腫瘤生物治療概論首都醫(yī)科大學

1、腫瘤生物治療概論首都醫(yī)科大學 一、前言（概述） 20世紀80年代新出現(xiàn)的腫瘤生物治療，隨著細胞分子生物學、生物工程技術(shù)迅速發(fā)展，不斷推出新的治療方法，如過繼性免疫療法，細胞因子療法，基因瘤苗療法等。但這種建立在“改變宿主對腫瘤細胞的生物學應(yīng)答而起抗瘤效應(yīng)”基礎(chǔ)上的治療方法，卻因為目前對“宿主對腫瘤細胞的生物學應(yīng)答”的機制了解不充分而療效不佳。相信通過對人體自身的更充分的了解，腫瘤生物治療會有更大的作為。 腫瘤的生物治療主要是通過調(diào)動宿主的天然防衛(wèi)機制或給予機體某些物質(zhì)來取得抗腫瘤的效應(yīng)。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，生物治療日趨重要，已經(jīng)逐漸成為治療腫瘤的第四手段了。（手術(shù)治療、放射治療、化學治療、

2、生物治療） 生物治療的日益增加的臨床應(yīng)用，是基于兩方面的發(fā)展：一是對抗腫瘤防衛(wèi)機制的基礎(chǔ)理論的深入理解，二是生物技術(shù)的迅速發(fā)展使得臨床上大規(guī)模運用生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑成為可能。 腫瘤的基因治療，目前經(jīng)FDA批準臨床試驗的大多數(shù)，都是通過調(diào)動和調(diào)節(jié)機體免疫功能來實現(xiàn)的，因此也是生物治療的重要組成部分。 生物治療和基因治療雖然仍是處于發(fā)展的嬰兒期，但已有很多典型的病例及其反映出來的理論探索的成功性足以激發(fā)人們將這一療法繼續(xù)向前推進。 面向21世紀的腫療治療，抗癌藥物的發(fā)展將從細胞毒性藥物攻擊轉(zhuǎn)向非細胞毒性藥物的調(diào)節(jié)。其中免疫治療和基因治療將起到極其重要的作用。 二、腫瘤的免疫治療 腫瘤免疫治療的基本原理

3、是利用人體的免疫機制，通過主動或被動的方法增強腫瘤病人的免疫功能，達到殺滅腫瘤細胞的目的。 腫瘤的免疫治療主要有特異性的免疫治療和非特異性的免疫治療兩大方面。 特異性免疫治療是指針對腫瘤細胞產(chǎn)生的腫瘤抗原誘導專一的免疫反應(yīng)所進行的治療，如腫瘤瘤苗，腫瘤分子疫苗，樹突狀細胞疫苗等。 而非特異性免疫治療主要是利用一些細胞因子、細菌或微生物等的提取物，如白細胞介素、干擾素、腫瘤壞死因子、胸腺素、香菇多糖等，提高機體的整體免疫狀態(tài)，達到間接抗腫瘤效果。 所以，前者療效確切，是免疫治療的主要研究方向，后者的抗腫瘤效果較弱，大部分只能作為輔助用藥。 現(xiàn)將目前臨床應(yīng)用的主要免疫治療方法作一簡單介紹。 1生物

4、因子 細胞因子是由體內(nèi)的免疫活性細胞或某些基質(zhì)細胞分泌的，能作用于自身細胞或其它細胞，具有調(diào)節(jié)細胞功能的小分子蛋白或多肽。 由于生物工程技術(shù)的發(fā)展，許多生物因子已經(jīng)可以通過發(fā)酵工程大規(guī)模生產(chǎn)，這些原本在體內(nèi)極微量的生物活性物質(zhì)的生物效應(yīng)得到了放大。 目前，已經(jīng)在臨床上應(yīng)用的生物因子有干擾素（IFN）、白細胞介素-2（IL-2）、腫瘤壞死因子（TNF）等。 （一）干擾素 干擾素是最早進入臨床應(yīng)用的細胞因子，對白血病、多發(fā)性骨髓瘤、腎癌和淋巴瘤的治療有效。 干擾素抗腫瘤的機制包括： 抑制腫瘤細胞的增殖； 誘導自然殺傷細胞（NK細胞）、細胞毒T淋巴細胞（CTL）等，并協(xié)同IL-2增強淋巴因子激活的殺

5、傷細胞（LAK）的活性； 誘導腫瘤細胞表達主要組織相容性復(fù)合物（MHC）-I類抗原，增加對殺傷細胞的敏感性。 干擾素對多種腫瘤具有良好的療效?，F(xiàn)在臨床上應(yīng)用較為常見的是干擾素2a和干擾素2b，與化療聯(lián)合應(yīng)用時可以得到較高的緩解率。 如與化療聯(lián)合治療淋巴瘤可提高約5%的緩解率。 最新的報道，干擾素聯(lián)合希羅達治療腎癌也獲得了滿意的治療效果。（二）白細胞介素2 IL-2的臨床應(yīng)用已有10余年歷史，其生物學活性主要包括促進和維持T淋巴細胞的增殖，并誘導淋巴細胞產(chǎn)生IFN-、TNF-等細胞因子；單獨應(yīng)用IL-2對于惡性黑色素瘤、腎癌有效，有效率大約在20%。 由于IL-2的單獨應(yīng)用需要大劑量時才有效，而

6、大劑量的IL-2有明顯的不良反應(yīng)，因而限制了其應(yīng)用價值。除了惡性黑色素瘤、腎癌之外，對其它惡性腫瘤的治療效果不明顯。為了克服全身應(yīng)用時的不良反應(yīng)，局部治療有時也能取得一定的療效。例如，采用腹腔灌注IL-2的方法治療卵巢癌，不良反應(yīng)輕微，有一定療效。（三）腫瘤壞死因子 TNF可分為兩種：TNF、TNF，前者由巨噬細胞分泌，而后者由淋巴細胞分泌。 TNF生物學特性包括直接殺傷腫瘤細胞，誘導腫瘤細胞凋亡，介導其他活性細胞的抗腫瘤效應(yīng)，引起腫瘤微血管損傷，繼而引起腫瘤缺血壞死。 原型TNF有較嚴重的毒副作用。近年來我國科學家將其進行了結(jié)構(gòu)改造，降低了毒性，提高了療效，并且已經(jīng)獲得批準進入臨床應(yīng)用。 T

7、NF可以進行瘤體內(nèi)注射，單用靜脈或肌內(nèi)注射TNF療效欠佳，與IL-2、IFN等其它細胞因子或者化療藥物聯(lián)合應(yīng)用可以提高療效，而且能夠減少用藥劑量，降低毒副作用。由于缺乏大宗的臨床病例的總結(jié)，其真正的臨床應(yīng)用價值還有待進一步評價。（四）白細胞介素21 近期，另一個值得關(guān)注的生物因子是IL-21，它是由輔助性T淋巴細胞（CD4+ T細胞）分泌的一種細胞因子，對CD8+ T淋巴細胞、B淋巴細胞、NK細胞、樹突狀細胞（Dendritic cells, DCs）均有調(diào)節(jié)作用，因此具有增強抗腫瘤免疫的作用。 在小鼠動物實驗中，采用隔日腹腔注射IL-21的方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠腫瘤完全消退，而且無瘤生存達120

8、天以上，并能夠排斥二次腫瘤的沖擊。其在臨床上的有效性還有待于進一步研究和觀察。 2單克隆抗體（一）單克隆抗體治療 單克隆抗體治療是利用抗原抗體特異性結(jié)合的特點設(shè)計的一種治療方法，因此又被稱為生物導彈技術(shù)。腫瘤細胞表面有一些特異的腫瘤抗原可作為單克隆抗體攻擊的靶點。 以往的單克隆抗體采用的鼠源性抗體，不能反復(fù)使用，療效差。 新近發(fā)展的人鼠嵌合型單克隆抗體達到95%以上人源化，減少了 免疫原性，使這一技術(shù)的臨床應(yīng)用獲得了巨大的成功。 單克隆抗體除了能夠阻斷抗原蛋白的功能外，還能夠借助于補體依賴細胞毒作用和抗體依賴細胞介導的細胞毒作用殺滅腫瘤細胞，尤其是對循環(huán)血液中的游離腫瘤細胞。 其他針對腫瘤區(qū)血

9、管的單克隆抗體，可以封閉血管內(nèi)皮生長因子，同時通過補體系統(tǒng)和NK細胞發(fā)揮抗腫瘤作用。 利妥昔單克隆抗體和曲妥珠單克隆抗體是目前在臨床上應(yīng)用比較成熟的單克隆抗體。 利妥昔單克隆抗體（商品名美羅華），是針對B淋巴細胞表面的CD20，用來治療B細胞惡性淋巴瘤的單抗。依目前的用藥經(jīng)驗，利妥昔單抗聯(lián)合化療治療B細胞惡性淋巴瘤比單獨應(yīng)用化療要好，有效率比單獨化療提高近10%左右。 曲妥珠單抗（商品名赫賽汀）是用來治療乳腺癌的單抗。在某些乳腺癌的病人，腫瘤細胞過度表達Her2/neu蛋白，這種蛋白與腫瘤的生長信號通路酪氨酸激酶信號傳導通路有關(guān)，是其整個通路中的信號分子。 曲妥珠單克隆抗體就是針對該蛋白的特異

10、性抗體，能夠封閉此信號通路，達到阻斷生長信號的作用，從而抑制腫瘤的生長。 曲妥珠單克隆抗體聯(lián)合常規(guī)化療可以增強治療效果。但是曲妥珠單抗增加了蒽環(huán)類藥物（如多柔比星、表柔比星）的心臟毒性，在治療中應(yīng)加以注意。 其它單抗 正在國外臨床上應(yīng)用的單抗還有針對血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的Bevacizumab和針對表皮生長因子（EGF）受體的Cetuximab。這兩種單抗均已被美國FDA批準用于大腸癌的治療。（二）單克隆抗體攜帶抗腫瘤物質(zhì)的導向治療 單克隆抗體主要通過補體反應(yīng)和與NK細胞的特異性結(jié)合起作用，因此抗腫瘤效果有限。為了提高其抗腫瘤效能，另外一種方法就是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合的特性，利用抗

11、體的導向作用，將攜帶的具有殺傷腫瘤的物質(zhì)遞送到腫瘤部位，并特異性結(jié)合到表達相關(guān)抗原的腫瘤細胞或腫瘤區(qū)域血管內(nèi)皮細胞，從而獲得抗腫瘤效果。 能夠通過單克隆抗體攜帶的物質(zhì)包括細胞毒性藥物，生物毒素，酶和放射性核素。 近幾年來，通過基因工程技術(shù)將單抗 與細胞因子或生物毒素進行交聯(lián)，形成融合蛋白的產(chǎn)品不斷問世。這些抗腫瘤物質(zhì)通過單抗的靶向作用聚集到腫瘤組織內(nèi)，達到抗腫瘤目的。據(jù)報道其效果均優(yōu)于普通的單克隆抗體。 3過繼免疫治療 過繼免疫治療開始于20世紀80年代，通過將在體外激活的具有抗瘤活性的免疫效應(yīng)細胞輸注給惡性腫瘤病人，在病人體內(nèi)發(fā)揮抗腫瘤作用，而達到治療腫瘤的目的。Rosenberg教授首先采

12、用LAK細胞治療腫瘤，成為當時免疫治療研究的熱點。這一治療方法也是迄今為止在臨床上應(yīng)用最為廣泛的過繼免疫治療。 其后，他的研究室又推出腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）過繼免疫治療，采用從手術(shù)切除的腫瘤標本或其引流淋巴結(jié)分離的淋巴細胞經(jīng)體外激活制作成抗腫瘤效應(yīng)細胞，效果在LAK細胞的基礎(chǔ)上得到進一步提高。 但由于過繼免疫治療需要大量使用IL-2，其嚴重的不良反應(yīng)限制了臨床上推廣，加上療效有限使得過繼免疫治療逐漸降溫。 其后，CD3激活的殺傷細胞（CD3AK）和細胞因子激活的殺傷細胞（CIK）的問世也沒有能扭轉(zhuǎn)這一趨勢。 從臨床治療效果來看，過繼免疫治療對惡性黑色素瘤和腎癌以及腫瘤引起的胸水、腹水的治療

13、效果比較好，而對其它實體瘤的治療效果較差。 4腫瘤疫苗 腫瘤疫苗主要有全細胞疫苗、蛋白分子疫苗、多肽疫苗、重組分子疫苗和樹突狀細胞（DCs）疫苗等。而DNA疫苗和RNA疫苗實際上仍屬于分子疫苗，只是采用了不同的表達方式。腫瘤疫苗是以激活機體主動免疫功能為基礎(chǔ)的免疫治療，特異性強，療效高，是當今腫瘤免疫治療的發(fā)展方向。（一）腫瘤細胞瘤苗 過去，對腫瘤抗原與臨床的相關(guān)性方面的關(guān)系并不十分清楚，采用全細胞作為腫瘤疫苗，可以提供那些未知的腫瘤抗原來激活免疫系統(tǒng)。 在小鼠腫瘤模型中，通常使用照射或藥物滅活的腫瘤細胞免疫動物，以保護小鼠免受接種的腫瘤的侵襲。但當腫瘤細胞疫苗應(yīng)用的時間推遲到接種腫瘤細胞后1

14、周時，疫苗就失去了保護小鼠的能力。這種瘤苗的應(yīng)用還必須配合免疫佐劑（如卡介苗）以提高治療效果。 在臨床應(yīng)用上，這種瘤苗治療的反應(yīng)比較差，僅僅適用于腫瘤病人術(shù)后的復(fù)發(fā)預(yù)防，而對于進展期病人的臨床研究很少獲得良好效果。 盡管如此，細胞瘤苗也有其優(yōu)越性，就是因為腫瘤細胞內(nèi)包含了許多目前尚未發(fā)現(xiàn)的腫瘤抗原，特別適合那些尚未發(fā)現(xiàn)特異腫瘤抗原或相關(guān)抗原的腫瘤類型的病人的治療。事實上，科學家們始終沒有完全放棄在瘤苗方面的努力，試圖通過轉(zhuǎn)基因的方式提高這些瘤苗的抗原性。 近年來，轉(zhuǎn)基因腫瘤瘤苗研究較多的是轉(zhuǎn)導IL-2、集落刺激因子（CSF）的方式制備瘤苗。國內(nèi)IL-2轉(zhuǎn)導胃癌瘤苗已經(jīng)獲得國家食品藥品監(jiān)督管理局

15、（SFDA）的批準進入臨床研究，在預(yù)防術(shù)后復(fù)發(fā)方面已經(jīng)獲得了一定的臨床效果。（二）分子疫苗 人體的免疫T淋巴細胞對抗原的識別是810個氨基酸的短肽，因此，有人設(shè)計了抗原多肽與免疫佐劑混合的多肽疫苗。當小鼠實驗證實了其有效性后，多肽疫苗開始進入了臨床研究。 但到目前為止，還沒有證據(jù)證明其在臨床上的有效性。從理論上來說，腫瘤抗原蛋白疫苗的應(yīng)用可以提供更多的T淋巴細胞識別位點，但是單純使用腫瘤抗原蛋白，由于抗原性太弱并不能激活機體的免疫反應(yīng)。 靈長類動物實驗研究證實最佳的免疫效果需要將腫瘤蛋白與強免疫原性蛋白相交聯(lián)。弱抗原要誘導出有效的免疫反應(yīng)，就必須聯(lián)合使用免疫佐劑，提供一個非特異性的信號以激活免

16、疫系統(tǒng)。許多免疫佐劑都有一定的毒性而不能應(yīng)用于臨床，所以抗原蛋白疫苗大多是以重組形式出現(xiàn)的。 用重組形式增強抗原蛋白的免疫原性的方法就是將腫瘤抗原與細胞因子，如GM-CSF、IL等重組形成融合蛋白。 腫瘤弱抗原與細菌或病毒抗原、生物毒素，如白喉毒素、假單胞菌毒素等的重組可以明顯提高腫瘤抗原的抗原性，促進抗原遞呈細胞對腫瘤抗原的吞噬遞呈。但腫瘤抗原與毒素的單獨重組的方法到目前為止仍然還未達到理想的效果。重組的抗原疫苗主要用病毒載體（病毒疫苗）或載體DNA（核酸疫苗）來表達。（三）樹突細胞（DCs）疫苗 對于有效的T淋巴細胞介導的免疫反應(yīng)，原始T淋巴細胞需要接受來自APC的抗原呈遞并被致敏。腫瘤細

17、胞表面缺乏MHC分子和共刺激分子，無法激活T淋巴細胞免疫。因此，疫苗刺激的免疫反應(yīng)主要依賴于APC對抗原的初加工和進一步的呈遞，這是獲得有效免疫反應(yīng)的關(guān)鍵性步驟。DCs是到目前為止發(fā)現(xiàn)的人體最有效的抗原呈遞細胞之一。 DCs在大多數(shù)組織內(nèi)以未成熟狀態(tài)存在，不能直接刺激T淋巴細胞，但具有特殊的捕獲和加工抗原的能力。 被捕獲的抗原在DCs內(nèi)經(jīng)過處理、剪切成短肽，然后與MHC結(jié)合并被有效地呈遞至細胞表面?？乖牟东@作為刺激信號促進DCs成熟并向局部淋巴結(jié)遷移。這些成熟的DCs表面還高表達共刺激分子和黏附分子，具有強大的激活T淋巴細胞的功能。 DCs可以從外周血單個核細胞的分離中大量獲得，并在體外進行

18、培養(yǎng)、激活。體外大量產(chǎn)生的DCs用腫瘤抗原進行沖擊制備的疫苗在國外已經(jīng)進入期臨床試驗；采用腫瘤細胞裂解物，腫瘤抗原蛋白，腫瘤抗原多肽等沖擊的DCs疫苗的臨床研究獲得了比較理想的效果。 在一項采用自身的腫瘤細胞與DCs融合的細胞疫苗，治療轉(zhuǎn)移性腎癌也取得了一定的效果；17例病人中有7例有確切的臨床反應(yīng)，其中包括4例瘤體完全退縮。 另一項臨床試驗表明，11個期的惡性黑色素瘤病人，給予MAGE-3A1多肽致敏的成熟的單個核細胞來源的DCs，結(jié)果在8個病人中發(fā)現(xiàn)MAGE-3A1特異性的CTL的增殖，并可喜的發(fā)現(xiàn)有6人出現(xiàn)個別轉(zhuǎn)移灶的消退，顯示了DCs介導的免疫反應(yīng)即使在晚期惡性黑色素瘤病人中也有治療效

19、果。 DCs疫苗的臨床應(yīng)用研究主要集中在惡性黑色素瘤和腎癌，療效比較可靠，總體有效率在30%40%，已經(jīng)接近或超過化療的水平。 在其它腫瘤中的應(yīng)用療效略低，有效率在10%30%。2003年美國臨床腫瘤學會（ASCO）會議報告了一項DCs疫苗治療晚期乳腺癌的報道，盡管12例病人均可檢測到細胞毒T淋巴細胞的增殖，但僅一例病人獲得腫瘤縮小。因此，DCs疫苗的治療療效尚需提高。DCs疫苗的最大優(yōu)勢就是幾乎沒有毒副作用。 就目前的研究結(jié)果看，以DCs為基礎(chǔ)的疫苗是所有方案中比較理想的疫苗，DCs疫苗的缺點是分離和體外培養(yǎng)需要很高的技術(shù)要求，離大規(guī)模推廣應(yīng)用還有一段距離。 通過技術(shù)改進簡化制備過程，或通過

20、在體內(nèi)有效地完成遞送腫瘤抗原并激活DCs將是未來腫瘤免疫治療的主要研究方向。 如果能通過DCs疫苗的推廣應(yīng)用，首先達到預(yù)防手術(shù)后復(fù)發(fā)的目的，可以使1/3的病人得到根治。不能手術(shù)的晚期腫瘤病人通過化療，放療或新輔助放化療減瘤后再聯(lián)合免疫治療，可以使致死的惡性腫瘤轉(zhuǎn)變?yōu)榭煽刂频摹奥约膊　保瑢⑹侨祟惪拱┦飞系闹卮筮M步。 三、基因治療 1基因治療的概念、策略和途徑（一）概念 探索利用遺傳物質(zhì)，來糾正人自身基因結(jié)構(gòu)或功能上的異常，或抑制外源病原體遺傳物質(zhì)的復(fù)制，從而達到治病的目的，這既是基因治療的構(gòu)想。可以說基因治療就是用正常基因校正或置換致病基因的一種治療方法，即將目的基因?qū)氲桨屑毎麅?nèi)并使之表達，

21、從而起到治療疾病作用的一種方法。目前，基因治療的概念擴展為凡是采用分子生物學的方法和原理，在核取水平上開展的疾病治療方法都可稱為基因治療。（二）基因治療策略 根據(jù)所采用的方法不同，目前常用的基因治療的策略大致可分為以下幾種。 基因增補（gene augmentation）又稱基因修飾。將目的基因?qū)氩∽兗毎蚱渌毎?，目的基因的表達產(chǎn)物能修飾缺陷細胞的功能或使原有的某些功能得以加強。目前，基因治療多采用這種方式。 腫瘤細胞中常有抑癌基因的缺陷，抑癌基因的表達可以使腫瘤細胞死亡或生長抑制。目前腫瘤基因治療的直接應(yīng)用方案中，超過半數(shù)采用抑癌基因。普遍認為，單個基因缺陷的修復(fù)對存在其它缺陷的腫瘤細胞

22、有抑制作用。因此，通過單個抑癌基因的導入可以控制腫瘤細胞的生長。 另外，還可以將腫瘤抗原或細胞因子的基因?qū)氩∪梭w內(nèi)，改變病人免疫狀態(tài)，達到預(yù)防和治療疾病的目的。常用的細胞因子有IL-2、TNF、G-CSF、IL-4共刺激分子等，激活體內(nèi)抗腫瘤免疫反應(yīng)，達到預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)和控制腫瘤生長的目的。 基因失活（gene inactivation）也稱為基因封閉技術(shù)。利用反義核酸技術(shù)能特異地封閉基因表達特性，抑制特定的基因表達，達到治療疾病的目的。通過核酶在細胞內(nèi)特異性降解靶基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，控制一些癌基因的表達，抑制腫瘤細胞的增殖，誘導腫瘤細胞的分化。此技術(shù)還可以封閉腫瘤細胞的耐藥基因的表達，增加化療效

23、果。 前體藥活化（prodrug activation）采用給予前體藥物的方法減少化療藥物對正常細胞的損傷。如向腫瘤細胞中導入單純皰疹病毒（HSV）胸苷激酶基因，然后給予病人無毒性GCV藥物，由于只有含HSV-TK基因的細胞才能將GCV轉(zhuǎn)化成有毒的藥物。因而腫瘤細胞被殺死，而對正常細胞無影響。（三）基因治療的途徑 體外途徑 將含有外源基因的載體在體外導入到人體自體、異體或異種細胞中，經(jīng)過體外的擴增后再回輸入體內(nèi)。體外途徑的基因治療比較安全，但操作比較煩瑣，需要有無菌條件下細胞采集和培養(yǎng)的設(shè)備，要求比較高，最大的缺點就是不能產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，成本相對較高。 體內(nèi)途徑 將外源基因裝配到特定的真核細胞表達

24、載體中，直接導入體內(nèi)的細胞。這種途徑的表達載體可以進行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，但這種方式的基因?qū)胨褂玫妮d體的安全性需要進行復(fù)雜的論證。對于體內(nèi)途徑而言，轉(zhuǎn)導的方式還要有較高的特異性，使載體主要轉(zhuǎn)染到目的的靶細胞內(nèi)。（四）基因治療的基本過程和關(guān)鍵 獲得目的基因 要進行基因治療，首先要解決的問題就是要達到什么目的和選擇什么基因。確定了目的基因后就可以通過傳統(tǒng)的方法獲取目的基因片段，如采用多聚酶鏈式反應(yīng)（PCR法）進行體外擴增。至于一些較短的基因片段則可直接采用人工合成的方法獲得。 載體的選擇 目的基因的轉(zhuǎn)入后必須能有效在細胞內(nèi)表達，這就要求選擇合適的載體系統(tǒng)。逆轉(zhuǎn)錄病毒只能轉(zhuǎn)染增殖的細胞，而腺病毒可以轉(zhuǎn)染

25、增殖細胞和非增殖細胞。載體還分瞬時表達和永久表達系統(tǒng)。只有當目的基因被轉(zhuǎn)入體內(nèi)后能夠按預(yù)期有效的按需表達，才能達到治療效果。 將目的基因轉(zhuǎn)入靶細胞 將目的基因裝載到載體內(nèi)，再根據(jù)所采用的載體決定使用不同的轉(zhuǎn)導或轉(zhuǎn)染方式將載體導入體細胞內(nèi)。目前，通常采用病毒載體或脂質(zhì)體，陽離子多聚物等非病毒載體對目的基因進行包裝，提高轉(zhuǎn)染的效率。 2目前常用的腫瘤基因治療方法（一）自殺基因治療（suicide gene herapy） 自殺基因?qū)嶋H上是一種前體藥物轉(zhuǎn)化酶基因，這些基因不存在于哺乳動物細胞中。腫瘤細胞轉(zhuǎn)染此前體藥物轉(zhuǎn)化酶基因后，在腫瘤細胞內(nèi)表達，將原來無毒的化療前體藥物代謝轉(zhuǎn)化成細胞毒性產(chǎn)物而達到

26、殺傷宿主細胞的目的，因而稱為自殺基因。每種自殺基因系統(tǒng)都包含特定的酶和前體藥物。經(jīng)典的自殺基因系統(tǒng)有以下幾個方面。 HSV-TK/GCV系統(tǒng) TK-GCV系統(tǒng)中的TK基因多為單純皰疹病毒（HSV）和水痘皰疹病毒（VZV）中的胸苷激酶基因。HSV-TK/GCV系統(tǒng)中的毒性效應(yīng)來自于GCV磷酸化，其通過抑制DNA聚合酶的活性，阻斷DNA的合成。而后者，VZV-TK激酶能將6-甲氧嘌呤阿拉伯糖苷（ara-M）轉(zhuǎn)化為有細胞毒作用的6-甲氧嘌呤阿糖苷腺苷三磷酸（ara-MTP）而殺傷轉(zhuǎn)染VZV-TK基因的細胞。 CD/5-FC系統(tǒng) 胞嘧啶脫氨酶基因（CD）存在于許多細菌和真菌中，人及其它哺乳動物中不表達

27、，CD酶可將胞嘧啶脫氨基轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?。將CD基因轉(zhuǎn)入體內(nèi)的腫瘤細胞后，再用高劑量的5-FC治療，CD酶可將5-FC轉(zhuǎn)變?yōu)?-FU從而發(fā)揮細胞殺傷作用。 自殺基因作用機制除了直接殺傷細胞外，還包括旁觀者效應(yīng)和誘導機體免疫兩個方面。 旁觀者效應(yīng)指表達自殺基因的細胞周圍未轉(zhuǎn)染基因的細胞也被前體藥物殺傷的現(xiàn)象，其機制有兩種可能： a)轉(zhuǎn)導自殺基因的腫瘤細胞前體藥物代謝產(chǎn)物可直接傳遞到鄰近的細胞，使臨近細胞死亡。 b)轉(zhuǎn)導自殺基因的腫瘤細胞的死亡是一種凋亡，細胞凋亡后凋亡小體能夠轉(zhuǎn)移一些毒性產(chǎn)物和自殺基因表達酶本身進入臨近的細胞，引起繼發(fā)性的凋亡。在體內(nèi)的旁觀者效應(yīng)還涉及到免疫系統(tǒng)的參與。 但自殺基因治

28、療的臨床試驗有效報道十分有限。腫瘤常在終止治療后復(fù)發(fā)，難以完全消除腫瘤的生長，其主要原因有 a)無論是HSV-TK/GCV還是CD/5-FC系統(tǒng)只能對處于增殖分裂期的腫瘤細胞有殺傷作用，而在體內(nèi)實體瘤中，有相當數(shù)量的細胞群體處于非增殖分裂狀態(tài)。 b)腫瘤細胞生物學的明顯異質(zhì)性使得有些細胞克隆對HSV-TK/GCV系統(tǒng)（或CD/5-FC系統(tǒng)）敏感，而有的細胞克隆對其不敏感，甚至會產(chǎn)生抗性。 c)由于目前基因轉(zhuǎn)移的效率還很低，無法使所有的腫瘤細胞均能被導入相應(yīng)的目的基因，從而限制了基因治療療效。雖然“旁觀者效應(yīng)”，在一定程度上彌補了基因轉(zhuǎn)移效率低的不足，但當腫瘤負荷較大時，“旁觀者效應(yīng)”也難以有效

29、發(fā)揮作用。 d)某些腫瘤特異的表達元件的活性較低，不足以表達足夠的自殺基因產(chǎn)物。（二）腫瘤的基因修飾瘤苗 T淋巴細胞介導的特異免疫反應(yīng)在殺滅腫瘤細胞中起主導作用，激發(fā)此抗腫瘤的細胞毒反應(yīng)需要以下3種信號的協(xié)同作用：有MHC分子呈遞腫瘤抗原，共刺激分子及擴大信號（細胞因子）?；蛐揎椖[瘤疫苗的原理是將一些外源基因（通常是一些細胞因子）導入腫瘤細胞中，從而改變細胞的致瘤性和增強免疫原性，有利于被機體的T淋巴細胞識別并激發(fā)特異性細胞毒反應(yīng)。常用的細胞因子有IL-2、IL-4、TNF、IFN-r、GM-CSF等?；蛐揎椷^的腫瘤細胞作為腫瘤疫苗用于臨床，必須要經(jīng)過鈷照射滅活其致瘤性，并且由于要發(fā)揮主動

30、免疫作用還要能在體內(nèi)存活一段時間以能夠持續(xù)分泌細胞因子、維持細胞表面MHC分子。（三）以DCs為基礎(chǔ)的腫瘤基因治療 DC是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強的抗原呈遞細胞，廣泛分布于除腦以外的全身各臟器。DC能攝取、加工抗原，表達高水平MHC分子、共刺激分子、黏附分子、并分泌高水平Thl型細胞因子IL-12，具有很強的抗原遞呈能力，可有效激發(fā)T淋巴細胞應(yīng)答。DC疫苗作為一種免疫治療方法，通過糾正腫瘤病人的免疫缺陷，啟動病人自身特異性殺瘤免疫反應(yīng)，較放、化療更為安全，有重要的臨床應(yīng)用價值。 運用基因轉(zhuǎn)染手段，用腫瘤抗原編碼基因修飾DC、腫瘤mRNA刺激DC、細胞因子修飾DC等方法增強DC的抗原呈遞能力，也是近來

31、腫瘤免疫治療的熱點。（四）抑癌基因的治療 抑癌基因的失活和（或）癌基因的激活在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起了重要作用，抑癌基因的治療原理就是通過野生型抑癌基因的轉(zhuǎn)染來恢復(fù)機體的抑制腫瘤的功能。常用于基因治療的抑癌基因有P53、P16、P21、APC等，野生型P53的腺病毒Ad-p53的基因治療和反轉(zhuǎn)錄病毒介導BRCA1的基因治療均已進入了臨床試驗。對于諸如BRCA1和BRCA2一類主要影響基因組完整性的基因，主要是選擇性的影響疾病發(fā)生的早期，對晚期腫瘤幾乎無影響。 其他的一些抑癌基因可以影響到基因組的穩(wěn)定性和腫瘤細胞的生存和生長。TP53基因的缺失能夠顯著提高增加腫瘤發(fā)生的概率。大多數(shù)結(jié)腸癌存在的AP

32、C基因的突變也可以影響到基因組的穩(wěn)定性。通過表達TP53或APC基因可以導致腫瘤細胞快速的生長抑制和凋亡。他們潛在的治療價值似乎依賴于急性效應(yīng)而非維護基因組的穩(wěn)定性。 抑癌基因治療的結(jié)果提供了一些證據(jù)就是轉(zhuǎn)導抑癌基因的確具有治療價值，但是治療效應(yīng)僅局限于轉(zhuǎn)導的細胞，對周圍未受感染的腫瘤細胞幾乎沒有效應(yīng)。這就意味著要求所有的腫瘤細胞都要被感染，特別是對散在分布的腫瘤而言，這是一個巨大的障礙。 但腺病毒介導的TP53基因治療實體瘤時可見對周圍細胞也有抗腫瘤效用。對TP53的效應(yīng)一個令人感興趣的介釋是TP53可能下調(diào)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達，上調(diào)一種潛在的血管生成抑制因子血小板反應(yīng)蛋白的表

33、達。這些結(jié)果表明，抑癌基因治療在體內(nèi)作用時面臨著巨大的生物學復(fù)雜性，顯示了這些治療基因的作用原理不能用它們單獨直接的腫瘤殺傷效應(yīng)來解釋，而存在更深刻的生物學效應(yīng)。（五）復(fù)制型病毒治療 腫瘤病毒治療學就是利用病毒在腫瘤細胞內(nèi)的增殖作為腫瘤細胞的裂解物用以治療癌癥。隨著基因工程學的快速進步和對病毒生物學知識，腫瘤發(fā)生發(fā)展過程及病毒與腫瘤之間的相互作用的深入了解，采用病毒治療腫瘤已經(jīng)取得了可喜的進步。目前應(yīng)用于腫瘤治療的復(fù)制型病毒主要包括單純皰疹病毒和腺病毒。 單純皰疹病毒 經(jīng)基因工程改造的突變型的單純皰疹病毒主要針對分裂期細胞，其缺乏編碼核苷酸還原酶的基因，因此能有效地在分裂期細胞中復(fù)制。 通過腫

34、瘤動物模型直接注射病毒進入小鼠腦瘤中，獲得令人鼓舞的治療結(jié)果。其后，被進一步應(yīng)用到惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤的I期臨床試驗當中，結(jié)果顯示，病毒被直接注射進入腫瘤的方法是安全和可以耐受的，而且具有一定的療效。 腺病毒 復(fù)制型腺病毒是腫瘤治療中研究最為廣泛的病毒。復(fù)制型腺病毒具有以下優(yōu)點： a)由于具有復(fù)制性，因此所需的病毒顆粒較少； b)能擴展至鄰近腫瘤細胞，作用的范圍較廣； c)復(fù)制型病毒可產(chǎn)生抗腫瘤免疫反應(yīng)。 近年來對腺病毒生物學的研究取得了突破性的進展，研究出能夠具有選擇性在腫瘤細胞中專一復(fù)制的腺病毒。主要分為兩類： a)一類利用腫瘤特異表達的調(diào)控序列如甲胎蛋白（AFP）啟動子、前列腺特異抗原（PSA

35、）啟動子、MUCI啟動子等調(diào)控表達EIA序列的表達，從而控制病毒的復(fù)制； b)另一類利用腫瘤細胞生物學特性，如利用腺病毒復(fù)制時抵抗宿主細胞凋亡所可能相關(guān)的E1B55K蛋白。當病毒E1B55K蛋白發(fā)生變異或缺失時，病毒復(fù)制的宿主細胞就會發(fā)生凋亡，從而復(fù)制不能完成。目前大部分的研究集中于動物和細胞實驗階段，僅有少數(shù)研究已經(jīng)進入臨床階段。 3基因治療中存在的問題與展望 腫瘤基因治療的實驗研究取得了許多可喜的結(jié)果，而其臨床試驗進展相對緩慢，目前腫瘤基因治療的臨床試驗多限于不能治愈的晚期腫瘤患者。為了促進腫瘤基因治療的發(fā)展，需要針對以下方面開展深入的研究。（一）發(fā)展更好的體內(nèi)轉(zhuǎn)導系統(tǒng) 應(yīng)具備高治療指數(shù)，

36、大容量裝載能力，靶向轉(zhuǎn)導以及更有效的基因轉(zhuǎn)導等特性，但無免疫原性且細胞毒性較低。（二）靶細胞中基因轉(zhuǎn)導表達的生理樣調(diào)控 即持續(xù)或可調(diào)控的組織特異性表達，并具有穩(wěn)定、高效的特點。（三）導入基因的安全性 基因治療應(yīng)確保不因?qū)胪庠茨康幕蚨a(chǎn)生新的有害遺傳變異，任一方案的實施都要根據(jù)嚴格的技術(shù)規(guī)程與標準，由有關(guān)行政管理部門批準實施。目前與安全性聯(lián)系最大的就是有關(guān)生殖細胞基因治療的問題。由于生殖細胞可以傳給后代，特別是目前基因治療尚不完善，為防止基因治療給后代帶來可能損害，改變?nèi)祟惢蛐畔Ⅲw，國際上從倫理方面嚴禁用于人類生殖細胞。但是目前生殖細胞的基因治療在動物實驗已獲成功，即轉(zhuǎn)基因動物的出現(xiàn)。這一

37、事實給人類生殖細胞基因治療帶來了希望，同時也使人們擔心這種遺傳特征變化的世代相傳將給人類帶來是福是禍。因此許多科學家不僅對此持慎重態(tài)度，還有不少持反對態(tài)度者。 四、生物治療與其它治療相結(jié)合 1腫瘤的治療方法主要是手術(shù)治療、放療和化療。這些方法基本上都是直接殺傷腫瘤細胞，但不能完全殺滅腫瘤細胞，而且損傷了正常組織，特別對在機體抗腫瘤防御中占重要地位的免疫系統(tǒng)造成很大的傷害，尤其是細胞免疫。在現(xiàn)代分子生理學和基因工程技術(shù)飛速發(fā)展的推動下，以免疫治療為基礎(chǔ)發(fā)展而來的生物治療日益受到重視，顯示出良好的應(yīng)用前景，成為腫瘤治療的第4種主要方法。 2腫瘤的生物治療是指通過腫瘤宿主防御機制或生物制劑的作用來調(diào)節(jié)機體自身的生物學反應(yīng)，從而抑制或消除腫瘤生長的治療方法。其抗腫瘤機制包括： （一）增強宿主的防御機制效