免疫細胞化學多媒體(1)

1、 第六章 免疫細胞化學技術（免疫組化） ( immunocytochemistry ) 是利用免疫反應來定位組織和 細胞中特異大分子的一類技術1 第一節(jié) 免疫細胞化學原理 第二節(jié) 免疫細胞化學方法 免疫細胞化學技術2 一、免疫反應的特異性 二、免疫細胞化學反應 三、抗原 四、抗體 五、標記物及其在光鏡和電鏡下可見性第一節(jié) 免疫細胞化學原理3 免疫反應的特異性表現在： 抗原作為一類結構復雜的大分子能刺激機體 產生對其特異的抗體并與抗體發(fā)生反應 抗體針對某種抗原分子而產生的，特異地識 別該抗原并與其結合 一、免疫反應的特異性 4 免疫細胞化學反應的原理： 把組織細胞中的特異分 子作為抗原,用在顯微

2、鏡下可 見的標記物標記特異抗體(或 者標記抗原抗體復合物)使特 異的免疫化學反應具有可見 性,從而間接地顯示抗原,達 到在細胞或細胞器水平定位 特異分子的目的 二、免疫細胞化學反應5組織抗原抗體標記物標記抗體1 熒光2 酶3 親和技術4 金標6抗原 免疫細胞化學反應過程為：標記物7間接法 直接法 兩種免疫反應方法8 抗 原： 凡能刺激機體產生抗體并能與 抗體特異結合的物質稱為抗原 抗原性： 物質所具有的這種特性稱為抗原性 三、抗原9 細胞中具有抗原性的化學成分有： 蛋白質 多肽 脂蛋白 多糖 脂多糖 糖蛋白 核蛋白 這些生物大分子都能用免疫細胞化學技術檢測嗎? 從生物學功能來看都包括了哪些物質

3、?10 酶、 受體、 抗體、 細胞外基質 激素、 細胞結構蛋白、病原體等具有抗原性的物質包括： 11 四、抗體 CCFcFabNNNNCC12Fab片段 具有抗體活性，決定某種抗體 與抗原結合的能力和特異性Fc片段 決定該抗體本身作為抗原刺激 機體產生抗體的能力和特異性 決定其本身抗原性抗體的結構13 免疫細胞化學技術中所用的抗體有兩種： 抗 血 清 多克隆抗體，是用提純的抗原 免疫動物后從動物血清制備得 到的 單克隆抗體 是指由單個產生特異抗體的 淋巴細胞分化增殖形成的 細胞克隆產生的抗體14 1 免疫熒光技術 2 免疫酶技術 3 免疫親和技術 4 膠體金技術五、標記物及其在光鏡和電鏡下的可

4、見性 標記物 使抗體或抗原 抗體復合物在 各種顯微鏡下 可的物質15 免疫熒光技術將 熒光素作為標記物 使組織細胞中形成的抗原抗體復合 物在熒光顯微鏡下可見，從而顯示 抗原物質的定位 （一） 免疫熒光技術 16 .異硫氰酸熒光素 .四乙基羅達明 .四甲基異硫氰酸羅達明 .藻紅蛋白 分子量不同 最大吸收光譜不同 最大發(fā)射光譜不同 與蛋白結合方式不同 呈現不同的熒光： 黃綠色熒光 橙色熒光 橙紅色熒光等 熒光素 能產生熒光并能作為染料的一類化合物17 熒 光： 在激發(fā)光（熒光顯微鏡提供）的照射下，能發(fā)出較激發(fā)光波長更長的可見光并隨照射停止而消失 熒光顯微鏡： 熒光顯微鏡的光源提供各種激發(fā)光，如 紫

5、外光、藍紫光（有不同的波長范圍） 使受檢標本內的熒光物質發(fā)光18 是將酶作為標記物使組織細胞中形成的抗原抗體復合物得到標記，再通過酶細胞化學反應產生顯微鏡下可見的顯色物質，間接顯示抗原物質的定位 （二） 免疫酶技術19 1.反應產物定位準確，顏色對比清晰 2.反應后標本材料可長期保存 3.能用于電鏡觀察免疫酶技術優(yōu)點：20酶抗原一抗二抗酶標二抗酶抗酶抗體復合物抗酶抗體21酶標抗體法抗酶抗體法 復合物法酶標記的三種形式22 用交聯劑將酶與抗體聯接成酶標抗體用于直接法和間接法 酶標抗體法23 用酶免疫動物獲得抗酶抗體，通過二抗的橋梁作用把抗酶抗體連接在一抗上,再加入酶及其底物，達到用酶標記抗原抗體

6、反應的效果 由于產生抗酶抗體的動物與產生第一抗體的動物是同一種屬，兩種抗體具有相同的免疫源性，所以在反應中本來針對一抗的二抗也能與抗酶抗體結合抗酶抗體法或稱酶橋法24 先獲得抗酶抗體并將抗酶抗體與酶一起預先制成酶抗酶抗體復合物 在反應中，由二抗的橋梁作用把復合物與一抗連接在一起 最后加入底物，從而達到用酶標記抗原抗體反應的效果 優(yōu)點: 1、抗體活性高 2、靈敏度高酶抗酶抗體復合物法25常用的標記酶： 1. 辣根過氧化物酶 2.堿性磷酸酶 常用的兩種方法是： （1）過氧化物酶標記抗體法 （2）過氧化物酶-抗過氧化物酶復合物法 （Peroxidase-Antiperoxidase,PAP） 一抗與

7、組織抗原特異結合 二抗又將PAP復合物與第一抗體連接在一起 然后加入HRP的天然底物H2 O2 和捕捉底物DAB 光鏡-棕黃色反應產物(組織抗原的定位).辣根過氧化物酶 （hoseradish peroxidase, HRP）26 .堿性磷酸酶（Alkaline phosphotase, AKP） 堿性磷酸酶技術常用的兩種方法： (1)堿性磷酸酶標記抗體 (2)堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶復合物法（APAAP） （Alkaline phosphotaseAntialkaline phosphotase） APAAP法的原理： 以堿性磷酸酶為標記物,再通過與其底物的細胞化學反應使抗原抗體反應可見 常

8、用的底物是萘酚,偶聯劑是固藍、固紅等 常用于標記的酶： 1. 辣根過氧化物酶 2.堿性磷酸酶27 利用兩種物質高度親和力而互相結合定位特異分子 親和物質 具有多價能力的物質，與親和物質有高 度親和力又能與抗體、蛋白質及各種標 記物(熒光素、酶、膠體金等)結合 最常用的親和物質系統： 1、生物素（biotin）與親和素（avidin） 兩者結合能力為不可逆的 2、葡萄球菌A蛋白與免疫球蛋白IgG （三） 親和細胞化學技術28 (1) 標記親和素生物素技術 （Labeled avidin biotin, LAB） (2) 橋式親和素生物素技術 （Bridged avidin biotin,BAB）

9、 (3) 親和素生物素-酶復合物技術 （Avidin-biotin peroxidase complex method，ABC）1.生物素系統標記技術的基本方法29生物素化酶生物素化抗體親和素生物素 酶復合物生物素親和素30 生物素與抗體共價偶聯后加入與過氧化物酶（或熒光素）結合的親和素 利用生物素親和素之間的結合，間接顯示組織細胞中的抗原 標記親和素生物素法 31 利用親和素為橋梁 連接生物素化的抗 體和生物素化的酶橋式親和素生物素法32 親和素生物素 - 酶復合物技術 親和素與生物素偶聯的過氧化物酶組合成親和素生物素酶復合物 特異性抗體（一抗）先與組織細胞中的抗原結合， 生物素化抗體（二抗

10、）再與一抗結合 復合物與生物素化抗體結合 33 葡萄球菌A蛋 (Staphylocal protein A, SPA) 是金黃色葡萄球菌細胞壁含有的一種蛋白 簡稱為A蛋白或蛋白A SPA能與人及多種哺乳動物血清中IgG呈 非特異性結合又能與標記物結合 經標記的SPA可代替相應標記的二抗2. 葡萄球菌A蛋白與IgG系統親和素34（四） 免疫膠體金技術 免疫膠體金技術是以光鏡和電鏡下都可見的膠體金作為抗體或蛋白的標記物，間接顯示組織細胞中特異分子的技術 膠體金顆粒大小一般在5-60nm35 膠體金顆粒表面帶負電荷，蛋白質表面帶正電荷，蛋白質在等電點或偏堿時被吸附于金顆粒表面,形成一個蛋白層阻止了金

11、顆粒的相互接觸，使免疫金處于穩(wěn)定狀態(tài)膠體金對蛋白質的標記:膠體金A蛋白36 1. 免疫金法 (Immunogold staining IGS) 2. 免疫金銀法 （Immunogold silver staining, IGSS) 3. 彩色免疫金銀法 （Coloured IGSS, CIGSS）免疫膠體金技術常用方法37免疫金法 一抗與抗原結合 金標抗體或金標A蛋作為二 抗與抗原抗體復合物結合 抗原抗體反應部位在光鏡 下呈現紅色，在電鏡下呈 高電子密度38 1、采用不同大小的金顆粒(通常5-20nm) 標記不同抗體或A蛋白，達到雙重甚至多 重標記定位多種抗原的目的 2、金顆粒便于計數，可對反

12、應作定量分析 3、可用于透射、掃描電鏡和冷凍蝕刻標本 可將結果與光鏡免疫金技術結果進行對照 免疫交體金體金優(yōu)點：39 免疫細胞化學技術是在原位檢測細胞中抗原 基本過程: 抗原固定 抗原與抗體結合反應 標記系統反應 第二節(jié) 免疫細胞化學方法40 一、樣品制備 二、抗體準備 三、基本實驗過程 四、一些關鍵問題41 固定 光鏡 醛類固定,常規(guī)石蠟包埋和切片 (冷凍切片化學固定免疫細胞化學反應) 電鏡 4多聚甲醛為首選固定劑 ( 多聚甲醛混合0.05-0.5%戊二醛 ) 包埋前技術 免疫細胞化學反應在未經 包埋的組織片上進行 包埋后技術 免疫細胞化學反應在超薄 切片上進行 一、樣品制備42 抗體制備：

13、特異抗體主要從購買獲得 (也可自行制備特異抗血清甚至單克隆抗體) 抗體標記:直接法 對每種一抗進行標記，很少用 間接法 對二抗進行標記 (標記二抗使用十分普遍) 標記抗體的方法： 1. 熒光素標記抗體方法 2. 酶標記抗體 3. 生物素化抗體 4. 膠體金標記抗體或A蛋白 二、抗體準備43 免疫細胞化學方法有: 直接法、間接法 間接法中有: 二抗、三抗或復合物 標記系統有: 熒光素、酶、親和素 膠體金 觀察方法有: 熒光顯微鏡、普通光鏡、電鏡三、基本實驗過程44 切片,丙酮固定，石蠟切片脫蠟復水 1%H2O2 /甲醇阻斷內源性過氧化物酶 正常羊血清(二抗的正常血清)1:20室溫封閉 適當稀釋一

14、抗(兔抗體)孵育 適當稀釋二抗(羊抗體)孵育 適當稀釋兔PAP復合物孵育 0.04%DAB+0.03%H2O2 顯色，充分水洗終止反應 蘇木素襯染,封片 光鏡觀察棕褐色陽性反應沉淀物 過氧化物酶抗過氧化物酶復合物法（PAP法）45 80nm左右厚度超薄切片置于鎳網上 1-10%H2O2蝕刻 1%BSA室溫封閉 適當稀釋一抗孵育室溫 1%BSA室溫封閉 適當稀釋的10-20nm金標A 含2%戊二醛/3%多聚甲醛固定 鈾、鉛染色 電鏡觀察高電子密度的金顆粒 電鏡包埋后膠體金細胞化學反應46 (一)樣品固定：抗原和結構的保存 (二)抗體、標記物以及方法選擇：單抗、多抗 種屬關系 (三)通透處理：蛋白酶、表面活性劑 (四)對照設定：陰性、陽性、自身對照 (五)非特異反應的鑒別和抑制：封閉、稀釋 阻斷 四、一些關鍵問題47 第六章 重點 一、免疫細胞化學反應原理 把組織細胞中的特異分子作為抗原, 用在顯微鏡下的可見標記物(或標記抗原抗體復合物)標記特異抗體,使特異的免疫化學反應具有可見性 從而間接地顯示抗原,達到在細胞或細胞器水平定位特異分子的目的48 二、簡述免疫細胞化學的直接法和間接法 直接法：組織抗原直接與標記的特異抗體反應 間接法：抗原與未標記的特異抗體（一抗）反應 一抗再作為抗原與標記的第二抗體反應49 三、何謂標記物，包括哪幾種？ 標記物：