章 免疫學檢測

1、章 免疫學檢測提要 利用免疫學原理建立的免疫學檢測技術主要應用于對多種免疫性疾?。ǜ腥拘约膊　⒚庖呷毕莶　⒊舴磻?、自身免疫病、免疫增殖病、移植排斥反應和腫瘤等）的診斷、療效評估、發(fā)病機制探討、以及對抗原性物質或免疫細胞的定性、定量，對細胞因子、粘附分子及細胞受體的檢測等。第一節(jié) 抗原或抗體的檢測 抗原-抗體反應包括沉淀反應、凝集反應、補體結合反應和中和反應等。 抗原-抗體反應可用已知的特異性抗體檢測未知的抗原；也可用已知的抗原檢測未知的抗體。 免疫熒光技術、免疫酶技術、同位素標記技術、發(fā)光免疫分析等免疫標記技術提高了抗原抗體反應的敏感性。抗原-抗體反應的特點抗原-抗體的結合是特異性結合抗原抗

2、體結合是分子表面的非共價鍵結合抗原抗體反應可分為兩個階段 特異性結合階段 可見的反應階段抗原和抗體結合是否呈現(xiàn)可見的反應現(xiàn) 象，于兩者的濃度和比例密切相關抗原抗體比例對反應現(xiàn)象的影響抗原-抗體反應受多種因素影響1 電解質：抗原-抗體反應通常應用0.85%的氯化鈉作為稀釋液 ，以供給適應濃度的電解質。2 溫度：一般常使用反應在37度水浴或孵育箱中進行。3.酸堿度：抗原-抗體反應適應的酸堿度為PH6-8。抗原抗體的檢測方法凝集反應沉淀反應免疫標記技術蛋白質芯片技術凝集反應(Agglutination) 細菌、紅細胞等顆粒性抗原與相應抗體結合后形成凝集現(xiàn)象，稱為凝聚反應。 1、直接凝集：將細菌或紅細

3、胞與相應的抗體直接反應，出現(xiàn)細菌凝集或紅細胞凝集現(xiàn)象。又分為玻片法和試管法。 2、間接凝集：將可溶性抗原包被在紅細胞或乳膠顆粒表面，與相應抗體反應出現(xiàn)顆粒凝集現(xiàn)象。血 球 凝 集沉淀反應（Precipitation) 血清蛋白質、細胞裂解液或組織浸液等可溶性抗原與相應抗體結合后出現(xiàn)沉淀物，這一類反應稱為沉淀反應。沉淀反應可在液體中進行，如絮狀沉淀。大多沉淀反應是用半固體瓊脂凝膠為介質，進行瓊脂擴散故也稱免疫擴散。單向免疫擴散(Single Immunodiffusion)是將一定量已知抗體混于瓊脂凝膠中制瓊脂板，在適當位置打孔后將抗原加入孔中擴散?？乖跀U散過程中與凝膠中的抗體相遇，形成以抗原

4、孔為中心的沉淀環(huán)，環(huán)的直徑與抗原含量成正比相關。本法常用于測定血清IgG、IgM、IgA 和 C 3等的含量。含抗體的凝膠沉淀環(huán)雙向免疫擴散 （Double Immunodiffusion)是將抗原與抗體分別加入瓊脂凝膠的小孔中，二者自由向周圍擴散并相遇，在比例合適處形成沉淀線。如果反應體系中含兩種以上的抗原抗體系統(tǒng)，則小孔間可出現(xiàn)兩條以上的沉淀線。本法常用于抗原或抗體的定性 、組成和兩種抗原相關性分析的檢測。免疫電泳（Immunoelectrophoresis)是先將待側血清標本作瓊脂凝膠電泳，血清中各蛋白組分被分成不同的區(qū)帶，然后與電泳方向平行挖一小槽，加入相應的抗血清，把分成區(qū)帶的蛋白抗

5、原成分作雙向免疫擴散，在各區(qū)帶相應的位置形成沉淀弧。該法常用于血清蛋白種類分析，以觀察Ig的異常增多或缺失?；鸺娪荆≧ocket Electrophoresis) 火箭電泳也稱免疫擴散，是把單向免疫擴散同電泳結合在一起的方法?？乖诤卸靠贵w的瓊脂中泳動，兩者比例適宜時，在較短時間內(nèi)生成錐形的沉淀峰。在一定濃度范圍內(nèi)，沉淀峰的高度與抗原含量成正比。此法的特點是需時較短，故可用于快速沉淀標本中抗原的含量?；鸺娪臼疽鈭D補體結合反應（Complement Fixation, CFT) 敏感性和特異性均較高，但該試驗影響因素較多，現(xiàn)在已有被其它新方法取代的趨勢。免疫標記技術 用熒光素、同位素或酶

6、等示蹤物質標記抗體（或抗原）進行抗原-抗體反應。標記物質與抗體（或抗原）的化學連接未改變抗體（或抗原）的免疫學特性，同時標記物的性質依然存在，因而極大的提高了反應的靈敏度，可以對微量物質進行定量、定性或定位檢測。免疫標記技術主要有三種基本類型：免疫熒光技術、免疫酶技術和同位素標記技術。免疫熒光顯微技術(Immunofluorescence Technique) 是用熒光素（常用的有異硫氰酸熒光素，F(xiàn)ITC) 與抗體連接成熒光抗體，再與待測標本的抗原反應，置熒光顯微鏡下觀察，抗原抗體復合物散發(fā)出熒光，借此對標本中的抗原作鑒定和定位。 包括直接熒光法、間接熒光法。直接熒光法：將熒光素直接標記抗體作

7、標本染色。該法的優(yōu)點是特異性強，但其缺點是每檢測一種抗原必須制備相應的熒光抗體。間接熒光法：用一抗與標本中的抗原結合，再用熒光素標記的二抗染色。該法的優(yōu)點是敏感性比直接法高，制備一種熒光素標記的二抗可用于多種抗原的檢測，但非特異性熒光亦會增加。間接免疫熒光法示意圖免疫熒光顯微技術流式細胞術（Flow Cytometry, FCM) FCM是將免疫熒光技術應用于流式細胞儀，對單個細胞的表面標志（抗原或受體）進行快速、精確的分析和自動檢測，并將不同類型的細胞分選收集。FCM還可對同一細胞的多種參數(shù)（如DNA、RNA、蛋白質和細胞體積等）進行多信息分析，為當代生命科學研究領域中廣泛使用的一項新技術。

8、流式細胞術流式細胞儀工作原理酶免疫測定(Enzyme Immunoassay, EIA) 是用酶（常用的有辣根過氧化物酶，HRP和堿性磷酸酶，AP) 標記的抗體進行的抗原抗體反應。EIA將抗原抗體反應的特異性與酶催化作用的高效性相結合，通過酶作用于底物后顯色來判定結果。常用的方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗和酶免疫組化法，前者測定可溶性抗原或抗體， 后者測定組織中或細胞表面的抗原。酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA)是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體（聚苯乙烯微量反應板）表面，使抗原抗體反應在固相表面進行。用洗滌法將液相中游離成分洗除。主要

9、有雙抗體夾心法、間接法BAS-ELISA等。 ELISA 檢測抗體放射免疫測定法(Radioimmunoassay, RIA)是用放射性核素標記抗原進行的免疫學檢測技術。它將放射性核素顯示的高靈敏性和抗原抗體反應的特異性結合，使檢測的敏感性達pg水平。常用于標記的放射性核素有I125和I131。常用于胰島素、生長激素、藥物等微量物質的測定。 Ag* Ab Ag 標記抗原 特異性抗體 待測抗原( Ag*-Ab)+ (Ag-Ab) 抗原抗體復合物分離Ag*-Ab 和游離Ag*從標準曲線上讀知含量測定Ag*-Ab和/或游離Ag*放射性 放射免疫測定法(RIA)示意圖RIA法原理及標準曲線 7550

10、30 100110100 1000未標記抗原濃度（ng/ml)結合/未結合的放射活性（%）免疫印跡法(Immunoblotting)是將凝膠電泳與固相免疫測定結合，先把電泳分區(qū)的蛋白質轉移到固相載體，再用酶免疫、放射免疫等技術測定。該法能分離分子大小不同的蛋白質并確定其分子量。常用于檢測多種病毒 如HIV 的抗體或抗原。免 疫 印 跡 法 示 意 圖第二節(jié) 淋巴細胞的測定 檢測各群體淋巴細胞的數(shù)量與功能是觀察機體免疫狀態(tài)的重要手段。外周血是病人主要的檢測標本，但僅代表再循環(huán)的淋巴細胞。實驗動物還可取胸腺、脾、淋巴結等作為標本進行檢查。(1) 抗凝靜脈血(2) 加等量NS(4) 密度梯度離心血漿

11、分離液RBCPBMCPMN(3) 混勻后，緩慢加于分離液上一、淋巴細胞類型和數(shù)目的測定1、花結試驗：E花結試驗可用于檢測T細胞數(shù)目。EA花結試驗可用于檢測B細胞數(shù)目。2、免疫熒光法3、免疫磁珠法花結試驗示意圖T細胞功能測定體外法 ：T細胞增殖試驗 形態(tài)學檢查 3H-TdR摻入法 MTT法體內(nèi)法 ： 用生物抗原或化學抗原作皮內(nèi)試驗。 OT-PPD皮試 SD-SK皮試 培養(yǎng)液3H-TdRPHA淋巴細胞全血分層液離心過濾測量放射性淋巴細胞增殖試驗（3H-TdR摻入法）示意圖靶細胞51Cr洗滌去除游離的51Cr效應細胞測量上清液中釋放的51Cr混合培養(yǎng)4-6小時細胞毒試驗（51Cr釋放法）示意圖酶聯(lián)免

12、疫斑點法（Enzyme-Linked Immunospot, ELISA)是在ELISA的基礎上建立的檢測抗體生成細胞及細胞因子產(chǎn)生細胞的方法。CK抗體包被的反應板 CK抗原包被的反應板加入淋巴細胞加入酶標記二抗加入底物檢測抗原特異性B細胞加入底物T細胞產(chǎn)生CK的檢測加入淋巴細胞加入酶標的CK抗體淋巴細胞轉化試驗（形態(tài)學示意圖）原理：人T細胞表面有PHA或ConA受體，T細胞在體外受PHA或ConA的刺激后能轉化為體積較大、代謝旺盛、且能進行分裂的淋巴細胞，以此測定T細胞的功能。 PHA刺激48-72小時淋巴細胞增殖3H-TdR摻入法原理：將單個核細胞中加入PHA共同培養(yǎng)，在終止培養(yǎng)前815小時加入氚標記的胸腺嘧啶核苷（3H-TdR), 經(jīng)-液體閃爍儀檢測淋巴細胞DNA的3H-