(yǎng)基原理蛋白胨為氮源、乳糖為碳源，膽酸鹽為抑制劑（抑制革蘭氏陽性細菌），溴甲酚紫指示劑（變黃則細菌產(chǎn)酸）該培養(yǎng)基為選擇性培養(yǎng)基，選擇性生長利用乳糖為碳源的革蘭氏陰性菌，根據(jù)是否產(chǎn)酸產(chǎn)氣判斷樣品是否為大腸菌群。2、玫瑰紅納培養(yǎng)基原理胨提供碳氮源，葡萄糖提供能源，磷酸二氫鉀提供緩沖劑，硫酸鎂提供微量元素，玫瑰紅納未選擇抑菌劑，可抑制細菌的生長，并可減緩莫些霉菌生長過而導(dǎo)致菌落蔓延生長通常黑曲霉為孢子黑色白色念珠菌為奶油色3、酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基原理酵母浸出粉提供B族維生素能促進酵母生長4、靛基質(zhì)實驗原理莫些細菌可能分解蛋白質(zhì)中的色氨酸生成吲哚，吲哚的存在可用顯色表現(xiàn)，吲哚對對

2、二甲基氨基苯醛結(jié)合成玫瑰吲哚5、乙酰甲基甲醇生成實驗（v-p）莫些細菌分解葡萄糖生成丙酮酸，丙酮酸縮合脫羧生成乙酰甲基甲酸，乙酰甲基甲酸可在強堿條件下被空氣中的氧氧化為二乙酰，二乙酰與蛋白胨中的瓜基生成紅色化合物6、枸櫞酸鹽利用實驗原理不同的細菌有不同的酶，分解產(chǎn)物各有差異，以枸櫞酸納為唯一碳源于Ph為7的培養(yǎng)基上，產(chǎn)氣桿菌分解枸櫞酸生成碳酸鹽，是培養(yǎng)基由中性變?yōu)閴A性培養(yǎng)基中指示劑溴麝香草酚藍（ptb）有淺綠色變?yōu)樯钏{色，此為枸櫞酸利用實驗陽性，大腸桿菌因不能利用為陰性7、曙紅亞甲基藍瓊脂平板實驗原理蛋白胨和牛肉浸粉提供氮源、維生素、氨基酸和碳源；氯化鈉能維持均衡的滲透壓；乳糖是大腸菌群可發(fā)酵

3、的糖類；瓊脂是培養(yǎng)基凝固劑；曙紅鈉和亞甲藍是抑菌劑和pH指示劑，可抑制革蘭氏陽性菌，在酸性條件下產(chǎn)生沉淀，形成紫黑色菌落或具黑色中心的外圍無色透明的菌落MUG培養(yǎng)基在大腸桿菌中檢測的原理8、一種基于熒光方法檢測大腸桿菌的MUG培養(yǎng)基，其主要組分和含量（重量份）為：MUG0.0300.1,乳糖3-10，pH值為7.0-7.5。由于本發(fā)明在培養(yǎng)基中加入膽鹽，可抑制部分革蘭氏陽性細菌的生長，有利于大腸桿菌的生長。在培養(yǎng)基中加入乳糖，同時考察培養(yǎng)液產(chǎn)氣和產(chǎn)熒光兩個因素，大大減少假陽性，提高檢測準確性。微生物限度檢查法附錄XIJ微生物限度檢查法微生物限度檢查法系指非規(guī)定滅菌制劑及其原、輔料受到微生物污染

4、程度的一種檢查方法，包括染菌量及控制菌的檢查。供試品應(yīng)隨機抽樣。一般抽樣量為檢驗用量（2個以上最小包裝單位）的3倍量。檢查的全過程，均應(yīng)嚴格遵守無菌操作，嚴防再污染。除另有規(guī)定外，本檢查法中細菌培養(yǎng)溫度為3035C，霉菌、酵母菌培養(yǎng)溫度為2528C，控制菌培養(yǎng)溫度為36C1C。檢驗結(jié)果的報告以1g、1ml或10cm為單位。培養(yǎng)基及其制備方法除另有規(guī)定外，培養(yǎng)基制備的滅菌條件為121C20分鐘。營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基與營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基見無菌檢查法(附錄XIH)玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基胨5g玫瑰紅鈉0.0133g葡萄糖10g瓊脂1520g磷酸二氫鉀1g水1000ml硫酸鎂0.5g除葡萄糖、玫瑰紅鈉外，取上述成分，

5、混合，加熱溶化后，濾過，加入葡萄糖、玫瑰紅鈉，分裝，滅菌。3酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(YPD)胨10g瓊脂1520g酵母浸出粉5g水1000ml葡萄糖20g除葡萄糖外，取上述成分，混合，加熱溶化后，濾過，加入葡萄糖，分裝，滅菌4膽鹽乳糖培養(yǎng)基(BL)胨20g磷酸二氫鉀1.3g乳糖5g牛膽鹽1.3g氯化鈉5g(或去氧膽酸鈉0.5g)磷酸氫二鉀4.0g水1000ml除乳糖、牛膽鹽外，取上述成分，混合，加熱使溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.40.2,煮沸，濾清，加入乳糖、牛膽鹽，分裝，滅菌。5.曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基(EMB)營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基100ml曙紅鈉指示液2ml20%乳糖溶液5ml亞甲藍指示液

6、1.31.6ml取營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，加熱溶化后，冷至60C,按無菌操作加入滅菌的其他3種溶液,搖勻，傾注平皿。6麥康凱瓊脂培養(yǎng)基(MacC)胨20g1%中性紅指示液3ml乳糖10g瓊脂1520g牛膽鹽5g水1000ml氯化鈉5g除乳糖、指示液、牛膽鹽及瓊脂外，取上述成分，混合，加熱使溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.20.2，加入瓊脂，加熱溶化后，再加入其余各成分，搖勻，分裝，滅菌,冷至60C，傾注平皿。7.4-甲基傘形酮葡糖苷酸(4-Methylumbelliferyl-作D-Glucuronide，MUG)培養(yǎng)基胨10g磷酸二氫鉀0.9g硫酸銨5g磷酸氫二鈉(無水)6.2g硫酸錳0.5mg亞硫酸

7、鈉40mg硫酸鋅0.5mg去氧膽酸鈉1g硫酸鎂0.1gMUG75mg氯化鈉10g水1000ml氯化鈣50mg8、磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基胨7g葡萄糖5g磷酸氫二鉀3.8g水1000ml取上述成分，混合，微溫使溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.30.1,分裝于小試管，121C滅菌15分鐘。9、枸櫞酸鹽培養(yǎng)基氯化鈉5g枸櫞酸鈉（無水）2g硫酸鎂0.2g溴麝香草酚藍指示液20ml磷酸氫二鉀1.0g瓊脂1520g磷酸二氫銨1g水1000ml除指示液和瓊脂外，取上述成分，混合，微溫使溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為6.90.1，加入瓊脂，加熱溶化,加入指示液，混勻。分裝于小試管,滅菌,置成斜面。注：所用瓊脂應(yīng)不含游

8、離糖，用前用水浸泡沖洗。10、無菌對氨基苯甲酸試液取對氨基苯甲酸0.1g，加入含有10ml水的帶塞試管中,121C滅菌20分鐘。11、玫瑰紅鈉試液取玫瑰紅鈉試液0.1g，加水使溶解成75ml。無菌枸櫞酸鈉一氯化鈉試液取枸櫞酸鈉0.5g，口0.9%氯化鈉溶液10m1，121C滅菌20分鐘。12、草酸銨試液取草酸銨1g，加水溶解使成100ml。13、a-萘酚乙醇試液取a-萘酚6.0g，加無水乙醇溶解使成100ml。14、靛基質(zhì)試液取對二甲氨基苯甲醛5.0g，加入戊醇（或丁醇）75ml，充分振搖，使完全溶解后，再取濃鹽酸25ml徐徐滴入，邊加邊振搖，以免驟熱導(dǎo)致溶液色澤變深，或取對二甲氨基苯甲醛1.

9、0g，加入95%乙醇95ml，充分振搖，使完全溶解后，取濃鹽酸20ml徐徐滴入。15、稀釋劑0.9%無菌氯化鈉溶液取氯化鈉9.0g，加水溶解使成1000ml，121C滅菌20分鐘。16、靛基質(zhì)試液取對二甲氨基苯甲醛5.0g，加入戊醇（或丁醇）75ml，充分振搖，使完全溶解后，再取濃鹽酸25ml徐徐滴入，邊加邊振搖，以免驟熱導(dǎo)致溶液色澤變深，或取對二甲氨基苯甲醛1.0g，加入95%乙醇95ml，充分振搖，使完全溶解后，取濃鹽酸20ml徐徐滴入。17、稀釋劑0.9%無菌氯化鈉溶液取氯化鈉9.0g，加水溶解使成1000ml，121C滅菌20分鐘18、無菌磷酸鹽緩沖液（pH7.2）取磷酸氫二鈉25.8

10、g與磷酸二氫鈉4.4g，加水稀釋至1000ml，121C滅菌20分鐘。19、指示液20、中性紅指示液取中性紅1.0g，研細，加95%乙醇60ml使溶解，再加水至100ml。變色范圍pH6.88.0（紅黃）。21、甲基紅指示液取甲基紅0.1g，加95%乙醇300ml,使溶解后，加水至500ml,即得。22、亞甲藍指示液取亞甲藍0.5g，加水溶液使成100ml。酚磺酞指示液取亞甲藍0.5g，加1mol/L氫氧化鈉溶液2.82ml，使溶解，再加水至100ml。變色范圍pH6.88.4（黃紅）。23、溴甲酚紫指示液取溴甲酚紫1.6g，加95%乙醇溶解使成100ml。變色范圍pH5.26.8（黃紫）。2

11、4、溴麝香草酚藍指示液取溴麝香草酚藍0.4g，加1mol/L氫氧化鈉溶液0.64ml使溶解，再加水至100ml。變色范圍pH6.07.6（黃藍）。25、酸性品紅指示液取酸性品紅0.5g，加水100ml使溶解，再逐漸加1mol/L氫氧化鈉溶液16ml，每加1滴均應(yīng)將溶液充分搖勻后再加第2滴,直至溶液呈草黃色；于沸水內(nèi)保持15分鐘，再靜置2小時，濾過，即得變色范圍pH6.07.4（黃紅）。26、口服固體高密度聚乙烯瓶檢驗標準指示液取曙紅鈉2.0g，加水溶解使成100ml。供試品的檢驗量每批供試品檢驗量般為10g或10ml?；瘜W膜劑為100cm，貴重的或微量包裝的供試品檢驗量可以酌減，但口服藥品不得

12、少于3g，外用藥品不得少于5g。供試品須取自2個以上的包裝單位，大蜜丸、膜劑除須取自2個以上的包裝單位外，應(yīng)取自4丸（片）以上樣品。供試液的制備按供試品的理化特性與生物學特性可采取適宜的方法制成供試液。（1）稀釋法將供試液種入較大量的培養(yǎng)基中，使該供試液稀釋至不具抑菌作用的濃度。液體供試品取供試品10ml，加入稀釋劑90ml中，混勻，作為供試液。對照用菌液控制菌檢查均應(yīng)作相應(yīng)已知菌的對照試驗。對照菌株為大腸桿菌檢查法1.細菌、霉菌與酵母菌計數(shù)（1）平皿菌落計數(shù)法取均勻供試液，進一步稀釋成1:10、1:10等適宜的稀釋級。分別取連續(xù)三級10倍稀釋的供試液各1ml,置直徑約90mm的平皿中，再注入

13、約45C的培養(yǎng)基約15ml，混勻，待凝固后，倒置培養(yǎng)，每稀釋級應(yīng)作23個平皿。營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基用于細菌計數(shù)，玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基用于霉菌計數(shù)。在特殊情況下，前者同時點計霉菌、酵母菌菌落數(shù)，后者同時點計細菌菌落數(shù)。酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基用于酵母菌計數(shù)。合劑用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基與酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基分別測定霉菌、酵母菌菌落數(shù)，合并計數(shù)。液體制劑用玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基同時點計霉菌菌落數(shù)及酵母菌菌落數(shù)。菌數(shù)測定陰性對照試驗取供試驗用的稀釋劑各1ml,置4個無菌平皿中，分別按細菌、霉菌計數(shù)用的培養(yǎng)基制備平板，培養(yǎng)、檢查，不得長菌。細菌培養(yǎng)時間為48小時,分別在24小時及48小時點計菌落數(shù),一般以

14、48小時菌落數(shù)為準，霉菌、酵母培養(yǎng)時間為72小時，分別在48小時及72小時點計菌落數(shù)，一般以72小時菌落數(shù)為準。菌落如蔓延生長成片，不宜計數(shù)。點計后，計算各稀釋級的平均菌落數(shù)，按菌數(shù)報告規(guī)則報告菌數(shù)。菌數(shù)報告規(guī)則細菌宜選取平均菌落數(shù)在30300之間的稀釋級,霉菌宜選取平均菌落數(shù)在30100之間的稀釋級作為報告菌數(shù)計算的依據(jù)。如有1個稀釋級在30300（30100）之間時,將該稀釋級的菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告；如同時有2個稀釋級在30300（30100）之間時，按下式計算兩級比值。高稀釋級的平均菌落數(shù)x稀釋倍數(shù)比值=低稀釋級的平均菌落數(shù)x稀釋倍數(shù)當比值三2時，以兩稀釋級的均值報告，當比值2時，以低

15、稀釋級平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告；如同時有3個稀釋級的平均菌落數(shù)均在30300之間時,以后2個稀釋級計算級間比值報告；如各稀釋級的平均菌落數(shù)均不在30300之間，以最接近30或300的稀釋級平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告；如各稀釋級平均菌落數(shù)均在300（100）以上，按最高稀釋級平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告；如各稀釋級平均菌落數(shù)均小于30時，一般按最低稀釋級的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告。如當1:10（或1:100）稀釋級平均菌落數(shù)等于或大于原液（或1:10）稀釋級時，應(yīng)以培養(yǎng)基稀釋法測定，按測定結(jié)果報告菌數(shù)。（2）培養(yǎng)基稀釋法取供試液（原液或1:10、1：100供試液）3份，每份各1ml,分別注入5

16、個平皿內(nèi)（每皿各0.2ml）。每1個平皿傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約15ml，混勻，凝固后，倒置培養(yǎng)，計數(shù)。每1ml注入的5個平板點的菌落數(shù)之和，即為每1ml的菌落數(shù)，共得3組數(shù)據(jù)。以3份供試液菌落數(shù)的平均值乘以稀釋倍數(shù)報告。如各稀釋級平板均無菌落生長，或僅最低稀釋級平均菌落數(shù)小于1時,則報告菌數(shù)為小于10個。2控制菌檢查除另有規(guī)定外，取供試液10ml(相當于供試品lg、1ml、10cm)，直接或處理后接種，經(jīng)增菌、分離培養(yǎng)后，進行革蘭染色、牛化試驗與血清凝集試驗等項檢査。(1)大腸桿菌(Escherichiacoli)取膽鹽乳糖培養(yǎng)基3份，每份100ml,2份分別加入規(guī)定量的供試液，其中1份加入對照

17、菌50100個作陽性對照，第3份加入與供試液等量的稀釋液作陰性對照。培養(yǎng)1824小時(必要可延至48小時)。陰性對照應(yīng)無菌生長。取上述3份的培養(yǎng)物各0.2ml，分別接種至5mlMUG培養(yǎng)基管內(nèi)培養(yǎng)，分別于5小時與24小時時，取未接種的MUG培養(yǎng)基管作本底對照，將各管置365nm紫外光下觀察。陽性對照管呈現(xiàn)熒光，MUG陽性。供試液的MUG管呈現(xiàn)熒光，MUG陽性；無熒光，MUG陰性。然后加數(shù)滴靛基質(zhì)試液于MUG管內(nèi)，液面呈玫瑰紅色為陽性，呈試劑本色為陰性。當陰性對照呈陰性，陽性對照正常生長，供試液膽鹽乳糖培養(yǎng)基培養(yǎng)液澄明，并證明無菌生長，判未檢出大腸桿菌。供試液MUG陽性，靛基質(zhì)陽性，判檢出大腸桿

18、菌；MUG陰性，靛基質(zhì)陰性，判未檢出大腸桿菌。如MUG陽性、靛基質(zhì)陰性，或MUG陰性、靛基質(zhì)陽性，均應(yīng)取供試液膽鹽乳糖培養(yǎng)基培養(yǎng)物劃線于曙紅亞甲藍瓊脂平板或麥康凱瓊脂平板，培養(yǎng)1824小時，如上述供試液培養(yǎng)物的分離平板無菌落生長，判未檢出大腸桿菌?；蛴芯渖L，應(yīng)挑選23可疑菌落作靛基質(zhì)試驗(I)、甲基紅試驗(M)、乙酰甲基甲醇生成試驗(V-P)、枸櫞酸鹽利用試驗(C)及革蘭染色、鏡檢，按表1規(guī)定判斷結(jié)果。表1MUG的結(jié)果判斷1MUG-I111曙紅亞甲藍瓊脂11IMVic11結(jié)果1+11111檢出大腸桿菌-111未檢出大腸桿菌+-1無菌生長11未檢出大腸桿菌+-1無菌生長1-+-檢出大腸桿菌-+1無菌生長1+1檢出大腸桿菌注：、如出現(xiàn)+-或出現(xiàn)-+-，均應(yīng)重新分離菌株，再作MUG-I和IMVic試驗。革蘭陰性桿菌。靛基質(zhì)試驗(I)取可疑菌落或斜面培養(yǎng)物，接種于蛋白胨水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24小時,沿管壁加入靛基質(zhì)試數(shù)滴，液面呈玫瑰紅色為陽性，呈試劑本色為陰性。甲基紅