紅細胞計數(shù)血紅蛋白測定的原理課件

1、目的要求1.掌握：紅細胞計數(shù)、氰化高鐵血紅蛋白測定的原理、方法、質量控制、參考值、方法學平價及臨床意義 ； 紅細胞形態(tài)。2.了解：血紅蛋白測定其他方法 。重點 :紅細胞計數(shù)、血紅蛋白測定的原理、血片 紅細胞形態(tài)、難點:紅細胞檢驗的形態(tài)、質控。目的要求一、概 述1.紅細胞的生成骨髓造血干細胞-紅系祖細胞-原紅細胞-早幼-中幼-晚幼-網(wǎng)織紅細胞-成熟紅細胞Epo每個原紅細胞可以生成16個紅細胞。48h無分裂能力2.紅細胞的破壞健康人紅細胞平均壽命120天。紅細胞主要因衰老而消亡，破壞主要在單核-巨噬細胞系統(tǒng)，器官主要是在脾臟和肝臟；其次為骨髓和其他部位。二、紅細胞計數(shù)紅細胞計數(shù)（red blood

2、 cell count,RBC）即測定單位體積內紅細胞數(shù)量。是血液一般檢驗的基本項目，常作為診斷貧血和紅細胞增多的主要指標之一。測定方法顯微鏡計數(shù)法血液分析儀法（一）顯微鏡計數(shù)法【檢測原理】 采用等滲稀釋液將血標本稀釋一定倍數(shù)，滴入血細胞計數(shù)室中，顯微鏡下計數(shù)一定區(qū)域內紅細胞數(shù)，經(jīng)換算得每升血液中紅細胞數(shù)量?！酒鞑摹?微量吸管，采血針，小試管，計數(shù)板，蓋片，棉球，顯微鏡?！驹噭考t細胞稀釋液：任選一種1.Hayem稀釋液：氯化鈉1.0g、硫酸鈉（含10個結晶水）5.0g，氯化高汞0.5g，蒸餾水加至200mL，過濾后使用。氯化鈉-調節(jié)滲透濃度 硫酸鈉-提高比重防止紅細胞粘連 氯化高汞-防腐劑，

3、有毒2.檸檬酸鹽甲醛鹽水氯化鈉 0.6g 調節(jié)滲透壓檸檬酸鈉 1.0g 調節(jié)滲透壓，抗凝36%甲醛 1ml 防腐蒸餾水加至100ml，過濾2次后使用。3.生理鹽水或加1%甲醛的生理鹽水【操作】1.中號試管（15100mm）加等滲稀釋液2ml；2.毛細血管采末梢血10l加入上述稀釋液，立即搖勻（稀釋200倍）；3.充池，靜置2min后以低倍鏡計數(shù)中間大方格內四角和中央5個中方格內的紅細胞數(shù)。未染色紅細胞呈雙凹盤形，有黃綠色折光。紅細胞計數(shù)2ml稀釋液 充分混勻 10ul血液 充池、靜止 鏡下計數(shù) 3mm WBC WBC WBC WBC 1mm紅細胞數(shù)/L=5個中方格內紅細胞5 10 200 10

4、6/L 或 = 1012/L5個中方格內紅細胞數(shù)100【報告方式】【計算】RBC（/L）= . 1012/L【方法學評價】 1手工顯微鏡法 2血液分析儀法 為目前主要臨床檢驗細胞計數(shù)方法變異系數(shù)（coefficient of variation, CV ）小。【質量控制】1手工法 誤差來源包括：標本、操作、器材、固有誤差（計數(shù)域誤差）2儀器法 嚴格按操作規(guī)程；定期作室內和室間質控。 【參考值】男性 : （4.00-5.50） 1012/L 女性 : （3.50-5.00） 1012/L新生兒:（6.00-7.00） 1012/L【校正】WBC100109/L時，需校正：實際紅細胞/L=所數(shù)細胞

5、總數(shù)白細胞數(shù)（正常紅細胞：白細胞=750：1, 可忽略白細胞的影響）【注意事項】1.采血及搖勻迅速，防止血液凝固；2.器械應防酸防堿且干燥；3.充池要搖勻；4.計數(shù)時，應識別酵母及白細胞。三、血紅蛋白測定（一）血紅蛋白的結構血紅蛋白結構： 由珠蛋白和亞鐵血紅素結合組成。Hb色素部分：亞鐵血紅素蛋白質部分：珠蛋白Fe 2+原卟啉空間結構：每個血紅蛋白有4條珠蛋白肽鏈，每條肽鏈包裹1個亞鐵血紅素，形成具有四級空間結構的四聚體。 【分類】（每個珠蛋白分子含兩條 鏈和兩條非 鏈） 正常人：HbA （ 22） 占90% 成人主要血紅蛋白； HbA2（ 22 ） 占2%-3% 成人次要血紅蛋白 HbF （

6、 22 ） 占2%以下 胎兒主要血紅蛋白生理情況下，99%Hb的鐵呈Fe2+狀態(tài)，稱為還原血紅蛋白，亞鐵狀態(tài)的Hb與氧結合稱氧合血紅蛋白（HbO2). 1%Hb的鐵呈Fe3+狀態(tài)，稱為高鐵血紅蛋白（Hi）。Hb的合成受激素的調節(jié)：Epo和雄激素。注意事項：1. 如-鏈或-鏈合成障礙，使三種正常血紅蛋白比例異常，即各型地中海貧血；如多肽鏈發(fā)生氨基酸置換、丟失、加長，稱為血紅蛋白病 。 2.病理情況下可出現(xiàn)硫化血紅蛋白（SHb）。（二）血紅蛋白衍生物及其吸收光譜 1.氧合血紅蛋白（oxyhemoglobin, HbO2）:Hb與O2結合時形成。2.還原血紅蛋白（reduced hemoglobin

7、, Hbred）：未與O2結合時的Hb。3.高鐵血紅蛋白（hemiglo -bin, Hi）或正鐵血紅蛋白（methemoglobin, Mhb）: Fe 2+被氧化成Fe 3+。4.碳氧血紅蛋白（HbCO）、硫化血紅蛋白（SHb）：與O2結合的配位鍵被CO、S等占據(jù)。5.氰化高鐵血紅蛋白（HiCN）：Hi與CN-結合而成。波峰540nm，波谷504nm。正常情況下，血液中血紅蛋白主要是HbO2和Hbred，以及少量HbCO和Hi。（三）血紅蛋白測定方法手工法：HiCN法SLS-Hb法AHD575法HiN3法血液分析儀法1、氰化高鐵血紅蛋白（HiCN）測定法1）原理：在Hb轉化液中，除SHb外

8、，Hb被高鐵氰化鉀氧化成高鐵血紅蛋白，再與CN-結合，生成穩(wěn)定的棕紅色氰化高鐵血紅蛋白（HiCN），吸收峰為540nm，毫摩爾消光系數(shù)為44 Lmmol-1 cm -1 。因此根據(jù)標本的吸光度，即可求得血紅蛋白總量（不含SHb）。2）器材：分光光度計、移液管、微量吸管、試管等。3）試劑：血紅蛋白轉化液（文齊液）成分如下高鐵氰化鉀：使Hb轉化成Hi氰化鉀：使Hi形成HiCN無水磷酸二氫鉀：防止混濁，調節(jié)pH值TritonX100:非離子型表面活性劑，加速溶血，縮短轉化時間，防止因血漿蛋白改變引起的混濁。4）操作：a. 取指血20ul，加到5ml血紅蛋白轉化液中，混勻，靜置5分鐘。 b. 用分光光

9、度計比色。波長540nm，以空白轉化液調零，測定吸光度“A”。5）計算標準狀態(tài)下的計算Hb（g/L）=A 251A 367.7其中，A為測得的吸光度，64458為Hb的分子量，251為測定時血液稀釋倍數(shù)，44為HiCN的毫摩爾吸光系數(shù)，1000為換算成摩爾吸光系數(shù)。64458441000非標準狀態(tài)下的計算：求換算常數(shù)K 標準液標定Hb液濃度 (標準值)K= - 本室測定標準液的“A” (測定值)標本Hb g/L = 標本測定值A 舉例：用不同濃度的Hb的標準品：50，100，150，200g/L測得的吸光度分別為0.13, 0.27, 0.41和0.54 。則K值為K= = =371.75若測

10、定管吸光度為0.32，則測定管Hb濃度為Hb（g/L）=0.32371.75=118.96HbA50+100+150+2000.13+0.27+0.41+0.546)結果報告Hb g/L7)參考值成年男性：120-160 g/L 成年女性：110-150 g/L新生兒： 170-200 g/L貧血分級： 輕度：男性120g/L,女性110g/L 中度： 90g/L 重點： 60g/L 極重度：30109/L，重癥黃疸，嚴重的血管內溶血等。2、方法學評價1）HiCN法：由國際血液學標準化委員會（ICSH）推薦，并經(jīng)WHO確認為血紅蛋白測定的參考方法。優(yōu)點：操作簡單，結果穩(wěn)定可靠，試劑容易保存 能

11、測定除SHb以外的所有血紅蛋白，并易 于建立質控。缺點：不能測定SHb。 對HbCO轉化太慢，需要100分鐘。 高丙種球蛋白血癥，變性Hb血癥，高白細胞的血可出現(xiàn)混濁，按15g/L（pH7.27.5）甚至50g/L（pH6.76.9）加入氯化鈉可防止，高濃度有核RBC引起的混濁不能防止。 KCN為劇毒，需妥善保存。2)SDS-Hb（十二烷基硫酸鈉）法優(yōu)點：試劑無毒，結果準確，重復性好缺點：SDS純度難保證； 依賴HiCN法，間接得到結果； 試劑可破壞WBC，不能與WBC同時共用標本進行血細胞計數(shù)的自動分析。3）疊氮高鐵血紅蛋白法（HiN3）優(yōu)點：準確度、精密度較高缺點：試劑仍有毒性，HbCO轉

12、化慢本法與HiCN法相似4）堿羥血紅蛋白法（AHD575）優(yōu)點：試劑簡易，不含毒性，呈色穩(wěn)定，準確性與精確性較高。缺點:波峰位于575nm處，溶液中堿性較高，不適用于自動檢測，HbF不能轉化。5）CTAB法優(yōu)點：溶血性強且不破壞白細胞，適于血液分析儀檢測。缺點：精密度、準確度略低。沙利法為傳統(tǒng)血紅蛋白測定法，已淘汰。6）血液分析儀法優(yōu)點：簡便、快速、多項。缺點：儀器型號不同，使用的溶血劑不同，形成的Hb衍生物不同。 某些溶血劑形成的Hb衍生物穩(wěn)定性較差，因此要嚴格控制溶血劑的量及作用時間。 對具有抗溶血劑作用的疾?。ǜ尾　⒌蜕匦载氀?，溶血不完全而影響結果。 有些溶血劑內雖加入了KCN，但其

13、衍生物并非HiCN，而是氰化血紅蛋白，儀器需經(jīng)過HiCN標準液校正后，才能進行Hb測定。（四）Hb與RBC測定的臨床意義參考值 RBC Hb男性 （4.05.5）1012/L 120160g/L女性 （3.55.0）1012/L 110150g/L新生兒 （6.07.0）1012/L 170200g/L70歲男性 94.2122.2g/L70歲女性 86.5111.8g/L（1）生理變化1）年齡與性別新生兒6個月2歲嬰兒 ，生長發(fā)育迅速，血容量 造血原料不足，引起生理性貧血。老年人 ：對營養(yǎng)攝取、利用和造血功能減退，RBC、Hb比中青年人低。男性女性：雄激素2）精神因素：情緒波動，使腎上腺素增

14、多，RBC、Hb 3）氣壓：氣壓低（高山居民），紅細胞代償性4）長期多次獻血者，紅細胞代償5）妊娠期 ：妊娠期血容量明顯 ，引起血液稀釋，Hb常在100g/L以下，生理性貧血。（2）病理變化1）RBC和Hb增多指單位容積血液中紅細胞數(shù)值及血紅蛋白含量高于正常值高限。 男性 Hb 170g/L 女性 Hb 160g/L RBC 6.01012/L RBC 5.51012/L相對性增多：由于大量失水、血漿量下降而使血液濃縮所致，如嘔吐、嚴重腹瀉、大面積燒傷等。絕對性增多：見于慢性心肺疾病，真性紅細胞增多癥。2）紅細胞和Hb減少：貧血骨髓造血功能低下：如再障、白血病、惡性腫瘤造血原料缺乏：如缺鐵、葉

15、酸、VB12等；紅細胞破壞增加：如各種溶血性貧血；紅細胞丟失過多：如急、慢性失血；促紅細胞生成素減低癥（腎性貧血）Hb測定與紅細胞計數(shù)的臨床意義相似，但對貧血程度判斷的準確性優(yōu)于紅細胞計數(shù)。Hb含量與RBC數(shù)量的關系 紅細胞與血紅蛋白的增減不一定成比例，如大細胞性貧血患者的RBC往往較Hb減少顯著；而小細胞性貧血患者則相反。正色素性貧血：RBC、Hb成正比減少低色素性貧血：RBC Hb四、紅細胞的形態(tài)檢查概述各種原因可作用于紅細胞生理進程的不同階段，從而引起紅細胞相應的病理變化，導致某些類型貧血的紅細胞發(fā)生形態(tài)學變化，這些變化包括紅細胞的大小、形狀、染色性質和內含物的異常，因此RBC形態(tài)檢查常

16、作為追蹤貧血線索的一項重要檢查內容，對貧血的診斷和鑒別診斷有重要的臨床價值?！痉椒霸u價】1.顯微鏡分析法：是儀器法校準的參考方法；2.計算機圖像分析：能快速自動以正常紅細胞形態(tài)為參考，按紅細胞形態(tài)特征做出類型和比例統(tǒng)計分析，可用于RBC形態(tài)變化相關疾病的輔助診斷；3.血液分析儀法：不能直接提供紅細胞形態(tài)改變的確切信息，需用鏡檢血涂片核實。注意：如果血片制作不良和染色不佳，常使細胞鑒別發(fā)生困難，甚至導致錯誤結論。【質量控制】 選擇細胞分布均勻的區(qū)域：紅細胞堆積棒狀穿錢狀：細胞過于密集。但如果在血涂片較薄的區(qū)域出現(xiàn)，可能是紅細胞外附有異型球蛋白注意完整的檢查順序。減少人為因素影響。人為原因造成紅

17、細胞形態(tài)異常1.涂片不當：出現(xiàn)棘形紅細胞、鄒縮RBC、紅細胞緡錢狀形成等。2.使用非疏水性玻片：口型RBC。3.染色不當：嗜多色RBC。4.抗凝劑EDTA過高，或長時間放置血液：鋸齒狀RBC。5.涂片干燥過慢，或由于固定液中混有少許水分:面包圈形RBC。6.涂片末端附近：長軸方向一致的假橢圓形RBC。（一）正常紅細胞形態(tài)（染色后）紅細胞直徑6.77.7um,平均直徑為7.2um。桔紅色，向心性淡染，中心蒼白，淡染區(qū)約為紅細胞直徑的1/3。意義：正常人、再障、白血病、急性失血可見正常形態(tài)。（二）大小異常1. 紅細胞大小不均（anisocytosis） 紅細胞直徑相差一倍以上，常見于各種重癥增 生

18、性貧血，尤其見于重癥巨幼細胞貧血。2.小紅細胞（microcyte） 直徑小于6um者稱為小紅細胞，正常人偶見。提示血紅蛋白合成障礙，可能由于缺鐵和珠蛋白代謝異常所致。見于缺鐵性貧血和珠蛋白生成障礙性貧血。常伴有中心淺染區(qū)擴大。3.大紅細胞（macrocyte） 直徑大于10um，見于溶血性貧血（由于不全成熟的紅細胞增多）及巨幼紅細胞性貧血（是由于葉酸或維生素B12缺乏，DNA合成障礙，血紅蛋白合成過剩，脫核后形成大紅細胞或巨紅細胞）。紅細胞大小不一紅細胞大小不一4.巨紅細胞（megalocyte）直徑大于15um，見于巨幼細胞貧血。細胞中心淺染區(qū)消失。 小細胞低色素多（缺鐵、地貧） 單純小紅

19、細胞microcytemegalocyte溶貧、急性失血、巨幼貧Macrocyte巨幼貧anisocytosis低色素性貧血、溶貧、失貧、巨幼貧等增生性貧血。（三）形態(tài)異常1. 球形紅細胞（spherocyte） 球形紅細胞直徑小于正常，厚度增加常大于2um，無中心淺染區(qū)，似球形。常見于遺傳性球形紅細胞增多癥、自身免疫性溶血性貧血、新生兒溶血病及紅細胞酶缺陷所致溶血性貧血等。2.橢圓形紅細胞（elliptocyte）橢圓形紅細胞呈卵圓形、桿形，長度可大于寬度3-4倍，是細胞膜缺陷所致，在遺傳形橢圓形紅細胞增多癥病人血涂片中此細胞可在25%以上。 3.靶形紅細胞（target cell） 中心區(qū)

20、和細胞周緣染色深，其間為不染色的蒼白環(huán)。是由于H b含量不足而且分布不均。見于低色素性貧血，尤其是珠蛋白生成障礙性貧血。4.棘形紅細胞（acanthocyte） 紅細胞表面有刺狀突起，大小不一、形態(tài)各異。 常見于遺傳性脂蛋白缺乏癥及脾切除、酒精中毒性肝病、尿毒癥。5.鐮形紅細胞（sickle cell） 紅細胞形如鐮刀狀，由于紅細胞內存在HbS所致。主要見于鐮形紅細胞性貧血。6.口形紅細胞（stomatocyte） 紅細胞中心蒼白區(qū)呈扁平狀，形如一個微張開的魚口。DIC及酒精中毒時可見少量此類細胞。7.裂片細胞（schistocyte） 為紅細胞破壞后的碎片，大小不一，形態(tài)各異，邊緣不規(guī)則。在微血管病性溶血性貧血如DIC時此類細胞增多。8.紅細胞形態(tài)不齊（poikilocytosis）: 紅細胞形態(tài)發(fā)生多種明顯該變，可呈梨形、淚滴形、新月形、三角形等。最常見于巨幼貧。（四）染色異常1. 低色素性（hypochromatic）紅細胞：血紅