環(huán)境生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課件

1、環(huán)境生物學(xué)實(shí)驗(yàn)授課教師：高雪峰種子發(fā)芽毒性實(shí)驗(yàn)四季小白菜（小麥）種子在不同濃度銅、鉻溶液中萌發(fā)率的變化一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?通過本實(shí)驗(yàn)掌握測定環(huán)境污染對植物有效性的方法，了解測定污染物對種子發(fā)芽產(chǎn)生毒性的基本原理，掌握實(shí)驗(yàn)操作程序和步驟，能夠獨(dú)立進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算和處理，并對結(jié)果進(jìn)行分析。二、實(shí)驗(yàn)原理 植物種子在適宜的條件（水分，溫度和氧氣等）下，吸水膨脹萌發(fā)，在各種酶的催化作用下，發(fā)生一系列的生理、生化反應(yīng)。但是當(dāng)有污染物存在時(shí)，污染物會抑制一些酶的活性，從而使種子萌發(fā)受到影響，破壞發(fā)芽過程，因此，通過測定種子發(fā)芽情況，可以預(yù)測和評價(jià)環(huán)境污染物對植物的潛在毒性和生物有效性。 三、實(shí)驗(yàn)材料及藥品： 培養(yǎng)

2、皿；發(fā)芽床；濾紙 ；小白菜種子（小麥）；溫度計(jì)、 標(biāo)簽紙 ；分析純氯化銅；分析純重鉻酸鉀；蒸餾水。四、實(shí)驗(yàn)步驟（89人/組）1.取5只培養(yǎng)皿，鋪上2層濾紙，分別編號1、2、3、4、5。2.用蒸餾水將氯化銅原液（500mg/l）逐級稀釋100mg/l、 200mg/l、300mg/l和500mg/l，將重鉻酸鉀原液（1200mg/l）逐級稀釋200mg/l、500mg/l、800mg/l和1200mg/l。分別獲得4種不同濃度的污染液。3.向1、2、3、4號培養(yǎng)皿分別加入10ml（15ml）的不同濃度的氯化銅（或重鉻酸鉀）染液（浸濕濾紙即可），5號培養(yǎng)皿加入等體積的蒸餾水作為對照。4.挑選籽粒飽

3、滿、大小一致的小白菜種子，在每只培養(yǎng)皿的濾紙上，均勻放置50粒小白菜種子。 5.將5只培養(yǎng)皿置于25、相對濕度75%、光照條件下的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；每天各實(shí)驗(yàn)組、對照組補(bǔ)充5ml蒸餾水，以保持濾紙的濕潤。6.發(fā)芽勢與發(fā)芽率的計(jì)算，在第3天（對照組發(fā)芽良好時(shí)）測定記錄小白菜種子發(fā)芽情況。 發(fā)芽勢（%）=規(guī)定天數(shù)內(nèi)已發(fā)芽的種子粒數(shù)/供作發(fā)芽的種子總粒數(shù)100發(fā)芽率(%) =全部發(fā)芽的種子粒數(shù)/供作發(fā)芽的種子總粒數(shù)100%發(fā)芽勢與發(fā)芽率的區(qū)別種子的發(fā)芽率是指在足夠的時(shí)間內(nèi)，正常發(fā)芽的種子占全部供試種子的百分?jǐn)?shù)。發(fā)芽勢則是在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)，發(fā)芽種子占供試種子的百分?jǐn)?shù)。發(fā)芽勢能表示種子發(fā)芽能力的強(qiáng)弱和種子

4、發(fā)芽的整齊度。 所以，發(fā)芽勢是鑒定種子生活力的重要指標(biāo)。五、注意事項(xiàng)：1.種子發(fā)芽后應(yīng)具備的特征：幼芽長度不短于種子長度的1/2，為具有發(fā)芽能力的種子，以此標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行觀察，計(jì)數(shù)。2.發(fā)芽勢與發(fā)芽率的計(jì)算，于第3天測定記錄小白菜種子發(fā)芽的情況，將感染霉菌的種子要及時(shí)除去。六、實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求1.根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，在實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)到實(shí)驗(yàn)室記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。報(bào)告要求準(zhǔn)確、美觀。2.實(shí)驗(yàn)報(bào)告：種子名稱，每種濃度處理的種子數(shù)，培養(yǎng)條件污染物的每種濃度處理制組和對照組的發(fā)芽率和發(fā)芽勢的平均值。3.對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析討論。 溫度脅迫對生物（植物）的影響 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵饬x 不良環(huán)境（如高溫或低溫）對生物的正常生存會產(chǎn)生不良的

5、影響。植物在遭遇高溫、低溫時(shí)，原生質(zhì)膜的半透性消失，對物質(zhì)的透性發(fā)生改變，有機(jī)質(zhì)或鹽類從細(xì)胞中滲出，進(jìn)入周圍環(huán)境中。通過電導(dǎo)度的測量和糖的顯色反應(yīng)，可以測知物質(zhì)的外滲程度，以了解植物受害的情況，并可對不同植物對高、低溫的耐性程度做出判斷。二、儀器以及材料 電導(dǎo)儀，分光光度儀，冰箱，恒溫培養(yǎng)箱，移液管，試管，燒杯，電熱板，葉片，蒽酮試劑，葡萄糖三、實(shí)驗(yàn)方法及步驟1、樣品的制備 將植物葉片清洗干凈，再用蒸餾水漂洗干凈后，用打孔器打取葉片。然后以10片為一組，共三組，分別放在盛有20ml蒸餾水的燒杯中，將葉片浸入蒸餾水中，分別放在 45溫箱和0的冰箱中培養(yǎng).2、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液稀釋成

6、濃度為0、5、10、20、40、60、80、100ug/ml。在波長625nm處測其吸光度。得出吸光度 糖濃度曲線。3、樣品的測定 培養(yǎng)2h后取出，達(dá)到室溫后（可用常溫水浴）。（1）電導(dǎo)度的測定：用電導(dǎo)儀分別測量每一小杯中溶液的電導(dǎo)度，記錄。（2）蒽酮反應(yīng)：另吸取溶液1mL于干凈的試管中，再加蒽酮試劑5mL，搖勻，于沸水中煮15min，將試管取出冷卻，將試管中溶液用分光光度儀在波長625nm處測定，并從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得濾液中的糖含量。同時(shí)以蒸餾水作同樣測定進(jìn)行比較。處理電導(dǎo)度蒽酮反應(yīng)450 2室溫 水中細(xì)菌總數(shù)的檢驗(yàn) 平板菌落計(jì)數(shù)法 一、目的要求 1.學(xué)習(xí)水中細(xì)菌總數(shù)測定的方法； 2.了解水源水

7、的平板菌落計(jì)數(shù)的原則。 二、原理 平板菌落計(jì)數(shù)法是將待測樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋之后，其中的微生物充分分散成單個(gè)細(xì)胞，取一定量的稀釋液接種到平板上，經(jīng)培養(yǎng)，由每個(gè)單細(xì)胞生長繁殖形成肉眼可見的菌落，即一個(gè)單菌落代表樣品中一個(gè)單細(xì)胞。據(jù)形成的菌落數(shù)計(jì)數(shù)，換算出水中細(xì)菌總數(shù)（近似值）。 優(yōu)點(diǎn)：傳統(tǒng)計(jì)數(shù)方法，對設(shè)備要求不高。是能測出樣品中的活菌數(shù)。此法常用于某些成品和生物制品檢定以及食品、水源的污染程度的檢定等。 缺點(diǎn)：手續(xù)較繁，而且測定值常受各種因素的影響。 三、操作步驟 1、水樣的采?。?）自來水：將水龍頭洗凈，并開放水龍頭使水流2min后，以滅菌的三角瓶接取水樣，以待分析。（2）待測水樣（池水、河水或湖水

8、）：應(yīng)取距水面10-15cm的深層水樣.2、細(xì)菌總數(shù)的培養(yǎng)（1）自來水：用滅菌吸管吸取lml水樣，注入滅菌培養(yǎng)皿中(共做兩皿) 分別傾注約15mL己溶化并冷卻到45左右的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，并立即在桌上搖勻，使水樣與培養(yǎng)基充分混勻。待培養(yǎng)基凝固后，倒置于37 溫箱中，培養(yǎng)24h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。 兩個(gè)平板的平均菌落數(shù)即為lml自來水水樣的細(xì)菌總數(shù)。 (2) 池水、河水或湖水等 稀釋水樣:取3支滅菌的空試管（1號、2號、3號）分別加入9ml滅菌水。取1ml水樣注入1號管內(nèi)，搖勻，再自1號管取1ml移至2號管滅菌水內(nèi)，以此類推，則稀釋度分別為10-1 、10-2 、10-3，每個(gè)稀釋度做2皿。

9、稀釋倍數(shù)要看水樣污濁程度而定以培養(yǎng)后平皿的菌落數(shù)在30300個(gè)之間的稀釋度最為合適，若3個(gè)稀釋度的菌數(shù)均多到無法計(jì)數(shù)或少到無法計(jì)數(shù)，則需繼續(xù)稀釋或減小稀釋倍數(shù)。 自最后3個(gè)稀釋度的試管中各用滅菌吸管吸取lml稀釋水，注入滅菌培養(yǎng)皿中。每一稀釋度做兩個(gè)平皿。 分別傾注約15mL己溶化并冷卻到45左右的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，并立即在桌上搖勻。 培養(yǎng)基凝固后，倒置于37溫箱中，培養(yǎng)24h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。 3、計(jì)數(shù)： 培養(yǎng)24小時(shí)后，取出培養(yǎng)皿，算出同一稀釋度2個(gè)平皿上的菌落平均數(shù)，并按下列公式進(jìn)行計(jì)算： 每毫升中總活菌數(shù)=同一稀釋度2次重復(fù)的菌落平均數(shù)稀釋倍數(shù)注意事項(xiàng):1.樣品充分混勻，稀釋時(shí)一個(gè)

10、稀釋度要換一支無菌移液管（放菌液時(shí)，吸管尖不要碰到液面） 2.由于細(xì)菌易吸附玻璃器皿表面，菌液加入后應(yīng)盡快倒培養(yǎng)基，立即搖勻；3.傾注平板時(shí)的培養(yǎng)基溫度冷卻至45左右。4.計(jì)數(shù)時(shí)，30300個(gè)菌落的稀釋度計(jì)算每毫升的菌數(shù)最為合適。菌落平均數(shù)稀釋倍數(shù)即為細(xì)菌總數(shù)。5.同一稀釋度的三個(gè)重復(fù)的菌數(shù)不能相差很懸殊6.國家生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB5749-85： 細(xì)菌數(shù)（個(gè)/ml）100 總大腸菌群（個(gè)L） 3 魚類急性毒理實(shí)驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?通過本實(shí)驗(yàn)，熟悉和掌握魚類急性毒性試驗(yàn)的設(shè)計(jì)、條件、操作步驟，以及試驗(yàn)結(jié)果的計(jì)算、分析和報(bào)告等全過程。 二、實(shí)驗(yàn)原理 魚類對水環(huán)境的變化十分靈敏，運(yùn)用毒理實(shí)驗(yàn)方法，觀

11、察魚類在含有化學(xué)污染物的水環(huán)境中的反應(yīng)，可以比較不同化學(xué)物質(zhì)的毒性高低。魚類毒性實(shí)驗(yàn)方法可分為靜態(tài)方法和動態(tài)方法兩大類。靜態(tài)實(shí)驗(yàn)方法操作簡單，不需要特殊設(shè)備，適宜于受試化學(xué)物在水中相對穩(wěn)定，在實(shí)驗(yàn)過程中耗氧量較低的短期實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)介紹靜態(tài)實(shí)驗(yàn)方法。 三、實(shí)驗(yàn)器材 2000或1000毫升燒杯、重金屬鹽（重鉻酸鉀K2Cr2O7）、小金魚(觀賞魚紅裙)、小漁網(wǎng)。四、實(shí)驗(yàn)步驟 1、實(shí)驗(yàn)液的配置： 用質(zhì)量濃度為4000mg/L的K2Cr2O7原液，配置成2680 、180、280、400、600mg/L（200、245、300、367、450mg/L）5個(gè)不同濃度梯度的藥液900ml、分別裝入1000m

12、l的燒杯中。 （所選擇的濃度應(yīng)包括有使實(shí)驗(yàn)魚在24h內(nèi)死亡的濃度，以及96h內(nèi)不發(fā)生中毒的濃度） 2、實(shí)驗(yàn)魚的放入： 先把藥液與水在燒杯內(nèi)均勻混合后，再放入實(shí)驗(yàn)魚（禁止先放入實(shí)驗(yàn)魚后往實(shí)驗(yàn)缸中加受試藥液，以免實(shí)驗(yàn)魚接觸到不均勻的高濃度的藥液而提前死亡). 實(shí)驗(yàn)魚必須健康，實(shí)驗(yàn)前應(yīng)在實(shí)驗(yàn)條件下馴養(yǎng)，馴養(yǎng)期間每天投餌一次、換水12次。實(shí)驗(yàn)前一天停止投餌，但96h以上的實(shí)驗(yàn)魚每天應(yīng)給予少量不影響水質(zhì)的餌料。實(shí)驗(yàn)前4天要求馴養(yǎng)缸中魚最好不出現(xiàn)死亡，即使有死亡，也不得超過10%，否則不能用于正式實(shí)驗(yàn)。 3、結(jié)果的觀察 實(shí)驗(yàn)開始后3h進(jìn)行連續(xù)觀察并做好記錄，3h后可做6h、12h、24h、48h的詳細(xì)觀察

13、記錄（實(shí)驗(yàn)至少進(jìn)行24h，一般96h）。實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)有特殊變化應(yīng)隨時(shí)記錄（包括魚的死亡率和由于中毒而引起的魚的生化、生理以及形態(tài)學(xué)、組織學(xué)的變化，如：不愛動、食欲不好、呼吸微弱以及身體不平衡等癥狀） 魚死亡的判斷方法： 當(dāng)魚中毒停止呼吸以后，用小鑷子夾魚尾柄部，5min內(nèi)不出現(xiàn)反應(yīng)可判定為死亡。死亡魚必須移出實(shí)驗(yàn)缸，以免影響水質(zhì)。實(shí)驗(yàn)過程應(yīng)記錄不同時(shí)間段各組魚的死亡數(shù)。注意事項(xiàng)： 實(shí)驗(yàn)水的溫度、pH值、溶解氧、硬度和水量的合理與否，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響較大，必須嚴(yán)格控制，一般淡水魚的水質(zhì)要求如下：.水溫：實(shí)驗(yàn)中應(yīng)保持魚類原來適應(yīng)的環(huán)境，溫水魚2028，冷水魚1218，在同一實(shí)驗(yàn)中，溫度的波動范圍不

14、要超過2。.pH：6.78.5 .溶解氧： 4.0mg/L.水量：每克魚體重供水0.5 L以上。 通常在軟水中進(jìn)行?？刹捎米匀唤绲慕?、河、湖水，如果用自來水，則必須進(jìn)行人工曝氣或放置3天以上脫氯。 化學(xué)物質(zhì)急性毒性分級 依據(jù)LC50值的大小，可以將化學(xué)物質(zhì)的急性毒性分為劇毒、高毒、中等毒、低毒和微毒5級。 魚類急性毒性實(shí)驗(yàn)毒性分級標(biāo)準(zhǔn) 魚起始LC50（mg/L）11100100100010001000010000毒性分級劇毒高毒中等毒低毒微毒（無毒半致死濃度的計(jì)算 在水生生物急性毒性試驗(yàn)中，半數(shù)致死濃度（LC50）常用來表示化學(xué)物質(zhì)或工業(yè)廢水對水生生物的急性毒性。計(jì)算方法有多種，這里介紹常用的

15、直線內(nèi)插法。 所謂直線內(nèi)插法，即是根據(jù)兩個(gè)或多個(gè)試驗(yàn)濃度組的動物死亡百分?jǐn)?shù)作一濃度死亡反應(yīng)線，內(nèi)插所要求的一個(gè)數(shù)值。因此，用直線內(nèi)插法求半數(shù)致死濃度時(shí)，在試驗(yàn)設(shè)置的濃度組中必須至少存在這樣兩個(gè)濃度：一個(gè)要能引起50%以上的試驗(yàn)動物死亡，另一個(gè)出現(xiàn)的死亡率則要低于50% 用直線內(nèi)插法求LC50時(shí)，在半對數(shù)坐標(biāo)紙上，以對數(shù)軸表示試驗(yàn)溶液的濃度，算術(shù)坐標(biāo)表示試驗(yàn)動物的死亡百分?jǐn)?shù)，繪出與試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)相應(yīng)的各點(diǎn)。將死亡率50%上下的兩點(diǎn)做一直線，再自所作直線與50%死亡線的交點(diǎn)作一垂直于縱軸的垂線，該垂線與縱軸的交點(diǎn)即為所求的半致死濃度。如無半對數(shù)紙，也可用方格紙代替，但應(yīng)先將濃度作對數(shù)轉(zhuǎn)換，然后以縱軸

16、表示之。垂線與縱軸的交點(diǎn)為LC50的對數(shù)，故需查反對數(shù)表才得半致死濃度。Cr質(zhì)量濃度為450mgL時(shí)，6h后金魚沿盆壁集中分布，約10h后少量魚側(cè)臥不動，當(dāng)受到刺激時(shí)，向前狂游一陣，然后又側(cè)臥靜止下來，13 h后開始出現(xiàn)死亡，24 h后死亡率達(dá)100；質(zhì)量濃度為367 mgL時(shí)，15h后出現(xiàn)死亡，24h后死亡率為60，72h后達(dá)100；當(dāng)質(zhì)量濃度為200mgL時(shí)，48h內(nèi)未出現(xiàn)不良反應(yīng)，72h后死亡率為10，96h后達(dá)50。配置 5000mgL重鉻酸鉀原液1升 編寫報(bào)告 在實(shí)驗(yàn)報(bào)告中應(yīng)包括：試驗(yàn)名稱、目的、試驗(yàn)原理、試驗(yàn)的準(zhǔn)確起止日期，還有如下幾項(xiàng)：（1）試驗(yàn)魚的種名、來源、體重、體長、健康和

17、馴化 狀況。（2）受試物質(zhì)名稱、來源物化性質(zhì)和保存方法。（3）實(shí)驗(yàn)用水的來源、物化性質(zhì)和實(shí)驗(yàn)前的處理等。（4）實(shí)驗(yàn)溶液的濃度與配置方法、實(shí)驗(yàn)溫度。（5）實(shí)驗(yàn)條件，如容器形式、實(shí)驗(yàn)液的體積與深度、 受試生物數(shù)目及負(fù)荷率。（6）實(shí)驗(yàn)開始后24h、48h、72h、96h時(shí)的LC50值，及 其毒性分級。實(shí)驗(yàn)五 空氣中SO2對植物的影響 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?通過SO2對植物葉片葉綠素a,b 含量比例的影響，認(rèn)識環(huán)境污染對植物的影響。實(shí)驗(yàn)原理SO2是大氣中主要的污染物，植物對SO2是很敏感的，SO2隨空氣進(jìn)入葉內(nèi)，當(dāng)空氣中SO2超過一定值時(shí)，葉子就會表現(xiàn)出一定的傷害癥狀，其中之一是葉綠素a、b含量比例發(fā)生變化，因此

18、，測定植物葉綠素a、b含量比例關(guān)系的變化即可檢測大氣污染程度。葉綠素a、b對不同波長輻射的最大吸收峰分別位于663nm和645nm，同時(shí)在該波長的葉綠素a、b的比吸收系數(shù)K為已知，我們可根據(jù)Lamber-Beer定律，列出濃度C與光密度D之間的關(guān)系： D663=82.04Ca+9.27Cb(1) D645=16.75Ca+45.6Cb(2) (1)(2)式中的D663、D645為葉綠素溶液在波長為663nm和645nm的光密度，Ca、Cb為葉綠素的濃度，單位為每升毫克數(shù)。82.04、9.27為葉綠素a、b在波長663nm時(shí)的比吸收系數(shù)，16.75、45.6為為葉綠素a、b在波長645nm時(shí)的比吸收系數(shù). 解方程(1)(2)： Ca = 12.7 D663 2.69D645（3） Cb = 22.9 D645 4.68D663（4） 因此，用丙酮（新鮮材料用無水丙酮）提取葉綠素后分別在663nm和645nm處測定提取液的光密度后可求得葉綠素的濃度Ca、Cb，便可計(jì)算其比例。實(shí)驗(yàn)儀器及材料 植