分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)理論及操作答案(共18頁(yè))

1、實(shí)驗(yàn)(shyn)答案基本原理題限制性內(nèi)切酶有那些(nxi)特點(diǎn)？ = 1 * GB3 * MERGEFORMAT 能識(shí)別雙鏈分子(fnz)的某種特定 HYPERLINK /search?word=核苷酸序列&fr=qb_search_exp&ie=utf8 核苷酸序列 = 2 * GB3 * MERGEFORMAT 使每條DNA鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的 HYPERLINK /search?word=磷酸二酯鍵&fr=qb_search_exp&ie=utf8 磷酸二酯鍵斷開2、限制性內(nèi)切酶有那些類型，我們DNA重組時(shí)常用的是哪類？答：限制性內(nèi)切酶主要分成三大類。第一類限制性內(nèi)切酶能識(shí)別專

2、一的核苷酸順序，并在識(shí)別點(diǎn)附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的雙鏈，但是切割的核苷酸順序沒有專一性，是隨機(jī)的。這類限制性內(nèi)切酶在DNA重組技術(shù)或基因工程中沒有多大用處，無(wú)法用于分析DNA結(jié)構(gòu)或克隆基因。這類酶如EcoB、EcoK等。第二類限制性內(nèi)切酶能識(shí)別專一的核苷酸順序，并在該順序內(nèi)的固定位置上切割雙鏈。由于這類限制性內(nèi)切酶的識(shí)別和切割的核苷酸都是專一的。所以總能得到同樣核苷酸順序的DNA片段，并能構(gòu)建來(lái)自不同基因組的DNA片段，形成雜合DNA分子。因此，這種限制性內(nèi)切酶是DNA重組技術(shù)中最常用的工具酶之一。這種酶識(shí)別的專一核苷酸順序最常見的是4個(gè)或6個(gè)核苷酸，少數(shù)也有識(shí)別5個(gè)核苷酸以及7個(gè)

3、、9個(gè)、10個(gè)和11個(gè)核苷酸的。第二類限制性內(nèi)切酶的識(shí)別順序是一個(gè)回文對(duì)稱順序，即有一個(gè)中心對(duì)稱軸，從這個(gè)軸朝二個(gè)方向“讀”都完全相同。這種酶的切割可以有兩種方式。一是交錯(cuò)切割，結(jié)果形成兩條單鏈末端，這種末端的核苷酸順序是互補(bǔ)的，可形成氫鍵，所以稱為粘性末端。另一種是在同一位置上切割雙鏈，產(chǎn)生平頭末端。第三類限制性內(nèi)切酶也有專一的識(shí)別順序，但不是對(duì)稱的回文順序。它在識(shí)別順序旁邊幾個(gè)核苷酸對(duì)的固定位置上切割雙鏈。但這幾個(gè)核苷酸對(duì)則是任意的。因此，這種限制性內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生的一定長(zhǎng)度DNA片段，具有各種單鏈末端。這對(duì)于克隆基因或克隆DNA片段沒有多大用處。何為細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)？是一種存在于細(xì)菌（

4、可能還有其他原核生物），可保護(hù)個(gè)體免于外來(lái)DNA（如噬菌體）侵入的系統(tǒng)，主要有限制內(nèi)切酶和甲基化酶組成的二元系統(tǒng)。細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)包含三個(gè)連鎖基因：（1）hsd R：編碼限制性核酸內(nèi)切酶（2）hsd M：編碼限制性甲基化酶（3）hsd S：編碼限制性酶和甲基化酶的協(xié)同表達(dá)大多數(shù)限制性內(nèi)切酶常常伴隨有12種修飾酶（DNA甲基化酶），后者能保護(hù)細(xì)胞自身的DNA不被限制性內(nèi)切酶破壞。修飾酶識(shí)別的位點(diǎn)與相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶相同，它們的作用是甲基化每條鏈中的一個(gè)堿基，而不是切開DNA鏈。甲基化所形成的甲基基團(tuán)能伸入到限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的雙螺旋大溝中，阻礙限制性內(nèi)切酶發(fā)揮作用。這樣，限制性內(nèi)切酶和它的“

5、搭檔”修飾酶一起組成R-M系統(tǒng)。在某些R-M系統(tǒng)中，限制性內(nèi)切酶和修飾酶是兩種不同的蛋白，它們各自獨(dú)立行使自己的功能；另一些R-M系統(tǒng)本身就是一種大的限制-修飾復(fù)合酶，由不同亞基或同一種亞基的不同結(jié)構(gòu)域來(lái)分別執(zhí)行限制或修飾的功能。說(shuō)說(shuō)熱激轉(zhuǎn)化(zhunhu)法和電擊轉(zhuǎn)化法的區(qū)別。 HYPERLINK /search?word=電擊(din j)法&fr=qb_search_exp&ie=utf8 電擊(din j)法：使用瞬時(shí) HYPERLINK /search?word=高壓電&fr=qb_search_exp&ie=utf8 高壓電（數(shù)千伏特）處理細(xì)胞懸液， HYPERLINK /sear

6、ch?word=微生物&fr=qb_search_exp&ie=utf8 微生物 HYPERLINK /search?word=細(xì)胞膜&fr=qb_search_exp&ie=utf8 細(xì)胞膜在 HYPERLINK /search?word=高壓電&fr=qb_search_exp&ie=utf8 高壓電的作用下發(fā)生 HYPERLINK /search?word=去極化&fr=qb_search_exp&ie=utf8 去極化，產(chǎn)生 HYPERLINK /search?word=微孔&fr=qb_search_exp&ie=utf8 微孔，懸液中溶解的 HYPERLINK /search?wo

7、rd=核酸&fr=qb_search_exp&ie=utf8 核酸即可通過(guò) HYPERLINK /search?word=細(xì)胞膜&fr=qb_search_exp&ie=utf8 細(xì)胞膜上的孔洞進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部?；瘜W(xué)法：使用 HYPERLINK /search?word=低滲溶液&fr=qb_search_exp&ie=utf8 低滲溶液處理細(xì)胞懸液（0.1M CaCl2）， HYPERLINK /search?word=微生物&fr=qb_search_exp&ie=utf8 微生物 HYPERLINK /search?word=細(xì)胞膜&fr=qb_search_exp&ie=utf8 細(xì)胞膜結(jié)

8、構(gòu)會(huì)發(fā)生一些變化，使得細(xì)胞在熱激時(shí)（42度90秒）變得很容易從溶液中攝取DNA。具體機(jī)理目前仍然不是十分清楚，但是很有效。做電擊轉(zhuǎn)化時(shí)，懸液中有近70%的細(xì)胞會(huì)因電擊而死亡，但是這種方法很直接，轉(zhuǎn)化效率很高。當(dāng)需要高的轉(zhuǎn)化效率時(shí)，比如制作 HYPERLINK /search?word=基因文庫(kù)&fr=qb_search_exp&ie=utf8 基因文庫(kù)，可以采用電擊轉(zhuǎn)化，另外，做酵母等真核 HYPERLINK /search?word=生物轉(zhuǎn)化&fr=qb_search_exp&ie=utf8 生物轉(zhuǎn)化時(shí)一般都是電擊。化學(xué) HYPERLINK /search?word=轉(zhuǎn)化法&fr=qb_se

9、arch_exp&ie=utf8 轉(zhuǎn)化法操作簡(jiǎn)單，不需要特殊設(shè)備，轉(zhuǎn)化效率足以滿足一般克隆實(shí)驗(yàn)的需要，故使用范圍非常廣。堿裂解法提取質(zhì)粒的基本原理是什么？在堿性條件下，染色體DNA和質(zhì)粒DNA的氫鍵斷裂，致使宿主染色體DNA變性，但閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA由于拓?fù)淅p繞而不能彼此分開。當(dāng)以pH 4.0的NaAc高鹽緩沖液調(diào)節(jié)其pH至中性時(shí)，質(zhì)粒DNA迅速恢復(fù)原有的構(gòu)型，重新形成超螺旋分子，保存在溶液中，而染色體DNA不能復(fù)性，形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。通過(guò)離心，染色體DNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來(lái)而被除去。 CsCl密度梯度離心的原理是什么？將質(zhì)量差異微小的分子分開。用 HYPERLINK /

10、search?word=氯化銫&fr=qb_search_exp&ie=utf8 氯化銫濃鹽液，以105g以上的強(qiáng)大 HYPERLINK /search?word=離心力&fr=qb_search_exp&ie=utf8 離心力的作用，鹽的分子被甩到 HYPERLINK /search?word=離心管&fr=qb_search_exp&ie=utf8 離心管的底部。同時(shí)， HYPERLINK /search?word=擴(kuò)散作用&fr=qb_search_exp&ie=utf8 擴(kuò)散作用使溶液中Cs和Cl離子呈分散狀態(tài)，與 HYPERLINK /search?word=離心力&fr=qb_se

11、arch_exp&ie=utf8 離心力的方向相反，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的離心，溶液達(dá)到一種 HYPERLINK /search?word=平衡狀態(tài)&fr=qb_search_exp&ie=utf8 平衡狀態(tài)。反向擴(kuò)散力與 HYPERLINK /search?word=沉降力&fr=qb_search_exp&ie=utf8 沉降力之間的平衡作用，產(chǎn)生了一個(gè)連續(xù)的CsCl HYPERLINK /search?word=濃度梯度&fr=qb_search_exp&ie=utf8 濃度梯度。 HYPERLINK /search?word=離心管&fr=qb_search_exp&ie=utf8 離心管底部溶

12、液的密度最大，上部最小。 HYPERLINK /search?word=DNA分子&fr=qb_search_exp&ie=utf8 DNA分子溶于CsCl溶液中，經(jīng)過(guò)離心，將逐漸集中在一條狹窄的帶上。帶上的 HYPERLINK /search?word=DNA分子&fr=qb_search_exp&ie=utf8 DNA分子密度與該處CsCl相等。7、質(zhì)粒載體具備的基本要素是什么？是染色質(zhì)外的雙鏈共價(jià)閉合環(huán)形DNA、能自主復(fù)制，是能獨(dú)立復(fù)制的復(fù)制子、質(zhì)粒對(duì)宿主生存并不是必需的。必須包括三部分：遺傳標(biāo)記基因，復(fù)制區(qū)，目的基因。質(zhì)粒圖譜上的MCS指的是什么？MCS多克隆位點(diǎn)（multiple c

13、loning site）:是包含多個(gè)（最多20個(gè)）限制性酶切位點(diǎn)（restriction site）的一段很短的DNA序列。也稱為多位點(diǎn)接頭（polylinker），是基因工程中常用到的載體質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)配置序列.MCS中，每個(gè)限制性酶切位點(diǎn)通常是唯一的，即它們?cè)谝粋€(gè)特定的載體質(zhì)粒中只出現(xiàn)一次。按拷貝數(shù)，質(zhì)粒有哪些基本類型？我們使用的pUC19和pBS屬于哪種類型？高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體ColE1、pMB1派生質(zhì)粒具有高拷貝數(shù)的特點(diǎn)。適合(shh)大量增殖克隆基因，或需要大量表達(dá)的 HYPERLINK /view/667324.htm 基因(jyn)產(chǎn)物。低拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體(zit)由 pSC101派

14、生來(lái)的載體特點(diǎn)是分子量小的拷貝數(shù)。它有特殊的用途：當(dāng)有些被克隆的基因的表達(dá)產(chǎn)物過(guò)多時(shí)會(huì)嚴(yán)重影響寄主菌的正常代謝活動(dòng)，導(dǎo)致寄主菌的死亡時(shí)，就需要低拷貝的載體。pUC19載體,高達(dá)500700個(gè)以高效克隆的pBS-T為載體,其目的基因拷貝數(shù)可等同pUC19載體,高達(dá)500700個(gè)氯霉素提高質(zhì)?？截悢?shù)的原理是什么？氯霉素是一種蛋白質(zhì)合成 HYPERLINK /search?word=抑制劑&fr=qb_search_exp&ie=utf8 抑制劑，能夠抑制染色體的復(fù)制，而不影響 HYPERLINK /search?word=質(zhì)粒&fr=qb_search_exp&ie=utf8 質(zhì)粒pBR322的復(fù)

15、制。這樣經(jīng)過(guò)氯霉素處理使得細(xì)胞內(nèi)pBR322得到高拷貝。藍(lán)白斑篩選的基本原理是什么？ HYPERLINK /view/161221.htm 藍(lán)白斑篩選是重組子篩選的一種方法： 是根據(jù)載體的遺傳特征篩選重組子，如-互補(bǔ)、抗生素基因等?，F(xiàn)在使用的許多載體都帶有一個(gè)大腸桿菌的DNA的短區(qū)段，其中有 HYPERLINK /view/707931.htm -半乳糖苷酶 HYPERLINK /view/8563.htm 基因（lacZ）的 HYPERLINK /view/207329.htm 調(diào)控序列和前146個(gè) HYPERLINK /view/15155.htm 氨基酸的編碼信息。在這個(gè) HYPERLI

16、NK /view/696366.htm 編碼區(qū)中插入了一個(gè) HYPERLINK /view/623572.htm 多克隆位點(diǎn)（MCS），它并不破壞讀框，但可使少數(shù)幾個(gè) HYPERLINK /view/15155.htm 氨基酸插入到-半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能，這種載體適用于可編碼-半乳糖苷酶C端部分序列的 HYPERLINK /view/1495623.htm 宿主細(xì)胞。因此，宿主和質(zhì)粒編碼的片段雖都沒有酶活性，但它們同時(shí)存在時(shí)，可形成具有酶學(xué)活性的蛋白質(zhì)。這樣，lacZ HYPERLINK /view/8563.htm 基因在缺少近 HYPERLINK /view/299657.htm

17、 操縱基因區(qū)段的宿主細(xì)胞與帶有完整近操縱基因區(qū)段的質(zhì)粒之間實(shí)現(xiàn)了互補(bǔ)，稱為 HYPERLINK /view/573173.htm -互補(bǔ)。由 HYPERLINK /view/573173.htm -互補(bǔ)而產(chǎn)生的LacZ+細(xì)菌在誘導(dǎo)劑IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在時(shí)產(chǎn)生藍(lán)色 HYPERLINK /view/7118.htm 菌落，因而易于識(shí)別。然而，當(dāng)外源DNA插入到質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)后，幾乎不可避免地導(dǎo)致無(wú) HYPERLINK /view/573173.htm -互補(bǔ)能力的氨基端片段，使得帶有 HYPERLINK /view/212405.htm 重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色 HYPERL

18、INK /view/7118.htm 菌落。這種重組子的篩選，又稱為藍(lán)白斑篩選。如用藍(lán)白斑篩選則經(jīng)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的鈣化菌平板37溫箱倒置培養(yǎng)12-16hr后，有 HYPERLINK /view/212405.htm 重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落。作為受體的大腸桿菌應(yīng)該具有什么特性？ HYPERLINK /search?word=遺傳背景&fr=qb_search_exp&ie=utf8 遺傳背景清楚 ;目標(biāo) HYPERLINK /search?word=基因表達(dá)&fr=qb_search_exp&ie=utf8 基因表達(dá)水平高;表達(dá)系統(tǒng)成熟完善;易于培養(yǎng)（培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)快、培養(yǎng)周期短、抗污染能

19、力強(qiáng)）、成本低;被美國(guó)FDA批準(zhǔn)為安全的 HYPERLINK /search?word=基因工程&fr=qb_search_exp&ie=utf8 基因工程受體生物。缺點(diǎn)：表達(dá)產(chǎn)物缺少飯以后的修飾（如 HYPERLINK /search?word=糖基化&fr=qb_search_exp&ie=utf8 糖基化、 HYPERLINK /search?word=烷基化&fr=qb_search_exp&ie=utf8 烷基化、 HYPERLINK /search?word=磷酸化&fr=qb_search_exp&ie=utf8 磷酸化、特異性的蛋白水解加工等）；同時(shí)高表達(dá)時(shí)易折疊錯(cuò)誤導(dǎo)致表達(dá)產(chǎn)

20、物沒有活性，而且 HYPERLINK /search?word=大腸桿菌&fr=qb_search_exp&ie=utf8 大腸桿菌本身含有 HYPERLINK /search?word=內(nèi)毒素&fr=qb_search_exp&ie=utf8 內(nèi)毒素和有毒蛋白，可能混在產(chǎn)物里，應(yīng)用受限。 HYPERLINK /search?word=真核基因&fr=qb_search_exp&ie=utf8 真核基因在 HYPERLINK /search?word=大腸桿菌&fr=qb_search_exp&ie=utf8 大腸桿菌中表達(dá)：1， HYPERLINK /search?word=真核生物&fr=

21、qb_search_exp&ie=utf8 真核生物的 HYPERLINK /search?word=啟動(dòng)子&fr=qb_search_exp&ie=utf8 啟動(dòng)子不能被 HYPERLINK /search?word=原核細(xì)胞&fr=qb_search_exp&ie=utf8 原核細(xì)胞（ HYPERLINK /search?word=大腸桿菌&fr=qb_search_exp&ie=utf8 大腸桿菌）的 HYPERLINK /search?word=RNA聚合酶&fr=qb_search_exp&ie=utf8 RNA聚合酶識(shí)別；2， HYPERLINK /search?word=真核生物

22、&fr=qb_search_exp&ie=utf8 真核生物的mRNA上沒有 HYPERLINK /search?word=SD序列&fr=qb_search_exp&ie=utf8 SD序列，因此不能被 HYPERLINK /search?word=原核細(xì)胞&fr=qb_search_exp&ie=utf8 原核細(xì)胞 HYPERLINK /search?word=核糖體&fr=qb_search_exp&ie=utf8 核糖體結(jié)合；3， HYPERLINK /search?word=真核生物&fr=qb_search_exp&ie=utf8 真核生物的基因含有 HYPERLINK /sear

23、ch?word=內(nèi)含子&fr=qb_search_exp&ie=utf8 內(nèi)含子， HYPERLINK /search?word=原核細(xì)胞&fr=qb_search_exp&ie=utf8 原核細(xì)胞缺乏見他們的 HYPERLINK /search?word=轉(zhuǎn)錄物&fr=qb_search_exp&ie=utf8 轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行拼接加工的機(jī)制；4， HYPERLINK /search?word=真核細(xì)胞&fr=qb_search_exp&ie=utf8 真核細(xì)胞的 HYPERLINK /search?word=基因產(chǎn)物&fr=qb_search_exp&ie=utf8 基因產(chǎn)物，往往需要 HYPE

24、RLINK /search?word=翻譯后加工&fr=qb_search_exp&ie=utf8 翻譯后加工， HYPERLINK /search?word=真核細(xì)胞&fr=qb_search_exp&ie=utf8 真核細(xì)胞缺乏 HYPERLINK /search?word=翻譯后加工&fr=qb_search_exp&ie=utf8 翻譯后加工有關(guān)的酶；5，真核生物 HYPERLINK /search?word=基因表達(dá)&fr=qb_search_exp&ie=utf8 基因表達(dá)的蛋白質(zhì)易被原核細(xì)胞 HYPERLINK /search?word=蛋白酶&fr=qb_search_exp&

25、ie=utf8 蛋白酶所降解。轉(zhuǎn)化(zhunhu)的概念，轉(zhuǎn)化有哪些方法？轉(zhuǎn)化(zhunhu)（transformation）是某一基因型的 HYPERLINK /view/3687.htm 細(xì)胞(xbo)從周圍介質(zhì)中吸收來(lái)自另一基因型的細(xì)胞的 HYPERLINK /view/758.htm DNA而使它的基因型和表現(xiàn)型發(fā)生相應(yīng)變化的現(xiàn)象。該現(xiàn)象首先發(fā)現(xiàn)于 HYPERLINK /view/19168.htm 細(xì)菌。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化方法主要有：高壓電穿孔法轉(zhuǎn)化大腸桿菌（電轉(zhuǎn)化法），氯化鈣法制備感受態(tài)細(xì)胞的大腸桿菌轉(zhuǎn)化法CaCl2制備感受態(tài)細(xì)胞的基本原理？目前，感受態(tài)細(xì)胞的制備常用冰預(yù)冷的CaCl2處理細(xì)

26、菌的方法制備，即用低滲CaCl2溶液在低溫（0）時(shí)處理快速生長(zhǎng)的細(xì)菌，從而獲得感受態(tài)細(xì)菌。此時(shí)細(xì)菌膨脹成球形，外源DNA分子在此條件下易形成抗DNA酶的羥基鈣磷酸復(fù)合物粘附在細(xì)菌表面，通過(guò)熱激作用促進(jìn)細(xì)胞對(duì)DNA的吸收。轉(zhuǎn)化效率可達(dá)106107轉(zhuǎn)化子/微克DNA。本方法的關(guān)鍵是選用的細(xì)菌必須處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，實(shí)驗(yàn)操作必須在低溫下進(jìn)行。熱激轉(zhuǎn)化法的基本原理是什么？其原理是細(xì)菌處于0，CaCl2的低滲溶液中，菌細(xì)胞膨脹成球形，轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNase（DNA酶）的羥基-鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)42短時(shí)間熱沖擊處理，促使細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物，在豐富培養(yǎng)基上生長(zhǎng)數(shù)小時(shí)后，球狀細(xì)胞復(fù)原并

27、分裂增值。被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌中，重組子中基因得到表達(dá)，在選擇性培養(yǎng)基平板上，可選出所需的轉(zhuǎn)化子。影響感受態(tài)細(xì)胞效率的因素有哪些？1細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)：實(shí)驗(yàn)中應(yīng)密切注視細(xì)菌的生長(zhǎng)狀態(tài)和密度，盡量使用 HYPERLINK /search?word=對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期&fr=qb_search_exp&ie=utf8 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞（一般通過(guò)檢測(cè) HYPERLINK /search?word=OD600&fr=qb_search_exp&ie=utf8 OD600來(lái)控制。DH5菌株 HYPERLINK /search?word=OD600&fr=qb_search_exp&ie=utf8 OD600為 0.5 時(shí)細(xì)

28、胞密度是 5 107/ml ）；2所有操作均應(yīng)在無(wú)菌條件和冰上進(jìn)行；3經(jīng) CaCl2處理的細(xì)胞，在低溫條件下，一定的時(shí)間內(nèi) HYPERLINK /search?word=轉(zhuǎn)化率&fr=qb_search_exp&ie=utf8 轉(zhuǎn)化率隨時(shí)間的推移而增加， 24小時(shí)達(dá)到最高，之后 HYPERLINK /search?word=轉(zhuǎn)化率&fr=qb_search_exp&ie=utf8 轉(zhuǎn)化率再下降（這是由于總的活菌數(shù)隨時(shí)間延長(zhǎng)而減少造成的）；4化合物及 HYPERLINK /search?word=無(wú)機(jī)離子&fr=qb_search_exp&ie=utf8 無(wú)機(jī)離子的影響：在 Ca2+的基礎(chǔ)上聯(lián)合

29、其他二價(jià) HYPERLINK /search?word=金屬離子&fr=qb_search_exp&ie=utf8 金屬離子（如 Mn2+或 Co2+）、 DMSO 或 HYPERLINK /search?word=還原劑&fr=qb_search_exp&ie=utf8 還原劑等物質(zhì)處理細(xì)菌，可使轉(zhuǎn)化效率大大提高（ 100-1000 倍）；5所使用的器皿必須干凈。跡量的 HYPERLINK /search?word=去污劑&fr=qb_search_exp&ie=utf8 去污劑或其它 HYPERLINK /search?word=化學(xué)物質(zhì)&fr=qb_search_exp&ie=utf8

30、化學(xué)物質(zhì)的存在可能大大降低細(xì)菌的轉(zhuǎn)化效率；6 HYPERLINK /search?word=質(zhì)粒&fr=qb_search_exp&ie=utf8 質(zhì)粒的大小及構(gòu)型的影響：用于轉(zhuǎn)化的應(yīng)主要是 HYPERLINK /search?word=超螺旋&fr=qb_search_exp&ie=utf8 超螺旋的 DNA ；7一定范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)化效率與外源 DNA 的濃度呈正比；利用分光光度計(jì)測(cè)定(cdng)DNA濃度的基本原理是什么？1OD值相當(dāng)于多大濃度的雙鏈DNA？單鏈DNA？單鏈RNA？DNA或RNA鏈上堿基的苯環(huán)結(jié)構(gòu)在紫光區(qū)具有較強(qiáng)吸 收，其吸收峰在260nm處。波長(zhǎng)為260nm時(shí)，DNA或RNA

31、的光密度OD260不僅與總含量有關(guān)(yugun)，也隨構(gòu)型而有差異。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品來(lái)說(shuō)，濃度為1g / ml時(shí)，DNA鈉鹽的OD2600.02當(dāng)OD2601時(shí)， dsDNA濃度(nngd)約為50g / ml ssDNA濃度約為37g / ml RNA濃度約為40g / ml寡核苷酸濃度約為30g / ml（youyu底物不同有差異）當(dāng)DNA樣品中含有蛋白質(zhì)、酚或其他小分子污染物時(shí)，會(huì)影響DNA吸光度的準(zhǔn)確測(cè)定。一般情況下同時(shí)檢測(cè)同一樣品的OD260、OD280和OD230，計(jì)算其比值來(lái)衡量樣品的純度。 經(jīng)驗(yàn)值：純DNA：OD260/OD2801.8(1.9,表明有RNA污染；1。6，表明有蛋白質(zhì)

32、、酚等污染）純RNA：1.7 OD260/OD2802.0（1.7時(shí)表明有蛋白質(zhì)或酚污染；2.0時(shí)表明可能有異硫氰酸殘存）若樣品不純，則比值發(fā)生變化，此時(shí)無(wú)法用分光光度法對(duì)核酸進(jìn)行定量核酸的定性測(cè)定中，OD268/OD280比值大小說(shuō)明什么問(wèn)題？符合要求純度高的純化DNA其OD260/OD280在1.6-1.8之間，低于此范圍表明蛋白質(zhì)含量超標(biāo)，高于此范圍表明樣品中含有RNA。要糾正一下，純DNA的A260/A280應(yīng)大于1.8，純的RNA應(yīng)達(dá)到2.0，樣品中如果含有蛋白質(zhì)及苯酚，A260/A280比值會(huì)明顯下降。對(duì)于純的樣品，只要讀出260nm的A值即可以算出含量。通常以A值為1相當(dāng)于50微

33、克/ml雙螺旋DNA，或者40微克/ml單鏈DNA（RNA），或者20微克/ml寡核苷酸計(jì)算。OD260OD280 1.9-2.0 RNA居多 純度已經(jīng)很高了純DNA：OD260/OD2801.8(1.9,表明有RNA污染；1.6，表明有蛋白質(zhì)、酚等污染）純RNA：1.7 OD260/OD2802.0（1.7時(shí)表明有蛋白質(zhì)或酚污染；2.0時(shí)表明可能有異硫氰酸殘存）OD是optical density（光密度）的縮寫， OD1og（1trans），其中trans為檢測(cè)物的透光值。 吸光度 吸光度,absorbance,是指光線通過(guò)溶液或某一物質(zhì)前的入射光強(qiáng)度 與該光線通過(guò)溶液或物質(zhì)后的透射光強(qiáng)度

34、比值的對(duì)數(shù)，影響它的因素有溶劑、濃度、溫度等等 吸光系數(shù)與入射光的波長(zhǎng)以及被光通過(guò)的物質(zhì)有關(guān)。只要光的波長(zhǎng)被固定下來(lái)，同一種物質(zhì)，吸光系數(shù)就不變。 當(dāng)一束光通過(guò)一個(gè)吸光物質(zhì)（通常為溶液）時(shí)，溶質(zhì)吸收了光能，光的強(qiáng)度減弱。吸光度就是用來(lái)衡量光被吸收程度的一個(gè)物理量。吸光度用A表示， Aabc，其中a為吸光系數(shù)，單位L/(gcm),b為液層厚度（通常為比色皿的厚度），單位cm ，c為溶液濃度，單位g/L 影響吸光度的因數(shù)是b和c。a是與溶質(zhì)有關(guān)的一個(gè)常量，溫度通過(guò)影響c，而影響A。一般來(lái)說(shuō)OD260代表核酸的吸光度,OD280代表蛋白質(zhì)的吸光度,OD230代表其他雜質(zhì)(多糖等)的吸光度。 A260

35、/A280與OD260/OD280的意思是一樣的。A代表吸光值，而OD是光密度值，一個(gè)意思。A260/280比值一度成為判斷核酸純度的唯一通用標(biāo)準(zhǔn)，純的DNA一般在1.8-2.0之間；后來(lái)發(fā)現(xiàn)在抽提過(guò)程中使用的許多試劑影響 A260 和 A280 讀數(shù)；同時(shí)，對(duì)同一樣品 10 倍數(shù)量級(jí)稀釋后測(cè)定吸光值發(fā)現(xiàn)，分光光度計(jì)的吸光值僅在一定的區(qū)域是線性的。結(jié)論是：當(dāng) A260 讀數(shù)處在 0.1-0.5 之間，A200 到 A320 之間的數(shù)值構(gòu)成一條光滑的曲線時(shí)，少量苯酚 (30 ul/ml) 殘留使 A230，A260，A280 均變大 (差不多增加一倍)，但 A260/A280 和 A260/A2

36、30 均在 2 左右。少量異硫氰酸胍 (132 uM) 殘留使 A230 變大，但 A260，A280 幾乎不變，所以 A260/A280 仍在 2 左右，而 A260/A230 大大低于 2。大量異硫氰酸胍 (2.4 M) 殘留使 A230，A260，A280 均變大，根本就沒有辦法測(cè)定了。PEG (6.25%) 殘留使 A230，A260，A280 均變大，但對(duì) A230，A260 影響更大，所以 A260/A280 比 2 大不少，而 A260/A230 仍在 2 左右。核酸抽提中常用的試劑，如 Phenol，Guanidine Isothiocyanate，PEG 都能使 A260 和

37、A280 的值變大，但是卻可能使二者的比值與高純度核酸的比值一致。因?yàn)?A260 值幾乎是峰值，所以有必要在其兩邊各取一個(gè)：A280 和 A230。干凈的核酸 A260/A230 應(yīng)該在 2 左右。如果有在230nm處的強(qiáng)吸收提示污染有酚鹽離子等有機(jī)化合物1.蛋白質(zhì)污染：確保不要吸入中間層及有機(jī)相。減少起始樣品量，確保裂解完全、徹底。加入氯仿后首先要充分混勻，并且離心分層的離心力和時(shí)間要足夠。如果所得RNA的OD260/OD280比值偏低，則用氯仿重新抽提一次，再沉淀，溶解。2.苯酚殘留：確保不要吸入中間層及有機(jī)相。加入氯仿后首先要充分混勻，并且離心分層的離心力和時(shí)間要足夠。3.多糖或多酚的殘

38、留：一些特殊的組織和植物中，多糖、多酚含量較多，這些殘留也會(huì)導(dǎo)致OD260/OD280比值偏低。因此，從這類材料中提取RNA時(shí)，需要注意多糖、多酚雜質(zhì)的去除。4.設(shè)備限制：測(cè)定OD260及OD280數(shù)值時(shí)，要使OD260讀數(shù)在0.1-0.5之間。此范圍線性最好。用水稀釋樣品：測(cè)OD值時(shí)，對(duì)照及樣品稀釋液請(qǐng)使用10mM Tris，pH7.5。用水作為稀釋液將導(dǎo)致比值偏低。比值低可能有蛋白污染，高了可能有DNA污染，建議你抽提的RNA分三管，兩管保存，另一管用來(lái)跑膠和測(cè)定OD，跑膠是最直觀的，1%的膠就可以，抽提后馬上跑，一般不會(huì)降解很多，所以設(shè)備材料不需要去酶處理不會(huì)有影響的。你的od比低可能是

39、溶解時(shí)用的水的PH值偏酸?？梢栽囍{(diào)到8.0左右再測(cè)，這樣就會(huì)上來(lái)了。普通瓊脂糖凝膠電泳分離DNA的范圍(fnwi)是多少？普通(ptng)瓊脂糖凝膠分離DNA的范圍為0.2-20kb。聚丙烯酰胺凝膠分離DNA的范圍(fnwi)是多少？丙烯酰胺(%)有效分離范圍(bp)溴酚蘭*二甲苯青*3.510020001004605.080500652608.0604004516012.040200307015.025150156020.0101001245分離大片段DNA，比如50kb以上，一般采取(ciq)什么形式的電泳？介紹基本原理。大分子DNA(一般長(zhǎng)度超過(guò)(chogu)20kb，在某些情況下，超

40、過(guò)40kb)在電場(chǎng)作用下通過(guò)孔徑小于分子大小的凝膠時(shí)，將會(huì)改變無(wú)規(guī)卷曲的構(gòu)象，沿電場(chǎng)方向伸直，與電場(chǎng)平行從而才能通過(guò)凝膠。此時(shí)，大分子通過(guò)凝膠的方式相同，遷移率無(wú)差別(也稱“極限遷移率”)，不能分離。脈沖場(chǎng)凝膠電泳技術(shù)解決了這一難題，它應(yīng)用于分離純化大小在102000kb 之間的DNA 片段。這種電泳是在兩個(gè)不同方向的電場(chǎng)周期性交替進(jìn)行的，DNA分子在交替變換方向的電場(chǎng)中作出反應(yīng)所需的時(shí)間顯著地依賴于分子大小，DNA 越大，這種構(gòu)象改變需要的時(shí)間越長(zhǎng)，重新定向的時(shí)間也越長(zhǎng)，于是在每個(gè)脈沖時(shí)間內(nèi)可用于新方向泳動(dòng)的時(shí)間越少，因而在凝膠中移動(dòng)越慢。反之，較小的DNA 移動(dòng)較快，于是不同大小的分子被成

41、功分離。在許多實(shí)用的PFGE 方法中，倒轉(zhuǎn)電場(chǎng)凝膠電泳是最簡(jiǎn)單最常用的方法(FIGE)。通過(guò)把一個(gè)在不同電場(chǎng)方向有不同脈沖方式的脈沖電場(chǎng)加在樣品上，倒轉(zhuǎn)電場(chǎng)凝膠電泳(FIGE)設(shè)備能把大小范圍在102000kb 的DNA 片段分開。FIGE也可通過(guò)重新確定一個(gè)對(duì)準(zhǔn)完全固定好角度的電場(chǎng)，這樣會(huì)進(jìn)一步擴(kuò)展其分離極限達(dá)到10Mb。檢測(cè)DNA時(shí)，有哪些些形式的染色方式？原理是什么，各有何特點(diǎn)。聚丙烯酰胺凝膠-銀染、瓊脂糖電泳-SYBR Green = 1 * ROMAN * MERGEFORMAT I染色及EB染色方法銀染的原理：一、銀離子（一般是AgNO3)和DNA結(jié)合;二、還原劑甲醛把Ag+還原成

42、銀顆粒，最終DNA呈現(xiàn)為黑褐色。SYBR Green I是一種結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長(zhǎng)的染料。在游離狀態(tài)下，SYBR Green I發(fā)出微弱的熒光，但一旦與雙鏈DNA結(jié)合后，熒光大大增強(qiáng)。因此，SYBR Green I的熒光信號(hào)強(qiáng)度與雙鏈DNA的數(shù)量相關(guān)，可以根據(jù)熒光信號(hào)檢測(cè)出PCR體系存在的雙鏈DNA數(shù)量。SYBR Green I 的最大吸收波長(zhǎng)約為497nm，發(fā)射波長(zhǎng)最大約為520nm。這種扁平分子可以嵌入核酸雙鏈的配對(duì)的堿基之間，在紫外線激發(fā)下，未與核酸結(jié)合的溴化乙錠可被激發(fā)出橙紅色螢光。在與DNA或雙股RNA結(jié)合時(shí)，螢光強(qiáng)度會(huì)增強(qiáng)(zngqing)20倍，使

43、得核酸電泳后的膠片可以辨識(shí)核酸的相對(duì)位置。在核酸分子中，EB分子插入到兩層堿基對(duì)之間，發(fā)出紅色熒光。在凝膠中加入終濃度為0.5g/ml的EB，可以在電泳過(guò)程(guchng)中隨時(shí)觀察核酸的遷移情況，這種方法使用于一般性的核酸檢測(cè)。PCR的基本原理是什么？包括(boku)哪三個(gè)基本步驟？PCR技術(shù)的基本原理 類似于DNA的 天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR是一種體外DNA 擴(kuò)增技術(shù)，是在模板DNA、 HYPERLINK /view/352480.htm 引物和4種脫氧核苷酸存在的條件下，依賴于 HYPERLINK /view/29676.htm DNA聚合酶的酶

44、促合反應(yīng)，將待擴(kuò)增的DNA片段與其兩側(cè)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈引物經(jīng)“高溫變性低溫退火引物延伸”三步反應(yīng)的多次循環(huán)，使DNA片段在數(shù)量上呈指數(shù)增加，從而在短時(shí)間內(nèi)獲得我們所需的大量的特定基因片段。模板DNA的變性模板DNA經(jīng)加 熱至93左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；模板DNA與引物的退火(復(fù)性)模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；引物的延伸DNA模板-引物結(jié)合 物在 HYPERLINK /view/212575.htm TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)

45、原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需 24分鐘，23小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。到達(dá)平臺(tái)期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物理論上的計(jì)算公式是什么？PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué) PCR的三個(gè)反應(yīng)步驟反復(fù)進(jìn)行，使DNA擴(kuò)增量呈指數(shù)上升。反應(yīng)最終的DNA 擴(kuò)增量可用Y=(1+X)n計(jì)算。Y代表DNA片段擴(kuò)增后的拷貝數(shù)，X表示平(Y)均每次的擴(kuò)增效率，n代表循環(huán)次數(shù)。平均擴(kuò)增效率的理論值為1

46、00%， 但在實(shí)際反應(yīng)中平均效率達(dá)不到理論值。何為PCR的平臺(tái)效應(yīng)，產(chǎn)生的因素包括哪些？反應(yīng)初期(chq)，靶序列DNA片段的增加呈指數(shù)形式，隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累，被擴(kuò)增的DNA片段不再呈指數(shù)增加，而進(jìn)入線性增長(zhǎng)期或靜止期，即出現(xiàn)“停滯(tngzh)效應(yīng)”，這種效應(yīng)稱平臺(tái)期數(shù)、PCR擴(kuò)增效率及DNA聚合酶PCR的種類和活性及非特異性產(chǎn)物的競(jìng)爭(zhēng)等因素。大多數(shù)情況下，平臺(tái)期的到來(lái)(doli)是不可避免的。PCR中引物設(shè)計(jì)應(yīng)該遵循哪些基本原則？一設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則1、引物長(zhǎng)度：15-30bp，常用為20bp左右。2、引物擴(kuò)增跨度：以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至10kb的片段。

47、3、引物堿基：GC含量以40-60%為宜，GC太少擴(kuò)增效果不佳，GC過(guò)多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。上下游引物的GC含量不能相差太大。附加序列(RTsite,Promotersequence)加到5端,在算Tm值時(shí)不算,但在檢測(cè)互補(bǔ)和二級(jí)結(jié)構(gòu)是要加上它們.引物對(duì)的Tm差異不超過(guò)5，設(shè)計(jì)時(shí)溫度和GC含量是個(gè)主要的參數(shù)，做復(fù)合擴(kuò)增時(shí)更要設(shè)計(jì)成相近的溫度，而且引物加個(gè)尾影響不大。但要切記BLAST，包括查閱文獻(xiàn)的引物.如果兩個(gè)引物Tm不同，將退火溫度設(shè)定為比最低的Tm低5,或者為了提高特異性，可以在根據(jù)較高Tm設(shè)計(jì)的退火溫度先進(jìn)行5個(gè)循環(huán)，然后在

48、根據(jù)較低Tm設(shè)計(jì)的退火溫度進(jìn)行剩余的循環(huán)。4、避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高，尤其是3端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯(cuò)配。引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值過(guò)高（超過(guò)4.5kcal/mol）易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR反應(yīng)不能正常進(jìn)行。5、引物3端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗。6、引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)，被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)，這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處。引物5端引入酶切位點(diǎn)得黏

49、性末端，隨意加入3個(gè)保護(hù)性堿基，但是要注意不要形成引物二聚體，而且以A或G開頭為好。7、引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的其它序列無(wú)明顯同源性。引物量：每條引物的濃度0.11umol或10100pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。8、引物酶切：除非產(chǎn)物非常特異，直接酶切PCR產(chǎn)物效果有時(shí)不是很好，還有一般PCR體系里過(guò)量的dNTPs會(huì)影響酶切效果。酶切后，可以用標(biāo)準(zhǔn)得乙醇沉淀法沉淀酶切產(chǎn)物，獲得高純度得酶切產(chǎn)物，也即是你的黏性目斷片斷供后邊得試驗(yàn)。說(shuō)出PCR產(chǎn)物與T載體連接的原理。TA克?。篢A克隆系統(tǒng)由Inv

50、itrogen公司（San Diego，CA）發(fā)展而來(lái)的商業(yè)性試劑盒，它用PCR產(chǎn)物的克隆和測(cè)序。其原理是利用Taq酶能夠在PCR產(chǎn)物的3末端加上一個(gè)非模板依賴的A，而T載體是一種帶有3T突出端的載體，在連接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR產(chǎn)物直接插入到質(zhì)粒載體的多克隆位點(diǎn)（MCS）中。TA克隆沒有方向性。Gateway方法進(jìn)行DNA重組(zhn z)的原理。Gateway的原理也是建立在噬菌體DNA定點(diǎn)(dn din)整合到細(xì)菌宿主基因組上。在噬菌體和細(xì)菌的整合因子（INF、Int）的作用下，lambda的attP位點(diǎn)和大腸桿菌基因組的attB位點(diǎn)可以發(fā)生定點(diǎn)重組，lambda噬菌體

51、DNA整合到大腸桿菌的基因組DNA中，兩側(cè)產(chǎn)生兩個(gè)新位點(diǎn)：attL和attR。這是一個(gè)可逆的過(guò)程，如果在一個(gè)噬菌體編碼蛋白Xis和IHF、Int的共同介導(dǎo)下這兩個(gè)新位點(diǎn)可以再次重組回復(fù)為attB和attP位點(diǎn)，噬菌體從細(xì)菌基因組上裂解下來(lái)。這一過(guò)程的方向是受控于兩個(gè)重要因素：存在的介導(dǎo)蛋白和重組位點(diǎn)。29、從制備(zhbi)的總RNA中分離出mRNA的方法？原理是什么？大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA的3端通常具有由20-30個(gè)腺苷酸組成的polyA尾巴，寡聚胸腺嘧啶脫氧 HYPERLINK /search?word=核糖&fr=qb_search_exp&ie=utf8 核糖核苷（OligoT）可以與

52、之配對(duì)結(jié)合，這就是提取mRNA最基本的原理。具體到實(shí)驗(yàn)手段上，現(xiàn)在磁珠法、纖維素柱層析法都有在用。磁珠法一般是用生物素標(biāo)記OligoT，親和素標(biāo)記磁珠（生物素和親和素間具有高度親和力）。實(shí)驗(yàn)時(shí)生物素標(biāo)記的OligoT與mRNA的polyA高效雜交形成復(fù)合體，此復(fù)合體又與標(biāo)有親和素的磁珠結(jié)合。用磁性分離架就可以將這堆復(fù)合物分離出來(lái)。最后用無(wú)RNase去離子水將mRNA從復(fù)合物中洗脫下來(lái)即可。寡聚dT纖維素柱層析法的大致流程：總RNA流經(jīng)寡聚dT纖維素柱時(shí)，在高鹽緩沖液中，帶polyA尾的mRNA被特異地結(jié)合在柱上。降低鹽濃度，mRNA被洗脫。一般過(guò)兩次柱后，就可得到較高純度的mRNA。實(shí)驗(yàn)操作用

53、含Amp的平板篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，為何會(huì)出現(xiàn)衛(wèi)星菌落。培養(yǎng)時(shí)間太長(zhǎng)了。乙醇沉淀DNA的基本原理。乙醇能夠消除核酸的水化層，使帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)暴露出來(lái)。Na之類的平衡離子能夠與這些帶電基團(tuán)結(jié)合，在沉淀形成部位降低多核苷酸鏈之間的排斥作用。因此只有在陽(yáng)離子的量足以中和暴露的磷酸殘基的電荷時(shí)才會(huì)發(fā)生乙醇沉淀。沉淀核酸時(shí)，加入NaAc有何作用？NaAc有助于降低DNA溶解度。溶菌酶的作用是什么？它是糖苷水解酶，能水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的-1,4糖苷鍵，因而具有溶菌的作用。當(dāng)溶液中pH小于8時(shí)，溶菌酶作用受到抑制。核酸分離時(shí)用到酚、氯仿、異戊醇各有何作用？抽提DNA去除蛋白質(zhì)時(shí)，怎樣使用酚與

54、氯仿較好？酞與氯仿是非極性分子，水是極性分子，當(dāng)?shù)鞍姿芤号c酚或氯仿混合時(shí)，蛋白質(zhì)分子之間的水分子就被酚或氯仿擠去，使蛋白失去水合狀態(tài)而變性。經(jīng)過(guò)離心，變性蛋白質(zhì)的密度比水的密度為大，因而與水相分離，沉淀(chndin)在水相下面，從而與溶解在水相中的DNA分開。而酚與氯仿有機(jī)溶劑比重更大，保留在最下層。作為表面變性的酚與氯仿，在去除蛋白質(zhì)的作用中，各有利弊，酚的變性作用大，但酚與水相有一定程度的互溶，大約1015的水溶解在酚相中，因而損失了這部分水相中的DNA，而氯仿的變性作用不如酚效果好，但氯仿與水不相混溶，不會(huì)帶走DNA。所以在抽提過(guò)程中，混合使用酚與氯仿效果最好。經(jīng)酚第一次抽提后的水相

55、中有殘留的酚，由于酚與氯仿是互溶的，可用氯仿第二次變性蛋白質(zhì)，此時(shí)一起將酚帶走。也可以在第二次抽提時(shí)，將酚與氯仿混合（1:1）使用。 如果(rgu)酚被氧化后，對(duì)分離核酸會(huì)有何影響？實(shí)驗(yàn)室提取質(zhì)粒DNA通常會(huì)出現(xiàn)幾種帶型，說(shuō)出他們(t men)電泳行為的差別。提完的質(zhì)粒有三種形式存在：超螺旋閉合環(huán)質(zhì)粒，開口的閉合壞質(zhì)粒，線性質(zhì)粒。三者遷移速率不一樣，所以會(huì)出現(xiàn)三條帶。根據(jù)你質(zhì)粒提取的好壞，出現(xiàn)一到三條帶都屬于正常。你做個(gè)酶切檢測(cè)，如果酶切充分，只有兩條帶，目的條帶和載體的條帶。不過(guò)一般情況都會(huì)有一條超螺旋質(zhì)粒的條帶亮度更高，濃度更大，可能與marker相比你的質(zhì)粒會(huì)比理論的小一點(diǎn)，這也是很正常

56、的。核酸提取中，為何用75乙醇洗滌沉淀？說(shuō)出可以沉淀DNA的試劑。說(shuō)出RNaseA、RNaseH用途。RNase H是一種 HYPERLINK /view/28832.htm 核糖核酸內(nèi)切酶，它能夠特異性地水解雜交到DNA鏈上的RNA磷酸二酯鍵，故能分解RNA/DNA雜交體系中的RNA鏈。該酶不能消化單鏈或雙鏈DNA。RNase A是一種被詳細(xì)研究和具有廣泛應(yīng)用的 HYPERLINK /view/2487227.htm 核酸內(nèi)切酶。RNase A 對(duì)RNA有 HYPERLINK /view/721442.htm 水解作用，但對(duì)DNA則不起作用。RNase A在C端和U端殘基處專一地催化RNA的

57、核糖部分3-與5 -磷酸二酯鍵的裂開，形成具有 2,3-環(huán)磷酸衍生物寡聚核苷酸。如 pG-pG-pC-pA-pG 被切割產(chǎn)生pG-pG-pCp 和 A-pG?？梢杂脕?lái)去除DNA制品中的污染RNA。 它們的合成目前資料還比較少。堿烈解法提質(zhì)粒時(shí)，使用的溶液，即含NaOH和SDS的溶液，有何作用？溶液 50mM 葡萄糖 / 10mM EDTA / 25mM Tris-HCl，pH=8.0葡萄糖增稠，使懸浮后的大腸桿菌不會(huì)快速沉積到管子的底部；EDTA 抑制DNase的活性。這一步溶液中還可以加入RNase，不受EDTA影響，并且可以在后續(xù)步驟中被除去溶液 0.2M NaOH / 1% SDS破細(xì)胞

58、的主要是堿，而不是SDS，所以才叫堿法抽提。堿烈解法(ji f)提質(zhì)粒時(shí)，使用的溶液，即含KAc的溶液(rngy)，有何作用？溶液(rngy) 3M 醋酸鉀 / 2M 醋酸這一步的K置換了SDS（十二烷基磺酸鈉）中的Na，得到PDS（十二烷基磺酸鉀）沉淀；SDS易與蛋白質(zhì)結(jié)合，平均兩個(gè)氨基酸上結(jié)合一個(gè)SDS分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)也沉淀了，同時(shí)基因組DNA也被PDS共沉淀。何為限制性內(nèi)切酶的星活性，產(chǎn)生原因有哪些？所謂星活性又稱Star活性。是指由于反應(yīng)條件不同而產(chǎn)生的切斷與原來(lái)認(rèn)識(shí)序列不同的位點(diǎn)的現(xiàn)象，也就是說(shuō)產(chǎn)生Star活性后，不但可以切斷特異性的識(shí)別位點(diǎn)，

59、還可以切斷非特異性的位點(diǎn)。產(chǎn)生Star活性的結(jié)果是酶切條帶增多。所以說(shuō)Star活性與粘端變平端沒關(guān)系。另外，Star活性除了與酶本身的性質(zhì)有關(guān)外，與甘油濃度，pH值及離子濃度有關(guān)。一旦出現(xiàn)底物DNA不好切斷，需要增加酶量或延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間時(shí)，如果使用的是易產(chǎn)生StaR活性的限制酶切，一般優(yōu)先考慮增加酶量，而不是延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，換句話說(shuō)，延長(zhǎng)時(shí)間比增加酶量更易產(chǎn)生Star活性。另外，實(shí)際上幾乎所有的限制性內(nèi)切酶都可能產(chǎn)生Star活性。但目前Star活性對(duì)實(shí)際實(shí)驗(yàn)室操作過(guò)程中的影響并不太大，可以先不考慮。星活性是特異性的 HYPERLINK /view/48578.htm 限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)的 HYPER

60、LINK /view/758.htm DNA裂解，可以從這些酶的最適顯著不同的反應(yīng)條件下發(fā)生的松弛或改動(dòng)的。其結(jié)果通常是在非規(guī)范的識(shí)別位點(diǎn)裂解，或有時(shí)完全喪失的特異性。這可能會(huì)導(dǎo)致星活性的差異包括低 HYPERLINK /view/905056.htm 離子強(qiáng)度， HYPERLINK /view/23974.htm pH值高，和高（ 5%體積/體積） HYPERLINK /view/833.htm 甘油的濃度。因?yàn)樯虡I(yè)的限制性內(nèi)切酶在一個(gè)緩沖器中，通常提供含有大量的甘油（50%v / v是典型的），也就是說(shuō)稀釋的酶溶液不足可導(dǎo)致星活性;此問(wèn)題最經(jīng)常出現(xiàn)在雙重或多重消化。使用限制性內(nèi)切酶做雙酶切