微生實(shí)驗(yàn)報(bào)告 2012.10.31 實(shí)驗(yàn)四酵母菌的形態(tài)觀察及細(xì)胞死活的鑒別,微生物細(xì)胞大小的測定

1、微生實(shí)驗(yàn)報(bào)告姓名：王晶暉專業(yè)年級(jí)：2011級(jí)生物技術(shù)學(xué)號(hào)：040312011032實(shí)驗(yàn)四酵母菌的形態(tài)觀察及細(xì)胞死活的鑒別，微生物細(xì)胞大小的測定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?觀察酵母菌的形態(tài)及出芽生殖方式，學(xué)習(xí)區(qū)分酵母菌死活細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)方法；掌握酵母菌的一般形態(tài)特征及其與細(xì)菌的區(qū)別。2了解目鏡測微尺和鏡臺(tái)測微尺的構(gòu)造及使用原理，掌握測定微生物細(xì)胞大小的方法.3了解血球計(jì)數(shù)板的構(gòu)造和使用方法,學(xué)會(huì)用血球計(jì)數(shù)板對(duì)酵母細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。二、實(shí)驗(yàn)原理美藍(lán)是一種無毒性的染料，它的氧化型呈藍(lán)色，還原型無色。用美藍(lán)對(duì)酵母的活細(xì)胞進(jìn)行染色時(shí)，由于細(xì)胞的新陳代謝作用，細(xì)胞內(nèi)具有較強(qiáng)的還原能力，能使美藍(lán)由藍(lán)色的氧化型變?yōu)闊o色的還原型。因

2、此，具有還原能力的酵母細(xì)胞是無色的，而死細(xì)胞或代謝作用微弱的衰老細(xì)胞則呈藍(lán)色或淡藍(lán)色。微生物細(xì)胞的大小是微生物重要的形態(tài)特征之一，由于菌體微小，只能在顯微鏡下測量。用于測量微主物細(xì)胞大小的工具有目鏡測微尺和鏡臺(tái)測微尺。目鏡測微尺是一塊圓形玻片，在玻片中央把5mm長度刻成50等分，或把10mm長度刻成100等分。測量時(shí)，將其放在接目鏡中的隔板上（此處正好與物鏡放大的中間物像重疊）用于測量經(jīng)顯微鏡放大后的細(xì)胞物象。由于不同目鏡、物鏡組合的放大倍數(shù)不相同，目鏡測微尺每格實(shí)際表示的長度也不一樣，因此目鏡測微尺測量微生物大小時(shí)須先用置于鏡臺(tái)上的鏡臺(tái)測微尺校正，以求出在一定放大倍數(shù)下，目鏡測微尺每小格所代

3、表的相對(duì)長度。鏡臺(tái)測微尺是中央部分刻有精確等分線的專用載玻片，一般將lmm等分為100格，每格長10um，每格長（0.01mm）,是專門用來校正目鏡測微尺的。校正時(shí)，將鏡臺(tái)測微尺放在載物臺(tái)上，由于鏡臺(tái)測微尺與細(xì)胞標(biāo)本是處于同一位置，都要經(jīng)過物鏡和目鏡的兩次放大成像進(jìn)入視野，即鏡臺(tái)測微尺隨著顯微鏡總放大倍數(shù)的放大而放大，因此從鏡臺(tái)測微尺上得到的讀數(shù)就是細(xì)胞的真實(shí)大小，所以用鏡臺(tái)測微尺的已知長度在一定放大倍數(shù)下校正目鏡測微尺，即可求出目鏡測微尺每格所代表的實(shí)際長度，然后移去鏡臺(tái)測微尺，換上待測標(biāo)本片，用校正好的目鏡測微尺在同樣放大倍數(shù)下測量微生物細(xì)胞大小。利用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)，是一種常

4、用的微生物計(jì)數(shù)方法。此法的優(yōu)點(diǎn)是直觀、快速。將經(jīng)過適當(dāng)稀釋的菌懸液（或孢子懸液）放在血球計(jì)數(shù)板載玻片與蓋玻片之間的計(jì)數(shù)室中，在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)。由于計(jì)數(shù)室的容積是一定的（0.Imm2）,所以可以根據(jù)在顯微鏡下觀察到的微生物數(shù)目來換算成單位體積內(nèi)的微生物總數(shù)目。由于此法計(jì)得的是活菌體和死菌體的總和，故又稱為總菌計(jì)數(shù)法。血球計(jì)數(shù)板，通常是一塊特制的載玻片，其上由四條槽構(gòu)成三個(gè)平臺(tái)。中間的平臺(tái)又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺(tái)上各刻有一個(gè)方格網(wǎng)，每個(gè)方格網(wǎng)共分九個(gè)大方格，中間的大方格即為計(jì)數(shù)室，微生物的計(jì)數(shù)就在計(jì)數(shù)室中進(jìn)行。計(jì)數(shù)室的刻度一般有兩種規(guī)格，一種是一個(gè)大方格分成16個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又

5、分成25個(gè)小方格；另一種是一個(gè)大方格分成25個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成16個(gè)小方格。但無論是哪種規(guī)格的計(jì)數(shù)板，每一個(gè)大方格中的小方格數(shù)都是相同的，即16X25=400小方格。每一個(gè)大方格邊長為1mm,則每一大方格的面積為1mm2,蓋上蓋玻片后，載玻片與蓋玻片之間的高度為0.1mm,所以計(jì)數(shù)室的容積為0.1mm3o在計(jì)數(shù)時(shí)，通常數(shù)五個(gè)中方格的總菌數(shù)，然后求得每個(gè)中方格的平均值，再乘上16或25,就得出一個(gè)大方格中的總菌數(shù)，然后再換算成1ml菌液中的總菌數(shù)。下面以一個(gè)大方格有25個(gè)中方格的計(jì)數(shù)板為例進(jìn)行計(jì)算:設(shè)五個(gè)中方格中總菌數(shù)為A,菌液稀釋倍數(shù)為B，那么，一個(gè)大方格中的總菌數(shù)因1ml=1cm3

6、=1000mm3,故lml菌液中的總菌數(shù)X25X10X1000XB同理，如果是16個(gè)中方格的計(jì)數(shù)板，設(shè)五個(gè)中方格的總菌數(shù)為A則A加1菌液中總菌數(shù)=isxioioooB三、實(shí)驗(yàn)儀器1、顯微鏡2、血球計(jì)數(shù)板3、目鏡測微尺4、鏡臺(tái)測微尺5、蓋玻片6、吸水紙7、計(jì)數(shù)器8、移液器9、擦鏡紙四、實(shí)驗(yàn)試劑1、菌種：培養(yǎng)48h的酵母菌2、染色液和試劑：0.05%、0.1%呂氏堿性美藍(lán)五、實(shí)驗(yàn)步驟1、目微尺的校正：把Olympus目鏡的下部羅圈旋下，將目鏡測微尺的刻度朝下輕輕地裝入目鏡的隔板上,把鏡臺(tái)測微尺置于載物臺(tái)上，刻度朝上。先用低倍鏡觀察，對(duì)準(zhǔn)焦距，視野中看清鏡臺(tái)測微尺的刻度后，轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡，使目鏡測微尺與鏡

7、臺(tái)測微尺的刻度平行，移動(dòng)推動(dòng)器，使兩尺重疊,再使兩尺的“0”刻度完全重合，定位后，仔細(xì)尋找兩尺第二個(gè)完全重合的刻度，計(jì)數(shù)兩重合刻度之間目鏡測微尺的格數(shù)和鏡臺(tái)測微尺的格數(shù)。因?yàn)殓R臺(tái)測微尺的刻度每格長10um，所以由下列公式可以算出目鏡測微尺每格所代表的實(shí)際長度。用同法分別校正在低倍鏡下和高倍鏡下目鏡測微尺每小格所代表的長度。目鏡測撤尺每格長度（pm）兩重合線間鏡臺(tái)測微尺的格數(shù)X10_兩重合線間目鏡測微尺的格數(shù)2、酵母菌形態(tài)觀察及死活細(xì)胞鑒別1）制片：在一個(gè)載玻片上分別滴0.05%、0.1%呂氏堿性美藍(lán)各1滴，無菌操作取酵母菌，在染液中分別混勻，蓋上蓋玻片，靜置5分鐘。2）鏡檢：在顯微鏡高倍鏡下觀

8、察酵母菌的形態(tài)及出芽生殖方式。3）計(jì)數(shù)死活細(xì)胞：死細(xì)胞為染為蘭色的細(xì)胞，活細(xì)胞為無色細(xì)胞，分別計(jì)數(shù)，并隔5-15分鐘檢測一下死活細(xì)胞數(shù)，比較其死活細(xì)胞的比例變化。3細(xì)胞大小的測定：移去鏡臺(tái)測微尺，換上酵母菌染色片，先在低倍鏡下找到目的物，然后在高倍鏡下用目鏡測徽尺來測量酵母菌菌體的長，寬各占幾格（不足一格的部分估計(jì)到小數(shù)點(diǎn)后一位數(shù)）。測出的格數(shù)乘上目鏡測微尺每格的校正值，即等于該菌的長和寬。一般測量菌體的大小要在同一個(gè)標(biāo)本片上測定1020個(gè)菌體，才能代表該菌的大小。待測微生物需用培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期的菌體進(jìn)行測定。六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、繪圖說明酵母菌形態(tài)及出芽方式2、為什么目鏡測微尺使用前必須校正？答：

9、因?yàn)椴煌奈镧R、目鏡以及顯微鏡本身會(huì)產(chǎn)生放大倍數(shù)的差異，因此要校準(zhǔn)顯微測微尺,以便使結(jié)果精確。3、目鏡測微尺校正結(jié)果物鏡目鏡測微尺格數(shù)鏡臺(tái)測微尺格數(shù)目鏡測微尺校正值(um)10X2510440X4820.424、酵母菌大小測定記錄123456789101112131415平均值長44554.554.54.5555.5555.575寬3444.53.543.53.5444.54454.54測得酵母菌寬約4.15um,長約5.22um5、顯微鏡直接計(jì)數(shù)法實(shí)驗(yàn)結(jié)果每個(gè)中方格菌數(shù)AB平均數(shù)12345第一室3228352437156100780000000第二室343238303617010085000

10、0000室平均菌數(shù)為815000000七、思考題1、為什么目測尺使用前必須校正？答：因?yàn)椴煌奈镧R、目鏡以及顯微鏡本身會(huì)產(chǎn)生放大倍數(shù)的差異，因此要校準(zhǔn)顯微測微尺，以便使結(jié)果精確。2、呂氏堿性美藍(lán)染色液濃度和作用時(shí)間的不同，對(duì)酵母菌死活細(xì)胞數(shù)量有何影響？答：呂氏堿性美藍(lán)染色液濃度過高或作用時(shí)間過長會(huì)造成細(xì)胞脫水死亡并滲透染液，造成更多的死細(xì)胞，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果；呂氏堿性美藍(lán)染色液濃度過低或作用時(shí)間過短會(huì)使死細(xì)胞染不上顏色，不利于觀察。3、你認(rèn)為在顯微鏡下，細(xì)菌、放線菌、酵母菌、霉菌的主要區(qū)別是什么？答：細(xì)菌為很多圓球狀或小桿狀,放線菌像亂線團(tuán),霉菌為很多亂粗枝,酵母是較細(xì)菌明顯大一點(diǎn)的橢圓球狀4、根據(jù)你的體會(huì)，說