引物設(shè)計(jì)的原則

1、引物設(shè)計(jì)的原則引物設(shè)計(jì)有3條基本原則：首先引物與模板的序列要緊密互補(bǔ)，其次引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚 體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，再次引物不能在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA聚合反應(yīng)(即錯(cuò)配)。具體實(shí)現(xiàn)這3條基本原則需要考慮到諸多因素，如引物長(zhǎng)度(primer length)，產(chǎn)物長(zhǎng)度(product length)， 序列Tm值(melting temperature)，引物與模板形成雙鏈的內(nèi)部穩(wěn)定性(internal stability,用？G值反 映)，形成引物二聚體(primer dimer)及發(fā)夾結(jié)構(gòu)(duplex formation and hairpin)的能值，在錯(cuò)配位點(diǎn)(false pr

2、iming site)的引發(fā)效率，引物及產(chǎn)物的GC含量(composition)，等等。必要時(shí)還需對(duì)引物 進(jìn)行修飾，如增加限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，引進(jìn)突變等。根據(jù)有關(guān)參考資料和筆者在實(shí)踐中的總結(jié)，引物設(shè)計(jì) 應(yīng)注意如下要點(diǎn)：引物的長(zhǎng)度一般為15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不應(yīng)大于38,因?yàn)檫^(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74C， 不適于Taq DNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)2。引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒(méi)有相似性較高，尤其是3端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯(cuò)配。引物3 端出現(xiàn)3個(gè)以上的連續(xù)堿基，如GGG或CCC，也會(huì)使錯(cuò)誤引發(fā)機(jī)率增加2。引物3端的末位堿基對(duì)Taq酶的DNA合成效率有較大的影響。不同的末位堿基

3、在錯(cuò)配位置導(dǎo)致不同 的擴(kuò)增效率，末位堿基為A的錯(cuò)配效率明顯高于其他3個(gè)堿基，因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的3端使用堿基 A34。另外，引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗。5端序列對(duì)PCR影響不太大，因此常 用來(lái)引進(jìn)修飾位點(diǎn)或標(biāo)記物2。引物序列的GC含量一般為40-60%，過(guò)高或過(guò)低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太 大25。引物所對(duì)應(yīng)模板位置序列的Tm值在72C左右可使復(fù)性條件最佳。Tm值的計(jì)算有多種方法，如按公式 Tm = 4(G+C)+2(A+T)，在 Oligo 軟件中使用的是最鄰近法(the nearest neighbor method) 67。?G值是指DNA雙鏈形成

4、所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對(duì)的相對(duì)穩(wěn)定性。應(yīng)當(dāng)選用3 端?G值較低(絕對(duì)值不超過(guò)9)，而5端和中間?G值相對(duì)較高的引物。引物的3端的?G值過(guò)高，容 易在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng)6。引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值過(guò)高(超過(guò)4.5kcal/mol)易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效 濃度而使PCR反應(yīng)不能正常進(jìn)行8。對(duì)引物的修飾一般是在5端增加酶切位點(diǎn)，應(yīng)根據(jù)下一步實(shí)驗(yàn)中要插入PCR產(chǎn)物的載體的相應(yīng)序列而 確定。值得一提的是，各種模板的引物設(shè)計(jì)難度不一。有的模板本身?xiàng)l件比較困難，例如GC含量偏高或偏低，導(dǎo) 致找不到各種指標(biāo)都十分合適的引物；在用作克隆目的的PCR因?yàn)?/p>

5、產(chǎn)物序列相對(duì)固定，弓I物設(shè)計(jì)的選擇自 由度較低。在這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件。引物的自動(dòng)搜索和評(píng)價(jià)分析軟件的引物設(shè)計(jì)功能主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面：首先是引物分析評(píng)價(jià)功能，該功能只有少數(shù)商業(yè)版軟件能夠做 到，其中以“Oligo6”最優(yōu)秀；其次是引物的自動(dòng)搜索功能，各種軟件在這方面的側(cè)重點(diǎn)不同，因此自動(dòng) 搜索的結(jié)果也不盡相同。據(jù)筆者的經(jīng)驗(yàn)，自動(dòng)搜索功能以“PremierPrimer”為最強(qiáng)且方便使用，“Oligo 6”其次，其他軟件如“Vector NTI Suit”、“Dnasis”、“Omiga”和“Dnastar”都帶有引物自動(dòng)搜索 功能，但搜索結(jié)果不是十分理想。要想得到效果很好的引物

6、，在自動(dòng)搜索的基礎(chǔ)上還要輔以人工分析。筆 者認(rèn)為引物設(shè)計(jì)軟件的最佳搭配是“Oligo”和“Premier”軟件合并使用，以“Premier”進(jìn)行自動(dòng)搜索， “Oligo ”進(jìn)行分析評(píng)價(jià)，如此可快速設(shè)計(jì)出成功率很高的引物。Primer Premier 5.0的使用技巧簡(jiǎn)介功能“Premier”的主要功能分四大塊，其中有三種功能比較常用，即引物設(shè)計(jì)()、限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)分析() 和DNA基元(motif)查找()Premier ”還具有同源性分析功能()，但并非其特長(zhǎng)，在此略過(guò)。此外， 該軟件還有一些特殊功能，其中最重要的是設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，另外還有序列“朗讀”、DNA與蛋白序列的互 換()、語(yǔ)音提示

7、鍵盤輸入()等等。有時(shí)需要根據(jù)一段氨基酸序列反推到DNA來(lái)設(shè)計(jì)引物，由于大多數(shù)氨基酸(20種常見(jiàn)結(jié)構(gòu)氨基酸中的18 種)的遺傳密碼不只一種，因此，由氨基酸序列反推DNA序列時(shí)，會(huì)遇到部分堿基的不確定性。這樣設(shè)計(jì) 并合成的引物實(shí)際上是多個(gè)序列的混和物，它們的序列組成大部分相同，但在某些位點(diǎn)有所變化，稱之為 簡(jiǎn)并引物。遺傳密碼規(guī)則因物種或細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)的不同而異，比如在線粒體內(nèi)的遺傳密碼與細(xì)胞核是不一樣 的“Premier ”可以針對(duì)模板DNA的來(lái)源以相應(yīng)的遺傳密碼規(guī)則轉(zhuǎn)換DNA和氨基酸序列。軟件共給出八 種生物亞結(jié)構(gòu)的不同遺傳密碼規(guī)則供用戶選擇，有纖毛蟲(chóng)大核(Ciliate Macronuclear

8、)、無(wú)脊椎動(dòng)物線 粒體(Invertebrate Mitochondrion)、支原體(Mycoplasma)、植物線粒體(Plant Mitochondrion)、 原生動(dòng)物線粒體(Protozoan Mitochondrion)、一般標(biāo)準(zhǔn)(Standard)、脊椎動(dòng)物線粒體(Vertebrate Mitochondrion)和酵母線粒體(Yeast Mitochondrion)。使用步驟及技巧“Premier ”軟件啟動(dòng)界面如下：(轉(zhuǎn)載的時(shí)候就沒(méi)有圖) 其主要功能在主界面上一目了然(按鈕功能如上述)。限制性酶切點(diǎn)分析及基元查找功能比較簡(jiǎn)單，點(diǎn)擊 該功能按鈕后，選擇相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶或基元(

9、如-10序列，-35序列等)，按確定即可。常見(jiàn)的限制 性內(nèi)切酶和基元一般都可以找到。你還可以編輯或者添加新限制性內(nèi)切酶或基元。進(jìn)行引物設(shè)計(jì)時(shí)，點(diǎn)擊按鈕，界面如下：進(jìn)一步點(diǎn)擊按鈕，出現(xiàn)“ search criteria ”窗口，有多種參數(shù)可以調(diào)整。搜索目的(Seach For)有三種 選項(xiàng)，PCR 引物(PCR Primers)，測(cè)序引物(Sequencing Primers)，雜交探針(Hybridization Probes)。 搜索類型(Search Type)可選擇分別或同時(shí)查找上、下游引物(Sense/Anti-sense Primer，或Both)，或 者成對(duì)查找(Pairs)，或者

10、分別以適合上、下游引物為主Compatible with Sense/Anti-sense Primer)o 另外還可改變選擇區(qū)域(Search Ranges)，引物長(zhǎng)度(Primer Length)，選擇方式(Search Mode)，參 數(shù)選擇(Search Parameters)等等。使用者可根據(jù)自己的需要設(shè)定各項(xiàng)參數(shù)。如果沒(méi)有特殊要求，建議使 用默認(rèn)設(shè)置。然后按，隨之出現(xiàn)的Search Progress窗口中顯示Search Completed時(shí)，再按，這時(shí)搜索結(jié)果以表格的形 式出現(xiàn)，有三種顯示方式，上游引物(Sense)，下游引物(Anti-sense)，成對(duì)顯示(Pairs)。默認(rèn)

11、顯示為 成對(duì)方式，并按優(yōu)劣次序(Rating)排列，滿分為100，即各指標(biāo)基本都能達(dá)標(biāo)(如下圖)。點(diǎn)擊其中一對(duì)引物，如第1#引物，并把上述窗口挪開(kāi)或退出，顯示“ PeimerPremier ”主窗口，如圖所示: 該圖分三部分，最上面是圖示PCR模板及產(chǎn)物位置，中間是所選的上下游引物的一些性質(zhì)，最下面是四種 重要指標(biāo)的分析，包括發(fā)夾結(jié)構(gòu)(Hairpin)，二聚體(Dimer)，錯(cuò)誤引發(fā)情況(False Priming)，及上 下游引物之間二聚體形成情況(Cross Dimer)。當(dāng)所分析的引物有這四種結(jié)構(gòu)的形成可能時(shí)，按鈕由變成， 點(diǎn)擊該按鈕，在左下角的窗口中就會(huì)出現(xiàn)該結(jié)構(gòu)的形成情況。一對(duì)理想的

12、引物應(yīng)當(dāng)不存在任何一種上述結(jié) 構(gòu)，因此最好的情況是最下面的分析欄沒(méi)有，只有。值得注意的是中間一欄的末尾給出該引物的最佳退火 溫度，可參考應(yīng)用。在需要對(duì)引物進(jìn)行修飾編輯時(shí)，如在5端加入酶切位點(diǎn)，可點(diǎn)擊，然后修改引物序列。若要回到搜索結(jié) 果中，則點(diǎn)擊按鈕。如果要設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，只需根據(jù)源氨基酸序列的物種來(lái)源選擇前述的八種遺傳密碼規(guī) 則，反推至DNA序列即可。對(duì)簡(jiǎn)并引物的分析不需像一般引物那樣嚴(yán)格?？傊?，“Premier”有優(yōu)秀的引 物自動(dòng)搜索功能，同時(shí)可進(jìn)行部分指標(biāo)的分析，而且容易使用，是一個(gè)相當(dāng)不錯(cuò)的軟件。Oligo 6.22使用技巧簡(jiǎn)介1.功能在專門的引物設(shè)計(jì)軟件中，“Oligo”是最著名的。它

13、的使用并不十分復(fù)雜，但初學(xué)者容易被其復(fù)雜的圖表 嚇倒。Oligo 5.0的初始界面是兩個(gè)圖：Tm圖和 G圖；Oligo 6.22的界面更復(fù)雜，出現(xiàn)三個(gè)圖，加了 個(gè)Frq圖?！癘ligo”的功能比“Premier”還要單一，就是引物設(shè)計(jì)。但它的引物分析功能如此強(qiáng)大以至 于能風(fēng)靡全世界。2.使用（以O(shè)ligo 6.22為例）Oligo 6.22的啟動(dòng)界面如下：圖中顯示的三個(gè)指標(biāo)分別為Tm、 G和Frq，其中Frq是6.22版本的新功能，為鄰近6至7個(gè)堿基組成 的亞單位在一個(gè)指定數(shù)據(jù)庫(kù)文件中的出現(xiàn)頻率。該頻率高則可增加錯(cuò)誤引發(fā)的可能性。因?yàn)榉治鲆婕岸?個(gè)指標(biāo)，起動(dòng)窗口的cascade排列方式不太方

14、便，可從windows菜單改為tili方式。如果覺(jué)得太擁擠， 可去掉一個(gè)指標(biāo)，如Frq，這樣界面的結(jié)構(gòu)同于Oligo5.0，只是顯示更清楚了。經(jīng)過(guò)Windows/Tili項(xiàng)后的顯示如圖：在設(shè)計(jì)時(shí)，可依據(jù)圖上三種指標(biāo)的信息選取序列，如果覺(jué)得合適，可點(diǎn)擊Tm圖塊上左下角的Upper按鈕， 選好上游引物，此時(shí)該按鈕變成，表示上游引物已選取好。下游引物的選取步驟基本同上，只是按鈕變成 Lower。?G值反映了序列與模板的結(jié)合強(qiáng)度，最好引物的?G值在5端和中間值比較高，而在3端相對(duì) 低（如圖：）Tm值曲線以選取72C附近為佳，5到3的下降形狀也有利于引物引發(fā)聚合反應(yīng)Frq曲線為“Oligo6” 新引進(jìn)的

15、一個(gè)指標(biāo)，揭示了序列片段存在的重復(fù)機(jī)率大小。選取引物時(shí)，宜選用3端Frq值相對(duì)較低的 片段。當(dāng)上下游引物全選好以后，需要對(duì)引物進(jìn)行評(píng)價(jià)并根據(jù)評(píng)價(jià)對(duì)引物進(jìn)行修改。首先檢查引物二聚體尤其是 3端二聚體形成的可能性。需要注意的是，引物二聚體有可能是上游或下游引物自身形成，也有可能是在 上下游引物之間形成（cross dimer）。二聚體形成的能值越高，越不符合要求。一般的檢測(cè)（非克?。┬?PCR，對(duì)引物位置、產(chǎn)物大小要求較低，因而應(yīng)盡可能選取不形成二聚體或其能值較低的引物。第二項(xiàng)檢查 是發(fā)夾結(jié)構(gòu)（hairpin）；與二聚體相同，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值越低越好。一般來(lái)說(shuō)，這兩項(xiàng)結(jié)構(gòu)的能值以不超 過(guò)4.5為好。

16、當(dāng)然，在設(shè)計(jì)克隆目的的PCR引物時(shí)，引物兩端一般都添加酶切位點(diǎn)，必然存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)，而且能值不會(huì) 太低。這種PCR需要通過(guò)靈活調(diào)控退火溫度以達(dá)到最好效果，對(duì)引物的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的檢測(cè)就不應(yīng)要求太高。 第三項(xiàng)檢查為GC含量，以45-55%為宜。有一些模板本身的GC含量偏低或偏高，導(dǎo)致引物的GC含量不 能被控制在上述范圍內(nèi)，這時(shí)應(yīng)盡量使上下游引物的GC含量以及Tm值保持接近，以有利于退火溫度的選 擇。如果PCR的模板不是基因組DNA，而是一個(gè)特定模板序列，那么最好還進(jìn)行False priming site的 檢測(cè)。這項(xiàng)檢查 可以看出引物在非目的位點(diǎn)引發(fā)PCR反應(yīng)的可能性。如果引物在錯(cuò)配位點(diǎn)的引發(fā)效率比較高

17、，就可能出假 陽(yáng)性的PCR結(jié)果。一般在錯(cuò)配引發(fā)效率以不超過(guò)100為好，但對(duì)于特定的模板序列，還應(yīng)結(jié)合比較其在正 確位點(diǎn)的引發(fā)效率。如果兩者相差很大，比如在正確位點(diǎn)的引發(fā)效率為450以上，而在錯(cuò)誤位點(diǎn)的引發(fā)效 率為130，那么這對(duì)引物也是可以接受的。當(dāng)我們結(jié)束以上四項(xiàng)檢測(cè)，按Alt+P鍵彈出PCR窗口，其中總 結(jié)性地顯示該引物的位置、產(chǎn)物大小、Tm值等參數(shù)，最有用的是還給出了推薦的最佳退火溫度和簡(jiǎn)單的評(píng) 價(jià)。由于“Oligo”軟件的引物自動(dòng)搜索功能與“Primer Premier 5”的相類似，并且似乎并不比后者更好用， 在此不再贅述。其實(shí)，使用軟件自動(dòng)搜索引物就是讓計(jì)算機(jī)按照人的要求去尋找最佳

18、引物，如果參數(shù)設(shè)置 得當(dāng)將大大提高工作效率。除了本地引物設(shè)計(jì)軟件之外，現(xiàn)在還有一些網(wǎng)上引物設(shè)計(jì)軟件，如由Whitehead Institute開(kāi)發(fā)的“Primer 3”等（本網(wǎng)站 HYPERLINK 0/%e5%b7%b2%e5%bc%95%e8%bf%9b%e5%b9%b6%e8%b0%83%e8%af%95%e5%a5%bd%e8%af%a5%e8%bd%af%e4%bb%b6%ef%bc%8c%e6%ac%a2%e8%bf%8e%e4%bd%bf%e7%94%a8%ef%bc%89%e3%80%82%e8%af%a5%e8%bd%af%e4%bb%b6%e7%9a%84%e7%8b%ac

19、%e7%89%b9%e4%b9%8b%e5%a4%84%e5%9c%a8%e4%ba%8e%ef%bc%8c%e5%af%b9 0/已引進(jìn)并調(diào)試好該軟件，歡迎使用）。該軟件的獨(dú)特之處在于，對(duì) 全基因組PCR的引物設(shè)計(jì)；可以將設(shè)計(jì)好的引物對(duì)后臺(tái)核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)并排除可引發(fā)錯(cuò)配的引 物。因此建議經(jīng)常做全基因組PCR的用戶試用。PCR引物設(shè)計(jì)的目的是為了找到一對(duì)合適的核苷酸片段，使其能有效地?cái)U(kuò)增模板DNA序列。因此，引 物的優(yōu)劣直接關(guān)系到PCR的特異性與成功與否。要設(shè)計(jì)引物首先要找到DNA序列的保守區(qū)。同時(shí)應(yīng)預(yù)測(cè)將要擴(kuò)增的片段單鏈?zhǔn)欠裥纬啥?jí)結(jié)構(gòu)。如這個(gè)區(qū) 域單鏈能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，就要避開(kāi)它。

20、如這一段不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，那就可以在這一區(qū)域設(shè)計(jì)引物?，F(xiàn)在可以在這一保守區(qū)域里設(shè)計(jì)一對(duì)引物。一般引物長(zhǎng)度為1530堿基，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為100600堿基對(duì)。 讓我們先看看P1引物。一般引物序列中G+C含量一般為40%60%。而且四種堿基的分布最好隨機(jī)。不要有 聚嘌吟或聚嘧啶存在。否則P1引物設(shè)計(jì)的就不合理。應(yīng)重新尋找區(qū)域設(shè)計(jì)引物。同時(shí)引物之間也不能有互補(bǔ)性，一般一對(duì)引物間不應(yīng)多于4個(gè)連續(xù)堿基的互補(bǔ)。引物確定以后，可以對(duì)引物進(jìn)行必要的修飾，例如可以在引物的5端加酶切位點(diǎn)序列；標(biāo)記生物素、 熒光素、地高辛等，這對(duì)擴(kuò)增的特異性影響不大。但3端絕對(duì)不能進(jìn)行任何修飾，因?yàn)橐锏难由焓菑? 端開(kāi)始的。這里還

21、需提醒的是3端不要終止于密碼子的第3位，因?yàn)槊艽a子第3位易發(fā)生簡(jiǎn)并，會(huì)影響 擴(kuò)增的特異性與效率。綜上所述我們可以歸納十條PCR引物的設(shè)計(jì)原則:引物應(yīng)用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)并具有特異性。產(chǎn)物不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。引物長(zhǎng)度一般在1530堿基之間。G+C含量在40%60%之間。堿基要隨機(jī)分布。引物自身不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。引物之間不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。引物5端可以修飾。引物3端不可修飾。引物3端要避開(kāi)密碼子的第3位。PCR引物設(shè)計(jì)的目的是找到一對(duì)合適的核苷酸片段，使其能有效地?cái)U(kuò)增模板DNA序列。如前述，引物的 優(yōu)劣直接關(guān)系到PCR的特異性與成功與否。對(duì)引物的設(shè)計(jì)不可能有一種包羅萬(wàn)象的規(guī)則確保PC

22、R的成功， 但遵循某些原則，則有助于引物的設(shè)計(jì)。引物的特異性引物與非特異擴(kuò)增序列的同源性不要超過(guò)70%或有連續(xù)8個(gè)互補(bǔ)堿基同源。避開(kāi)產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)某些引物無(wú)效的主要原因是引物重復(fù)區(qū)DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，選擇擴(kuò)增片段時(shí)最好避開(kāi)二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域。用 有關(guān)計(jì)算機(jī)軟件可以預(yù)測(cè)估計(jì)mRNA的穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)，有助于選擇模板。實(shí)驗(yàn)表明，待擴(kuò)區(qū)域自由能(AG) 小于58.6lkJ/mol時(shí)，擴(kuò)增往往不能成功。若不能避開(kāi)這一區(qū)域時(shí)，用7-deaza-2 -脫氧GTP取代dGTP 對(duì)擴(kuò)增的成功是有幫助的。寡核苷酸引物長(zhǎng)度為1530bp, 一般為2027mer。引物的有效長(zhǎng)度：Ln=2 (G+C) + (A+T+, Ln值不能大于 38,因?yàn)?8時(shí)，最適延伸溫度會(huì)超過(guò)Taq DNA聚合酶的最適溫度(74C),不能保證產(chǎn)物的特異性。G+C含量G+C含量一般為40%60%。其Tm值是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈 的溫度，有效啟動(dòng)溫度，一般高于Tm值510C。若按公式Tm=4 (G+C) +2 (A+T)估計(jì)引物的Tm值，則有 效引物的Tm為5580C，其Tm值最好接近72C以使復(fù)性條件最佳。堿基礎(chǔ)隨機(jī)分布引物中四種堿基的